Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpä on edelleen yksi yleisimmistä kuolinsyistä maailmassa ja löytää uusia hoitoja edelleen suuri haaste. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että muunnettuja muotoja pektiiniä, monimutkainen polysakkaridi läsnä ensisijainen kasvisolun seinään, hallussaan syövän vastaisia ​​ominaisuuksia. Kuitenkin vaikutusmekanismi muutettu pektiiniä ja reitit mukana ovat epäselviä. Tässä osoitamme, että sitruspektiiniä modifioitu lämpökäsittely indusoi solukuolemaa HepG2 ja A549-soluja. Indusoituneen solukuolema eroaa klassisesta apoptoosin koska ei DNA pilkkominen havaittu. Lisäksi Z-VAD-fmk yleiseurooppalaisen kaspaasiestäjä, ei vaikuttanut havaittu solukuoleman HepG2-soluissa, mutta näytti olevan osittain suojaava A549-soluissa, mikä osoittaa, että lämpö-modifioitu Sitruspektiininä saattaa aiheuttaa kaspaasin riippumaton solukuolemaa. Nostamalla runsaus fosfatidyylietanoliamiini konjugoitua Light Chain 3 (LC3) proteiinia ja lasku p62-proteiinin runsauden havaittiin molemmissa solutyypeissä kun inkuboidaan lämmön modifioidun Sitruspektiininä. Nämä tulokset osoittavat aktivoitumista autophagy. Tietääksemme tämä on ensimmäinen kerta, kun autophagy on paljastanut soluja inkuboitiin, kun läsnä on modifioitu muoto pektiiniä. Tämä autophagy aktivointi näyttää olevan suojaava, ainakin A549-soluja, koska sen inhibitio 3-metyyliadeniini lisäsi havaitun modifioitu pektiini-indusoidun sytotoksisuuden. Tämä tutkimus vahvistaa mahdollisen modifioidun pektiini parantaa kemoterapeuttisen syövän hoitomuotoja.

Citation: Lecleren L, Fransolet M, Cote F, Cambier P, Arnould T, Van Cutsem P, et ai. (2015) Heat-Modified Citrus pektiiniä indusoi apoptoosia-Like Cell Death and Autophagy HepG2 ja A549 syöpäsoluja. PLoS ONE 10 (3): e0115831. doi: 10,1371 /journal.pone.0115831

Academic Editor: Daolin Tang, University of Pittsburgh, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 11 elokuu 2014; Hyväksytty: 02 joulukuu 2014; Julkaistu: 20 maaliskuu 2015

Copyright: © 2015 Leclere et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoittajat: L. Leclère oli vastaanottajaa FRIA apurahan (Fonds pour la muodostumista à la Recherche dans l’Industrie et dans l’Agriculture, Bryssel, Belgia) . Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistelua käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä on yksi johtavista kuolinsyistä maailmassa. Vaikka laaja valikoima terapeuttisia lähestymistapoja, syöpä ei voida helposti parantaa, ja monia syöpätyyppejä edelleen alhainen kovettumisnopeus. Vaikka välttämättömiä hoitoon, kemoterapiaa ja sädehoitoa ovat myös lähteitä monia sivuvaikutuksia, ja leikkaus voi joskus huomaamatta etäpesäkkeitä. Nämä ovat syitä, miksi uusien hoitomuotojen kehittämiseen parantaa olemassa olevia hoitoja on suuri haaste. Luonnolliset yhdisteet ja phytochemicals ovat viime aikoina saavuttaneet paljon kiinnostusta niiden kyky muokata signalointireittien osallisina syövän leviämisen ja etäpesäkkeiden tai niiden suojaava potentiaali sädehoidossa, kuten tarkistaa Hazra [1].

Pektiinit ovat runsaat ja monimutkaisia komponentit ensisijaisen kasvisolun seinään, ja ovat hyvin tunnettuja ravintokuitua. Pektiini polysakkaridit ovat homogalacturonan (HG), substituoitu galacturonans, rhamnogalacturonan-I (RG-I) ja rhamnogalacturonan-II (RG-II). HG on polymeeri, α-1,4-kytketty-D-galakturonihappoa, ja HG tähteet voivat olla metyyli-esteröity C-6 karboksyyli- tai asetyloitu O-2 tai O-3, riippuen pektiiniä lähde. Selkäranka HG on kovalenttisesti silloitettu RG-I ja RG-II. RG-I on haarautunut polymeeri, jolla on pääketjussa disakkaridi (α-1,4-D-GalA- α-1,2-LRha) toistaa, jossa Rha tähteet voidaan korvata β-1,4-galaktaani, haaroittunut Arabinaanin ja /tai arabinogalaktaania sivuketjuja. Rakenne RG-II on erittäin monimutkainen: sivuketjuissa on kiinnitetty selkärangan HG, ja nämä monimutkaiset sivuketjut koostuvat 12 erilaista glukosylfosfatidyl tähteiden yhteydessä toisiinsa ainakin 22 eri glykosidisidoksiin [2,3].

Useat in vitro -tutkimukset ovat osoittaneet, että erilaiset muunnetut pektiiniä on antituumoriominaisuuksia (katsaus, katso [4]). RG-I alueella okra pektiiniä vähentää proliferaatiota ja indusoi apoptoosia melanoomasoluissa [5], ja pektiiniä oligosakkaridit myös apoptoosin Myelomasoluista [6]. Jackson

et al

osoittivat, että eri pirstoutuminen protokollat ​​pektiiniä voi johtaa eroihin pektiiniä apoptoosia indusoivaa aktiivisuutta, ja että hajanainen pektiiniä on sytotoksinen vaikutus androgeeniriippuvaisissa ja riippumattaman syöpäsolujen. Lisäksi nämä kirjoittajat osoittivat, että pH-modifioitu sitruspektiiniä oli vähän tai ei lainkaan apoptoottista aktiivisuutta [7].

In vivo

, on osoitettu, että angelan, pektiiniä johdettu polysakkaridi, voi estää melanooma solujen kasvua ja etäpesäkkeitä, ja angelan on myös raportoitu olevan immunomodulaattori, joka parantaa immuunijärjestelmän toimintaa B-solujen, makrofagien ja luonnollisten tappajasolujen [8]. Suun kautta liukoisen pektiiniä fragmenttien estää niiden kasvun ja etäpesäkkeiden siirrettyjen hiirissä [9,10], ja se on osoitettu, että modifioitu sitruspektiiniä estää niiden kasvun paksusuolen syövän ja maksan etäpesäkkeiden [11]. Kuitenkin mekanismeja, joilla modifioitu pektiini aikaan nämä vaikutukset eivät ole tiedossa.

Tämän tutkimuksen tarkoituksena on kuvata sytotoksisia vaikutuksia lämpöä hajanainen sitruspektiiniä (HFCP) kahdella kasvainsolulinjoja: HepG2-soluja ihmisen maksasyöpä ja A549-solut ihmisen keuhkokarsinooma. Me raportoimme että lämpöä hajaantunut Sitruspektiininä indusoi apoptoottista kaltainen solukuoleman joka on osittain kaspaasi-riippumaton ja aktivoi autophagy näissä kahdessa solulinjassa.

Materiaalit ja menetelmät

fraktiointi Sitruspektiininä by lämpökäsittely

Heat-hajanainen sitruspektiiniä (HFCP) saatiin menetelmällä, ovat kuvanneet Jackson

et ai

[7]. Liuos, jossa oli 0,1% sitruspektiiniä (Sigma P9135, joka koostuu pääasiassa homopolygalacturonic happo) kahdesti tislattuun veteen, kuumennettiin 60 min 123 ° C: ssa ja paineessa 17,2-21,7 psi. Sitten liuos jäädytettiin -80 ° C: ssa ja lyofilisoitiin. Kuiva materiaali säilytettiin 4 ° C: ssa. Uusia ratkaisuja viljelyväliaineessa valmistettiin juuri ennen lisäämistä soluihin inkubointia.

Soluviljely ja pektiiniä inkubaation

HepG2, A549, MCF-7 ja MCF10A solut saatiin American Type Culture Collection HepG2-soluissa ja MCF-7-soluja viljeltiin DMEM-väliaineessa (Gibco 31825-023) ja A549-soluja MEM-väliaineessa (Gibco 41090-028). Rutiini kulttuuri, media oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Gibco 10270), ja soluja pidettiin 37 ° C: ssa ilmakehässä, jossa oli 95% ilmaa ja 5% CO

2. MCF10A-soluja viljeltiin DMEM /F12-väliaineessa (Gibco 11320-074), joka sisälsi 5% hevosen seerumia (Gibco 16050-122), 20 ug /ml EGF: ää, 0,5 ug /ml hydrokortisonia, 10 ug /ml insuliinia ja 100 ng /ml kolera toksiini. Hoitoon, solujen annettiin kiinnittyä 24 h ymppäyksen jälkeen. Väliaine poistettiin ja solut pestiin kahdesti PBS: llä (Lonza BE17-516F) ja sijoitettiin väliaineessa ilman seerumia, joka sisälsi seuraavat: 3 mg /ml suodattamalla steriloitua HFCP, 3 mg /ml suodattamalla steriloitua sitruspektiiniä 3 mg /ml tai 50 uM etoposidi, käytettiin positiivisena kontrollina. Negatiiviset kontrollit olivat soluja inkuboitiin väliaineessa yksin. Joissakin kokeissa, kun on osoitettu, staurosporiini (Sigma S4400), pan-kaspaasi-inhibiittori z-VAD-fmk (BD Pharmingen 550377), 3-metyyliadeniini (Sigma M9281) tai bafilomysiini (Sigma B1793) lisättiin samaan aikaan kuin etoposidi, HFCP tai pektiiniä.

solunelinkykyisyysmääritys

HepG2-solut ympättiin 50 000 solua /kuoppa, ja A549-soluja 30 000 solua /kuoppa 24-kuoppalevyille ennen hoitoja 6, 24 tai 48 h. MTT (3- [4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli] -2,5- difenyylitetratsoliumbromidia, Sigma M2128) liuos valmistettiin pitoisuudessa 2,5 mg /ml fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen, ja 500 ui kuoppaa kohti . 2 h kuluttua 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 ilmakehässä, keskipitkällä ja MTT-liuosta poistettiin, ennen kuin lisättiin lyysipuskuria. Optinen tiheys mitattiin 1 tunnin kuluttua aallonpituudella 570 nm käyttämällä mikrolevyn spektrofotometriä (Bio-Rad x Mark Microplate spektrofotometrillä) ja

Microplate Manager 6

ohjelmisto.

Cell sytotoksisuusmääritys

HepG2-solut ympättiin 50 000 solua /kuoppa, ja A549-soluja 30 000 solua /kuoppa 24-kuoppalevyille ennen inkubaatiota 24 tai 48 tuntia. Kunkin hyvin, laktaattidehydrogenaasin aktiivisuus mitattiin supernatantista, on irrotettuja soluja, ja tarttuneet solut hajotuksen jälkeen PBS: ssä, joka sisälsi 10% Triton X-100 (Merck 9036-19-5). Laktaattidehydrogenaasi aktiivisuutta havaittiin kolorimetrisellä määrityksellä käyttäen sytotoksisuuden kit (Roche 11644 793 001) ja mikrolevyspektrofotometrillä. Sytotoksisuus prosentit laskettiin suhde määrän LDH läsnä supernatantissa ja irrottaa solujen kokonaismäärästä LDH, kuten seuraavalla kaavalla: 100 * (a + b) /(a ​​+ b + c), jossa a = supernatantin LDH; b = irrotettuja soluja LDH; c = kiinnittyneitä soluja LDH.

DNA: n fragmentoituminen määrityksessä

HepG2-solut ympättiin 50 000 solua /kuoppa, ja A549-soluja 30 000 solua /kuoppa 24-kuoppalevyille ennen inkubointia 6, 24 tai 48 h. Solu kuoleman havaitsemiseksi ELISA: lla (Roche 11 544 675 001) suoritettiin valmistajan ohjeiden. Absorbanssi mitattiin käyttämällä spektrofotometriä 405 nm: ssä. Normalisointi proteiinin sisällön Sisarusten levyt määritettiin käyttämällä Pierce reagenssia suoritettiin.

kaspaasi-3-aktiivisuus

HepG2 ja A549-soluja ympättiin 600 000 solua /kuoppa 6-kuoppaisille levyille ennen hoitoja 24 tai 48 tuntia. Solut kerättiin jäillä PBS: ssä ja sentrifugoitiin 4 ° C: ssa 1000 x g 5 minuutin ajan. Solupelletit homogenoitiin hajotuspuskuria 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja liukoiset proteiinit kerättiin sentrifugoimalla 4 ° C: ssa. Näytteet valmistettiin, jolloin saatiin 20 ug proteiineja 100 ui tislattua vettä, johon lisättiin 50 ui reaktiopuskuria ja 1 ui Ac-DEVD-AFC substraatti lisättiin. Näytteitä inkuboitiin 37 ° C: ssa 60 min, ja fluoresenssia havaittiin 505 nm: ssä sen jälkeen, kun viritys 400 nm: ssä käyttäen Fluoroscan. Määritys kaspaasi-3-aktiivisuus suoritettiin Cosse

et ai

[12].

Western blot-analyysi

Solulysaatit valmistettiin lyysipuskurissa (40 mM Tris , pH 7,5, 150 mM KCI, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoriseoksen (Complete Roche Molecular Biochemicals, 1 tabletti 2 ml: ssa H

2O, lisätään 1: 25 laimennus ) ja fosfataasi-inhibiittorin puskuria (25 mM NAvó

3, 250 mM PNPP, 250 mM α-glyserofosfaatti ja 125 mM NaF, 1: 25-laimennos) mukainen Cosse

et ai

[12]. Elatusaine sentrifugoitiin ja pelletoitiin soluja lisättiin solulysaateista. Lysaatit sentrifugoitiin 12 000 x g 5 minuutin ajan, ja supernatantit kerättiin. Proteiinit (15 ug) denaturoitiin lisäämällä LDS-näytepuskuria (Invitrogen NP0007) ja kuumennettiin 70 ° C: ssa 10 min. Proteiinit eroteltiin 4-12%: NuPAGE (Invitrogen) geelillä ja siirrettiin matalan fluoresenssin (Millipore IPFL00010). Kalvot pidettiin 1 h Licor blokkausliuoksessa ja tutkittiin yön yli joko anti-kaspaasi-3 kanin vasta-ainetta (Cell Signaling # 9662S), joka tunnistaa täyspitkä ja katkaistun muotoja kaspaasi-3-laimennoksella 1/500 anti-PARP-hiiri-vasta-ainetta (BD Biosciences # 551024) laimennoksena 1/1000, anti-kaspaasi-8-hiiri-vasta-ainetta (Cell Signaling # 97465) laimennoksena 1/1000, hiiren anti-ubikitiini-vasta-ainetta ( LifeSensor VU101) laimennoksena 1/1000, anti-LC3 hiiren vasta-aineen (NanoTools 0260-100 /LC3-2G6) laimennoksena 1/600 tai anti-p62 hiiren vasta-aineen (AB Nova # H00008878-M03) on laimennus 1/500. Anti-ß-aktiini hiiren vasta-aineen (Sigma T5168) käytettiin laimennoksena 1/30 000 ß-aktiini immuno- latauskontrollina. Kaikki vasta-aineet laimennettiin Licor, joka sisälsi 0,1% Tween 20: tä (Sigma P1379). Membraanit huuhdottiin PBS: llä + 0,1% Tween 20 ja inkuboitiin fluorokromilla-konjugoidulla anti-hiiri tai anti-kani-vasta-aineita (BD Bioscience # 926-32221) laimennoksessa 1/10 000 1 tunnin ajan pimeässä huoneen lämpötilassa . Anti-ubikitiini merkintöjä, kalvot pestiin PBS: llä siirron jälkeen, kiinteä PBS: ssä, joka sisälsi 0,5% glutaraldehydiä (pH 7), ja huuhdeltiin kolme kertaa PBS: ssä ennen lukitusta. Kalvot huuhdottiin kerran PBS: llä + 0,1% Tween 20 ja kuivataan ennen skannataan ja analysoitiin Odyssey ohjelmistoa.

Immunofluoresenssikoe merkintöjä

HepG2-solut ympättiin 50 000 solua /kuoppa ja A549 solut 30 000 solua /kuoppa 24-kuoppaisille levyille 24 tuntia ennen inkubaatiota kanssa HFCP, pektiiniä tai etoposidi 24 tuntia. Inkuboinnin jälkeen solut kiinnitettiin ja permeabilisoitiin 10 minuuttia kylmällä liuoksella, jossa oli 80% metanolia ja 20% asetonia, huuhdeltiin kolme kertaa PBS-2% BSA: ta ja inkuboitiin 2 h primaarisilla vasta-aineilla. Ensisijainen vasta-aine LC3 värjäytymistä oli kanin anti-LC3 (L7543 Sigma) (1/250-laimennos), ja ensisijaisen vasta-aineen LAMP1 värjäytymistä hiiren anti-LAMP1 (H4A3 sai elokuussa Hildreth, Baltimore [13]). Solut pestiin kolme kertaa PBS-2% BSA: ta ja inkuboitiin sitten 1 h, sekundaarisia vasta-aineita. Alexa Fluor-488-konjugoitua anti-kani-IgG-vasta-aineen ja Alexa Fluor-568-konjugoitua anti-hiiri-IgG-vasta-ainetta (Molecular Probes) käytettiin 1/1000 laimennus. Kun oli kulunut 1 h inkuboinnin jälkeen solut huuhdeltiin kolme kertaa PBS: llä. Ydinvoiman merkintöjä, soluja inkuboitiin 30 min TOPRO-3 (Molecular Probes, laimealla. 1/80), kun läsnä oli 2 mg /ml RNaasia ja sitten huuhdeltiin kolme kertaa PBS: llä. Lopuksi peitelaseja asennetaan käyttäen Mowiol (Sigma, St. Louis, USA), ja solut havaittiin fluoresoivalla -konfokaalimikroskoopilla (Leica SP5).

Tulokset

Heat-hajanainen Sitruspektiininä indusoi HepG2 ja A549 solukuoleman

tutkia solukuolemaa indusoiva vaikutus HFCP kaksi syöpäsolun riviä, HepG2 ja A549-soluja, altistettiin eri ajanjaksoja HFCP. Konsentraatio 3 mg /ml valittiin testauksen jälkeen useita pitoisuuksia HFCP sekä solutyypeissä 24 h (S1 kuvio.). Etoposidi pitoisuutena 50 uM, käytettiin positiivisena kontrollina. Solun morfologia analysoitiin faasikontrastimikroskopiaan osoitti, että etoposidi aiheuttaa lievää kuolleisuus A549-soluja, kun taas HepG2 solut näyttivät olevan herkempiä tätä lääkettä. Lisäksi solukuoleman lisääntyi inkubaatioaika. HFCP pitoisuutena 3 mg /ml indusoi myös solukuoleman molemmissa solutyypeissä, mutta on huomattavasti enemmän kuin etoposidi, jonka pitoisuus on 50 uM; sen vaikutus oli myös ajasta riippuva. Toisaalta, modifioimaton pektiiniä pitoisuutena 3 mg /ml ei vaikuttanut solujen morfologia (S2 kuvio.).

MTT-määritykset suoritettiin sen jälkeen, kun 24 ja 48 h (Fig. 1A ja 1B). Tulokset osoittivat, että HFCP laski elinkelpoisuus HepG2 ja A549-solut sekä inkuboinnin aikoina, kun taas modifioimaton sitruspektiiniä ei. HFCP myrkyllisyys lisääntyi inkubaatioaika ja oli ankarampi kuin aiheuttama etoposidin, erityisesti HepG2-soluissa. Vahvista nämä tiedot, LDH: n vapautuminen määritettiin 24 ja 48 tuntia (Fig. 1 C ja 1 D), ja tulokset vahvistivat sytotoksista vaikutusta HFCP HepG2 ja A549-soluja, joissa voimakkaampi vaikutus entiseen.

HepG2-soluissa ja A549-soluja inkuboitiin pelkästään väliainetta (Ctl-), 50 uM etoposidi (Etop), 3 mg /ml lämmöllä hajanainen sitruspektiiniä (HFCP) tai 3 mg /ml sitruspektiiniä (pektiiniä). (A) ja (B) Solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-määrityksellä HepG2-soluissa (A) ja A549-solut (B), 24 ja 48 tuntia. (C) ja (D) Sytotoksisuus määritettiin HepG2-soluissa (C) ja A549-soluja (D) käyttäen LDH sytotoksisuuden havaitseminen kit 24 ja 48 tunnin inkuboinnin jälkeen. Tiedot ovat keinoja vähintään 3 rinnakkaisnäytettä päässä itsenäisestä kokeesta, kussakin suoritettiin kolmena rinnakkaisena +/- SD (n = 3-8). Tilastolliset analyysit olivat Hartley testi ja ANOVAII testi. P-arvot verrattuna vastaavaan ohjaus ovat *: P ≤ 0,05; **: P ≤ 0,01; ***: P ≤ 0,001.

Sen tutkimiseksi seerumin voisi olla suojaava vastaan ​​HFCP aiheuttamaa sytotoksisuutta, kuten havaitaan joidenkin muiden apoptoosin indusoijia, kuten etoposidi, HepG2-soluja inkuboitiin 24 h läsnä HFCP väliaineessa, jota oli täydennetty 10% vasikan sikiön seerumia Staurosporiini käytettiin positiivisena kontrollina, koska sen apoptoottinen vaikutus ei ole estää seerumia. Kuitenkin, sytotoksista vaikutusta HFCP ei inhiboinut lainkaan seerumin näissä olosuhteissa (S3 kuvassa.). Kokeita on myös tehty pienemmillä pitoisuuksilla pidemmän inkubointiajan (72 h) käyttäen HepG2-soluissa. Tämä suoritettiin ja ilman seerumia. Verrattuna 24 h inkubaation, 1 mg /ml HFCP indusoi tärkeämpi lasku elävien solujen lukumäärä sen jälkeen, kun 72 tunnin inkuboinnin jälkeen. Seerumin näytti olevan hieman suojaava jälkeen 72 h inkubaation, joka ei ollut sen jälkeen, kun 24 tunnin inkuboinnin (S4 kuvassa.).

vaikutus HFCP on myös testattu normaaleissa soluissa. Tämä suoritettiin suuria pitoisuuksia lyhyen inkubaatioajan (24 h) sekä pieninä pitoisuuksina pitkän inkubaatioajan (72 h), kanssa ja ilman seerumia. MCF-10A-soluja on käytetty näissä kokeissa. MCF10A solut ovat kuolemattomaksi, ei-transformoitu epiteelisolujen, joka on peräisin ihmisen fibrokystiset maitorauhaskudokseen. Niitä pidetään usein normaalina ohjaus syöpäsoluja. Tulokset osoittivat, että HFCP myös indusoi voimakkaan sytotoksisen vaikutuksen näissä soluissa. Nämä tulokset osoittavat, että HFCP ei todennäköisesti ole erityistä syöpäsolujen (S5 kuvio.). On huomattava, että etoposidi ja staurosporiinille olivat myös myrkyllisinä MCF10A soluja kuin HepG2-soluissa, kun etoposidia on nykyisin käytetään klinikoilla hoitoon useiden syöpätyyppien.

Fragmented Sitruspektiininä indusoi ei-kanoninen apoptoosin HepG2 ja A549

Sen tutkimiseksi, pektiiniä fragmentit indusoivat apoptoosia, analysoimme kaspaasi-3, jonka western blot -analyysillä. Aktivointi kaspaasi-3 tapahtui pilkkomalla, jolloin fragmentit 14 kDa: n ja 17 kDa: n, kuten havaitaan, kun soluja inkuboitiin etoposidin 24 tai 48 h (Fig. 2A). HepG2 solut inkuboitiin 24 tai 48 tunnin ajan HFCP näkyvissä eri pilkkoa kaspaasi-3 kuin soluja inkuboitiin etoposidia. 24 h, lisäjuovaa korkeampi näennäinen molekyylipaino noin 20 ja 60 kDa, ilmestyi; 48 h, pilkotun fragmentit kaspaasi-3 olivat vähemmän runsaasti soluja inkuboitiin HFCP, mutta 60-kDa: n muotoon kaspaasi-3-oli edelleen läsnä (Fig. 2A). 48 tunnin kuluttua inkubaation fragmentti 20 kDa esiintyi altistuneiden solujen yksistään alustassa, etoposidi ja fragmentoimattoman pektiiniä, todennäköisesti siksi, että nämä solut inkuboitiin ilman seerumia. Riippumatta, 60 kDa: n vyöhyke oli spesifinen HFCP-inkuboitiin solujen.

HepG2 ja A549-soluja inkuboitiin pelkästään väliainetta (Ctl-), 50 uM etoposidi (Etop), 3 mg /ml lämpöä hajanainen sitruspektiiniä (HFCP) tai 3 mg /ml sitruspektiiniä (pektiini), 24 ja 48 tuntia. (A) ja (B) Detection of aktivoitu kaspaasi-3 ja pilkottiin PARP HepG2 (A) ja A549-solut (B) Western blot -analyysillä. Immunodetektio α-tubuliinin käytettiin lastaus ohjaus. Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen. (C) ja (D) kaspaasi-3-aktiivisuus määritettiin käyttämällä spesifistä fluorogeenistä substraattia jälkeen 6, 24 ja 48 tunnin inkuboinnin HepG2-soluissa (C) ja A549-soluja (D). (E) ja (F) DNA: n fragmentoituminen määritettiin käyttämällä ELISA-detektioreagenssipakkaus jälkeen 6, 24 ja 48 tunnin inkuboinnin HepG2-soluissa (E) ja A549-solut (F). Tiedot ovat keinot kolmena rinnakkaisena, +/- SD (n = 3). Tiedot ovat keinot kolmena rinnakkaisena, +/- SD (n = 3). Tilastolliset analyysit olivat Hartley testi ja ANOVAII testi. P-arvot verrattuna vastaavaan ohjaus ovat *: P ≤ 0,05; **: P ≤ 0,01; ***: P ≤ 0,001.

Caspase pilkkominen ja muita bändejä oli myös havaittavissa A549-soluja jälkeen 24 tai 48 h HFCP hoidon (Fig. 2B). Lisäksi kaspaasi-3 pilkkoutumiskuviota A549 soluja inkuboitiin HFCP näkyvissä kiehtova kokeena 30-60 kDa (kuvio. 2B). Western blot analyysi PARP-proteiinissa (Fig. 2A ja 2B), joka on substraatti kaspaasi-3, osoitti pilkkoutumisen tämän proteiinin molemmissa solutyypeissä inkuboitiin HFCP tai etoposidi sekä ajanjaksoja. PARP pilkkominen havaittiin myös HepG2-soluissa inkuboitiin 48 h pelkällä väliaineella tai modifioimaton pektiiniä, vaikka pilkottu PARP oli vähemmän runsaasti näissä soluissa kuin HFCP-inkuboitiin soluja. A549-soluja inkuboitiin 24 tai 48 tuntia modifioimattoman pektiiniä osoitti tuskin havaittavaa määrää pilkotun PARP, todennäköisesti koska inkubaatio oli seerumittomassa väliaineessa.

määrittää, onko ei-tavanomainen lohkaisu kaspaasi-3: johti entsyymin aktivoitumisen, kaspaasi-3-aktiivisuus määritettiin HepG2 ja A549-soluja inkuboitiin 50 uM etoposidi, 3 mg /ml HFCP tai 3 mg /ml pektiiniä 8, 24 ja 48 h (Fig. 2C ja 2D). Tulokset osoittivat, että 24 tunnin kuluttua inkuboinnin, etoposidi voimakkaasti lisääntynyt kaspaasi-3-aktiivisuus HepG2-soluissa verrattuna kontrollisoluihin. HepG2 solut käsiteltiin HFCP osoitti myös korkeamman kaspaasi-3 toimintaa, joka kasvoi inkubaatioaika. A549-solut käsiteltiin etoposidia osoittivat pientä lisäystä kaspaasi-3-aktiivisuus verrattuna kontrolliin soluihin, vaikka tämä lisäys kaspaasi-3-aktiivisuus oli pienempi kuin on havaittu HepG2-soluissa, mutta oli silti tilastollisesti merkitsevä. HFCP altistuneet A549-solut näytetään myös kaspaasi-3 aktivaation että lisääntynyt.

Varmista, että HFCP indusoi apoptoosia, DNA pirstoutuminen, myöhäinen ominaisuus apoptoosin, arvioitiin. Vapaa nukleosomissa ELISA kit käytettiin mittaamaan vapauttamaan vapaa nukleosomeja DNA (Kuva. 2E ja F), ja tulokset osoittivat, että HepG2 ja A549-soluja käsiteltiin etoposidia osoitti DNA pirstoutuminen johtaa nukleosomi vapautumista. Että toisin kuin mitä oli havaittu etoposidin, DNA-fragmentaatiota ei havaittu soluissa, jotka oli inkuboitu HFCP, mikä osoittaa, että HepG2 ja A549-soluja käsiteltiin hajanainen pektiiniä ei näytä klassisen apoptoottisia ominaisuuksia. Tämä on sopusoinnussa ydin- morfologia jälkeen havaittu DAPI-värjäyksellä, joka ei näytä tyypillisiä apoptoottisen hajanainen ominaisuuksia, mutta näytti kutistunut.

elinkelpoisuuden määritys suoritettiin myös kaspaasi-3-puutteelliset MCF7-soluja (S6 kuvio. ). Tulokset osoittivat laskua elinkelpoisuuden näissä soluissa, kun niitä inkuboidaan kun läsnä on HFCP 24 tai 48 tuntia, mikä viittaa siihen, että kaspaasi-3-aktivaation ei tarvita indusoimaan solukuolemaa vasteena HFCP altistumista.

rooli caspases in HFCP-solukuolema

Sen tutkimiseksi, caspases on tärkeä rooli solukuoleman aiheuttama HFCP, soluja inkuboitiin HFCP läsnäollessa yleiseurooppalaisen kaspaasiestäjä (Z-VAD-mk) ja elinkelpoisuus ja sytotoksisuus HepG2 ja A549-soluja 24 tunnin kuluttua analysoitiin. Kaspaasi estäjä johti pieneen kasvuun elinkelpoisuus molemmissa solutyypeissä inkuboitiin etoposidia (Fig. 3A ja 3B), pieni lasku sytotoksisuuden HepG2-soluissa inkuboitu etoposidin ja vähentyneen merkittävästi sytotoksisuuden A549-soluja inkuboitiin etoposidia (kuvio . 3C ja 3D). Tämä joukko tiedot osoittavat, että Z-VAD-fmk pystyi estämään ainakin osittain solukuolemaa liittyy kaspaasiaktiivisuus. Kuitenkin, HepG2-soluja inkuboitiin HFCP läsnä ollessa Z-VAD-fmk ei osoittanut mitään lisäystä elinkelpoisuutta verrattuna soluihin, joita inkuboitiin HFCP yksin. Sytotoksisuuskoetta vahvisti nämä havainnot (Fig. 3A ja 3C), mikä osoittaa, että caspases ei vaikuttanut HepG2 indusoima solukuolema HFCP. Kuitenkin A549-soluja inkuboidaan HFCP ja kaspaasiestäjä oli suurempi elinkelpoisuutta ja paljon vähemmän sytotoksisuus kuin A459 soluja inkuboitiin HFCP yksin, mikä viittaa siihen, että kaspaasit voisi osallistua kuolemaan aiheuttama HFCP A549-soluissa (kuvio. 3B ja 3D).

HepG2 ja A549-soluja inkuboitiin pelkästään väliainetta (Ctl-), 50 uM etoposidi (Etop), 3 mg /ml lämmöllä hajanainen sitruspektiiniä (HFCP) tai 3 mg /ml sitruspektiiniä (pektiini) in läsnäolo tai puuttuminen Z-VAD-fmk, kaspaasi-inhibiittori, 20 uM. (A) ja (B) Solujen elinkelpoisuus ja HepG2-soluissa (A) ja A549-solut (B) mitattiin MTT-määrityksellä sen jälkeen, kun 24 tunnin inkuboinnin jälkeen. (C) ja (D) Sytotoksisuus määritettiin HepG2 (C) ja A549 (D) 24 tunnin inkuboinnin käyttäen LDH sytotoksisuuden havaitseminen pakki. Tiedot ovat keinot kolmena rinnakkaisena, +/- SD (n = 3). Tilastolliset analyysit olivat Hartley testi ja ANOVAII testi. P-arvot verrattuna vastaavaan ohjaus ovat *: P ≤ 0,05; **: P ≤ 0,01; ***: P ≤ 0,001. (E) ja (F) Western blot analyysi aktivoitu kaspaasi-3 ja halkaistut PARP suoritettiin 15 ug proteiinia HepG2-soluissa (E) ja A549-solut (F) sen jälkeen, kun 24 tunnin inkuboinnin jälkeen. Immunodetektio ß-aktiini käytettiin lastaus ohjaus. Tulokset edustavat kahden riippumattoman kokeen.

Yrittäessään ymmärtää ero vaikutus kaspaasiestäjä näiden kahden solutyypin, olemme varmistaneet, että Z-VAD-fmk ei inhiboivat kaspaasiaktiivisuus on pitoisuus käytetty tässä työssä (S1 taulukko). Itse asiassa tulokset osoittavat, että Z-VAD-fmk ei kokonaan estää etoposide- ja HFCP aiheuttama kaspaasin aktivaation. Me seuraavaksi analysoitiin kaspaasi-3-pilkkoutumisen ja PARP katkaisun puuttuessa tai läsnä ollessa Z-VAD-fmk Western blottauksella (kuvio. 3E ja 3F). Pirstoutuminen kaspaasi 3, joka havaittiin, kun solut altistettiin etoposidia ei enää havaittu, kun Z-VAD-fmk lisättiin, että tulos on yhdenmukaiset kirjallisuudessa [14]. Ei-kanoninen pirstoutumisen kaspaasi-3, joka havaittiin, kun HepG2 ja A549-soluja käsiteltiin HFCP myös inhiboi, ja kuvio kaspaasi-3 lohkaisu tuli verrattavissa havaitaan soluja altistetaan etoposidi läsnä ollessa Z-VAD -fmk, lukuun ottamatta 60-kDa: n vyöhykkeen, joka oli vielä havaittu molemmissa solutyypeissä inkuboitiin HFCP ja Z-VAD-fmk.

Nämä tiedot esiin mahdollisuuden, että ”ei-perinteisten” kaspaasi-3 pilkkominen havaitsimme voisi johtua muista caspases tai proteaasien ja siten ei ehkä liity klassisen apoptoosin. Todellakin, HFCP aiheuttama PARP-proteiinin pilkkominen vain osittain inhiboi Z-VAD-fmk, mikä osoittaa, että saattaa olla olemassa muita mekanismeja kuin kaspaasin aktivaatio, joka voi olla mukana. Lisäksi PARP-proteiinin pilkkominen indusoima etoposidin ei inhiboi Z-VAD-fmk: A549-soluissa, kun taas PARP-proteiinin pilkkominen indusoima HFCP käsittely inhiboitui täydellisesti.

Koska efektori kaspaasien aktivoidaan initiaattoria kaspaaseja kaspaasi-8 pilkkominen analysoitiin HepG2-soluissa western blot -analyysillä (kuvio. 4A). Tulos osoitti, että inkubointi HepG2-soluissa, kun läsnä on etoposidin tai HFCP teki tuottaa katkaistun fragmentteja kaspaasin 8 kanssa, jonka molekyylipaino on 43 ja 41 kDa (kuvio. 4A). Pilkkominen kaspaasi-8 altistuneiden solujen etoposidi on sopusoinnussa kirjallisuudessa [15], ja tämä katkaisu läsnäolo estää Z-VAD-fmk sekä etoposide- ja HFCP-altistetuissa soluissa (Fig. 4A). Lisäksi runsaasti täyspitkän prokaspaasi laski HepG2-soluissa inkuboitiin HFCP ja ei estetty lisäämällä Z-VAD-fmk. Näin ollen lasku runsaasti prokaspaasi-8 ei johtunut pilkkominen aiheuttaneet muut kaspaasit, koska Z-VAD-fmk ei estä sitä.

HepG2-soluja inkuboitiin pelkästään väliainetta (Ctl-), 50 uM etoposidi (Etop), 3 mg /ml lämmöllä hajanainen sitruspektiiniä (HFCP) tai 3 mg /ml sitruspektiiniä (pektiiniä) (A) Z-VAD-fmk: 20 uM, lisättiin tai ei soluihin inkuboinnin aikana. Havaitseminen aktivoidun kaspaasin 8 HepG2-soluissa Western blot-analyysi suoritettiin 15 ug proteiinia 24 h inkubaation jälkeen. Immuno- beta-aktiini käytettiin lastaus ohjaus. (B) Teoreettinen esimerkki α-fodrin katkaisun johtuvat kaspaasi (Casp), kalpaiini (calp) tai yhdistelmä kaspaasin ja kalpaiini (Casp + calp). (C) ja (D) HepG2 ja A549-soluja inkuboitiin pelkästään väliainetta (Ctl-), 50 uM etoposidi (Etop), 3 mg /ml lämmöllä hajanainen sitruspektiiniä (HFCP) tai 3 mg /ml sitruspektiiniä (pektiini) ja 20 uM Z-VAD-fmk, lisättiin tai ei soluihin 6 tai 24 tunnin inkuboinnin jälkeen. Havaitseminen α-fodrin HepG2 (C) ja A549 (D) solujen western blot-analyysi tehtiin 15 ug proteiinia.

kalpaiinien ovat proteaasit, jotka ovat myös aktivoituvat vasteena stressiin ja voivat osallistua solukuolemaan. Koska tutkimus α-fodrin pilkkoutumiskuviota voisi tiedottaa kaspaasi tai calpain aktivointi [16,17], pirstoutumista α-fodrin arvioitiin western blot analyysi HepG2 ja A549-soluja kuluttua 6 ja 24 tunnin inkubaation tai Z-VAD-fmk lisäksi, onko kalpaiinien aktivoitiin aikana HFCP solukuolema (Fig. 4 C, D). Teoreettinen pilkkoutumismalli α-fodrin on esitetty kuviossa. 4B. Täyspitkä α-fodrin on molekyylipaino 280 kDa; a-fodrin pilkkoo kaspaasi esittää nauhojen 150 ja 120 kDa, ja α-fodrin lohkaista kalpaiini esittää nauhojen 150 ja 145 kDa. Molemmissa solutyypeissä alttiina etoposidi tai HFCP (Fig. 4C ja D), täyspitkä proteiinin muoto on havaittu, kuten fragmentti 150 kDa. Tämä fragmentti voi edustaa pilkkominen α-fodrin klo yliherkkä sivuston alhainen endogeenisesti aktiivisten proteaasien [18]. 24 tunnin inkubaation jälkeen α-fodrin pilkkominen kuvio HFCP-inkuboitiin soluissa oli samanlainen kuin katkaisun kuvio etoposidi-inkuboitiin solujen, ja molemmat esitetään fragmentti 120 kDa. Koska 120-kDa α-fodrin tuote liittyy kaspaasi-3-aktivaation [19] ja muodostumista tämä fragmentti on estetty, kun Z-VAD-fmk, lisättiin molemmissa tapauksissa, tulokset osoittavat, että HFCP indusoi aktivointi joidenkin kaspaasien molemmissa solutyypeissä.

kaspaasi 8 aktivaation on osoitettu indusoituvan reseptori-riippumattomalla tavalla, koska proteasomin esto [20]. Koska ei-reseptori ei ole vielä raportoitu HFCP ja tutkia HFCP voisi aktivoida tällaisen reitin, proteiini ubikitinaa- arvioitiin western blot analyysi HepG2 ja A549-soluja. Varhainen nousu ubikitinaation havaittiin, kun soluja inkuboitiin, kun läsnä oli HFCP 6 tuntia, mutta ei elatusaineen läsnä ollessa yksin, etoposidi tai modifioimaton pektiiniä, joka oli vielä havaittavissa sen jälkeen, kun 24 tunnin inkuboinnin (Fig. 5A ja B).