Krooninen sairaus

tiivistelmä

Munasarjasyöpä G-proteiiniin kytketty reseptori 1 (OGR1) stimulaation solunulkoinen protonit aiheuttaa aktivoitumisen G-proteiinit ja sen jälkeen solun toimintoja. Kuitenkin fysiologiset ja patofysiologisia roolit OGR1 hengitysteiden vasteet edelleen suureksi osaksi tuntemattomia. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että OGR1-hiirillä ovat vastustuskykyisiä kardinaali ominaisuuksia astma, mukaan lukien hengitysteiden eosinofiliaa, hengitysteiden hyperreaktiivisuuden (AHR), ja pikarisolumuuntumiselle, yhdessä merkittävä inhibitio Th2-sytokiinien ja lgE: n tuottoa, on ovalbumiinimal- (OVA) aiheuttama astma malli. Henkitorvensisäisellä siirto villityypin hiiriä, OVA-pohjustetaan luuytimestä peräisin dendriittisolut (DC: t) alkaen OGR1-hiirissä kehittyi alempi AHR ja eosinofiliaa jälkeen OVA inhalaation verrattuna siirto näiden villin tyypin hiirillä. Muuttoliike OVA-pulssi DC: iden peribronchial imusolmukkeita myös inhiboi OGR1 puute hyväksymiseen kokeisiin. Läsnäolo funktionaalisen OGR1 DC: issä vahvistettiin ilmentymistä OGR1 mRNA ja OGR1 herkkä Ca

2+ vasteen. OVA-indusoidun ilmentymisen CCR7-, kypsä DC kemokiinireseptorin, ja muuttoliike vastaus CCR7- ligandien in vitro TranswellTM määrityksessä voitiin vähentää OGR1 puute. Olemme päätellä, että OGR1 DC: issä on kriittinen siirtyminen tyhjennys imusolmukkeet, mikä puolestaan ​​stimuloi Th2-fenotyypin muutoksen ja myöhemmin induktio hengitysteiden tulehduksen ja AHR.

Citation: Aoki H, Mogi C, Hisada T, Nakakura T, Kamide Y, Ichimonji I, et ai. (2013) Proton tunnistava munasarjasyöpä G proteiini-reseptori 1 dendriittisoluissa tarvitaan Hengitysteiden vasteet Hiiren Astma Model. PLoS ONE 8 (11): e79985. doi: 10,1371 /journal.pone.0079985

Editor: Bernhard Ryffel, Ranskan kansallisen tieteellisen tutkimuksen, Ranska

vastaanotettu: 20 elokuu 2013; Hyväksytty: 07 lokakuu 2013; Julkaistu: 11 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Aoki et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Grant-in-Aid tieteellisen tutkimuksen (B) (FO), Grant-in-tuki Haastava kartoittava tutkimus (FO), Grant-in-Aid tieteellisen tutkimuksen (C) (TI ja CM), ja Grant-in-Aid nuorten tutkijoiden (B) (HA) alkaen Japan Society for Promotion of Science (JSPS). Tätä työtä tuki myös osittain yhteisen tutkimusohjelman instituutin Molecular and Cellular asetuksen, Gunma University (12023) (TN). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Allerginen astma on Th2-lymfosyyttivälitteinen tulehduksellinen hengitysteiden sairaus, johon liittyy eosinofilia, lisääntynyt limaneritys pikarisolujen, ja hengitysteiden yliherkkyyttä (AHR) [1,2]. Nämä astmaattisia vasteita välittävät Th2-sytokiinien, mukaan lukien IL-4, IL-5 ja IL-13; IL-5: lla tärkeä rooli erilaistumiseen, rekrytointi ja aktivaatio eosinofiilien ja IL-4 ja IL-13 katsotaan kuljettamiseen liittyvä IgE synteesin B-soluista, pikarisolumuuntumiselle, ja AHR. Makrofagien ja neutrofiilien myös kerääntyä Tulehdusmuutosten. Dendriittisolut (DC) ovat antigeeniä esitteleviä soluja ja niillä on keskeinen rooli mukautuva ja synnynnäisen immuunivasteen. Kun antigeeni altistus epiteelin, DC vaeltavat tyhjennys imusolmukkeiden ja on osoitettu olevan tarpeen induktion Th2 vastauksia moniin antigeenejä stimuloimalla naiiveja T-soluja aikana herkistymistä sekä ylläpitää adaptiivista Th2-soluvasteen [1,2].

On tunnettua, että astma liittyy hengitysteiden happamoitumisen saavuttaen pH 5,2 ankarissa astmaattisia olosuhteissa [3-5], koska kertyminen tulehdussolujen vuonna peribronchial ja verisuonia tiloja, joissa stimulaatio Glykolyysivaiheen ja hengityselinten räjähtää saattaa laktaatin ja protonien [6]. Tällaisessa vakava happamassa pH, protoni tunnistava kapsaisiini-herkkä TRPV1 kanava ja /tai happo-tunnistava ionikanavia tuntohermoja on ehdotettu osallistuvan aloittamisen ja kehittämisen astmaoireita [4,7].

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että OGR1-perheen G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien (GPCR: t), mukaan lukien OGR1, G-proteiiniin kytketty receptor4 (GPR4), ja T-solujen kuolemaan liittyvän geenin 8 (TDAG8), joka oli aikaisemmin ehdotetaan reseptoreita lysolipidit, kuten sphingosylphosphorylcholine (SPC), tunnistavat solunulkoisen happamoitumisen kautta histidiinitähde [8-10], jolloin stimulaatio erilaisten solunsisäisten signalointireittien kautta heterotrimeeristen G-proteiinien G [11-13]. OGR1 on yhdessä fosfolipaasi C ja Ca

2+ signalointipolkujen ja välittää erilaisia ​​happamassa pH aiheuttaman toimia hengitysteiden sileän lihaksen soluissa [14-16] ja muiden solutyyppien [17,18]. Lisäksi OGR1 on osoitettu ilmaistaan ​​epiteelisoluissa [19], makrofageissa [20], ja neutrofiilien [21]. Siten OGR1 on mahdollisesti osallisena patogeneesissä astmaatikko vastauksia. Kuitenkin roolit OGR1 induktioon ratkaisevan vasteita hengitysteiden tulehdusta ei ole vielä raportoitu in vivo. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että OGR1-hiirillä ovat vastustuskykyisiä hengitysteiden eosinofiilinen tulehdusta ja AHR suhteessa villityypin (WT) hiirillä, ainakin osittain läpi muutoksen DC muuttoliike toimintaa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suuntaviivat Animal Care ja kokeilu komitean Gunma yliopistosta, ja kaikki eläimet kasvatettu in Institute of Animal Experience Research of Gunma yliopistosta. Protokolla hyväksyttiin Animal Care ja kokeilu komitea Gunma University (Luvan numero: 11-019). Kaikki Leikkaus suoritettiin natrium- pentobarbitaalianestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

Hiiret

Olemme hiljattain luotu OGR1 puutosta C57BL /6-hiirten [22]. Nainen hiiriä kohdennetusti häiriöitä OGR1 (

OGR1

– /-

hiiret) on takaisinristeytettiin varten kymmenen sukupolven päälle BALB /c-geneettinen tausta. BALB /c

OGR1

– /-

hiiriä ja niiden littermates (

OGR1

+ /+

tai WT) käytettiin 5-6 vk iässä. Hiiriä pidettiin erityisissä taudinaiheuttajista vapaissa olosuhteissa ja säilytetään OVA-dieetin.

Altistuminen ja hengitysteiden Challenge

OGR1

– /-

ja

OGR1

+ /+

(tai WT) hiiret sijoitettiin seuraaviin kahteen ryhmään: PBS /PBS-ryhmässä tai kontrolliryhmään, vatsaonteloon herkistyminen PBS: llä ja hengitysteiden haaste PBS, ja OVA herkistyminen /haaste ryhmä, vatsaonteloon herkistyminen OVA ja hengitysteiden haaste OVA. Altistuminen ja haaste OVA suoritettiin kuvatulla [23]. Lyhyesti, hiiret herkistettiin injektiona 10 ug OVA: lla (Grade V) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), yhdessä 1 mg alumiinihydroksidia (Alu-Gel-S, SERVA, Heidelberg, Saksa), jota käytetään adjuvanttia 0,2 ml, päivinä 0 ja 14. Hiiret myöhemmin haastoi hengitysteiden kautta hengitettynä altistumiseen aerosoleille OVA (1% PBS: ssä) 20 minuutin vuorokausina 28, 29, ja 30. päivänä 32, hengitystiereaktioita arvioitiin.

AHR

AHR mitattiin sekä välillisen noninvasive ja suora invasiivisia menetelmiä hiirillä 48 tunnin kuluttua viimeisen OVA haaste. Epäsuorassa invasiivisen menetelmän [24], reaktiivisuus metakoliinille arvioitiin koko kehon plethysmograph (Buxco Electronics, Inc., Troy, NY). Lyhyesti, suolaliuosta tai metakoliinin antoivat aerosoli tuloaukon kammion 3 min. Lukemat aloitettiin 3 minuutin ajan ja jatkettiin 10 minuutin ajan. Peak arvot 5 min keskimäärin PENH (Penh) määritettiin. Penh määritellään arvioinnin muutoksia muodon ilmavirtauskuviota alus saapuu koko kehon virtaus plethysmograph eläimenä hengittää. Tiedot ilmaistaan ​​prosentuaalinen muutos lähtötasosta saatu hengittämällä suolaliuosta. Ei ollut merkittäviä eroja lähtötasolle kesken eri ryhmissä. Invasiivisia mittaus keuhkojen vastuksen, hiiret nukutettiin, tracheostomized ja mekaanisesti tuuletettu. AHR arvioitiin mittaamalla muutoksiin keuhkon vastus (RL) vastauksena hengitettynä metakoliinille, kuten aiemmin on kuvattu [25]. Tiedot ilmaistaan ​​prosentuaalinen muutos lähtötasosta RL-arvot on saatu inhalaation jälkeen suolaliuosta. Ei ollut merkittäviä eroja lähtötasolle kesken eri ryhmien molempia menetelmiä.

Bronkoalveolaarinen huuhtelu (BAL) B

Hiirille annettiin tappava annos pentobarbitaalia (60 mg /kg ip) ja keuhkot huuhdeltiin 1 ml: n erillä Hanksin tasapainotettua suolaliuosta (HBSS) kautta tracheotomy. Huuhteluun sentrifugoitiin (300 x g 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa), ja BAL-nesteessä oli varastoitu -80 ° C: ssa ennen myöhempää määritystä. Solupelletti suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan HBSS: ää. Yhteensä solulaskenta suoritettiin lisäämällä 50 ui solususpensiota lisättiin 50 ui Kimura tahra, ja solut laskettiin Neubauer kammiossa valomikroskoopilla. Differential solumäärät tehtiin Sytospin valmisteita, valmistetaan sentrifugoimalla 500 rpm 5 minuutin ja värjäys May-Grünwald-Giemsa tahra. Solut tunnistettiin makrofagit, neutrofiilit, eosinofiilit ja lymfosyytit standardin morfologia. Kolmesataa solut laskettiin x 400 suurennus, ja prosenttiosuus ja absoluuttinen määrä kunkin solutyypin laskettiin.

Histologinen Studies

Lung osia eri koeryhmään hiiriä valmistettiin ja analysoitiin aiemmin on kuvattu [26]. Lyhyesti, vasen keuhkot fiksoitiin 4% paraformaldehydillä ja upotettiin parafiiniin. Jaksot (4 pm) värjättiin perjodihappo- Schiff (PAS) tunnistamiseen limaa erittävien solujen (pikarisolut) hengitysteiden ja vasta- värjättiin hematoksyliinillä. Värjätyt pikari solut laskettiin suuren kaliiperi esitermiin keuhkoputket ainakin kolme keuhkoleikkeissä saadaan kustakin eläimestä. Pituus tyvikalvon vastaavien keuhkoputken mitattiin Image J (National Institutes of Health). Tiedot ilmaistiin keskiarvona PAS positiivisia pikarisoluja keuhkoputkessa millimetriä kohti tyvikalvon. Aste peribronchial ja verisuonia tulehdus (tulehdus pisteet) arvioitiin subjektiiviseen asteikolla 0-3, kuten on kuvattu [27]. Kolme riippumatonta sokkoutetuilla tutkijat arvostellaan tulehdusta pisteet. Arvo 0 annettiin, kun ei tulehdus oli havaittavissa, arvo 1 annettiin satunnaisesti cuffing kanssa tulehdussolujen, jonka arvo on 2 annettiin useimmille keuhkoputket tai alusten ympäröi ohut kerros (yksi-viisi solujen paksu) tulehduksellinen solut, ja arvo 3 annettiin, kun suurin keuhkoputket tai alusten ympäröi paksu (yli viisi soluja paksu) tulehdussolujen.

Generation of luuydinperäisiä DC (BMDCs) B

DC kertyi luuytimen soluista WT tai

OGR1

– /-

hiiret menetelmän mukaisesti aikaisemmin kuvatulla tavalla [28]. Lyhyesti, luuytimen soluja saatu reisiluu ja sääriluu ja hiiret laitettiin RPMI 1640-alustassa (pH 7,4), joka sisälsi 10% FBS: ää hiiren rekombinantti GM-CSF (10 ng /ml; R R Huomasimme kuitenkin, että vaikutus OVA pulssi ilmenemistä CCR7- on heikennettyä. Siksi käytetään kaupallisesti saatavissa RPMI 1640 -alustassa ilman ylimääräisiä puskuriaineita in vitro kokeissa paitsi lyhyellä aikavälillä Ca

2+ vastauksen alla. Kun alustan pH on muutettu, HCl: a tai NaOH: a lisättiin elatusaineeseen.

hyväksyminen kokeilla BMDCs

Tämä suoritettiin, kuten on kuvattu [30]. Lyhyesti, BMDCs valmistettu WT tai OGR1 puutteesta hiiriä herkistetty OVA tai sen ajoneuvo (PBS) 24 h ennen hyväksymistä kokeita. OVA-pulssi BMDCs (1 x 10

6 solua 40 ul: ssa PBS: ää) tiputettiin WT-hiirissä siten, henkitorven. Kymmenen päivää myöhemmin hiiret altistettiin aerosoliksi OVA: lla (1% PBS: ssä) 20 min /päivä kolmen peräkkäisen päivän ajan; 48 tuntia viimeisen haasteen, AHR arvioitiin ja BAL nestettä saatiin. Siten hyväksyminen koe annettiin havaita merkittäviä astmaattisia vasteita 14 päivää, mikä on huomattavasti lyhyempi kuin aika (32 päivää) vaaditaan havaitsemiseen hengitystiereaktioita säännöllisillä in vivo OVA herkistymistä /haaste protokollaa. Tämä saattaa johtua siitä, että in vitro tehokas herkistää DC OVA DC hyväksymiseen kokeisiin.

BMDC migraatiokokeessa in vivo

Tutkia jakelu pistetään BMDCs solut valmistettiin WT tai OGR1-hiirissä ja pulssitettiin PBS: ää tai OVA kuten edellä on kuvattu. Solut leimattiin 10 ug /ml karboksifluoreseiini diasetaatti sukkinimidyyliesteriä (CFSE) (Molecular probes, Inc., Eugene, OR), 10 minuutin ajan 37 ° C: ssa RPMI 1640: ssä, joka sisälsi 0,5% BSA: ta (fraktio V) (Sigma-Aldrich) . Neljä ryhmää leimattuja soluja (PBS-käsitellyn WT DC, PBS-käsitellyn OGR1 puutteesta DC, OVA-käsitelty WT DC, ja OVA-käsitellyn OGR-1 puutosta DC) tiputettiin henkitorven osaksi 3 naiivi WT hiirtä kussakin ryhmässä. Peribronchial imusolmukkeet 3 hiirtä kerättiin kutakin ryhmää kohti ja CFSE

+ DC vaeltavat peribronchial imusolmukkeiden aikana 96 h analysoitiin virtaussytometrialla, kuten aiemmin on kuvattu [30]. Samanlaisia ​​kokeita suoritettiin 3 kertaa. Migration aktiivisuus ilmaistiin prosentteina CFSE

+ DC (CFSE

+ CD11 c

+) kohti koko solua sovellettu.

DC muuttoliike aktiivisuus arvioitiin edelleen, jonka polkuanturan määritys, jossa OVA-pulssi BMDCs leimattiin CFSE: llä, kuten on kuvattu, ja soluja injektoitiin subkutaanisesti käpälään WT-hiirissä. Migraatio solujen polvitaipeen imusolmukkeet analysoitiin virtaussytometrillä 24 h injektion jälkeen solujen.

mittaus Sytokiinit ja IgE

Sytokiini tasot BAL-nesteessä mitattiin Bio-Plex Suspension Array System (Nippon Bio-Rad Laboratories, Tokio, Japani) IFN-γ, IL 4, ja IL-5 ja ELISA-kitillä (eBioscience, San Diego, CA) IL-13, mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Plasmatasot OVA-IgE mitattiin DS hiiren IgE ELISA (OVA) Kit (DS Pharma Biomedical, Osaka, Japani), kuten aiemmin on kuvattu [23].

Measurement mRNA

kokonais-RNA eristettiin ja käänteiskopioitiin käyttäen satunaisaluke- ja Multiscribe käänteistranskriptaasia (Applied Biosystems, Foster City, CA). MRNA: t mitattiin kvantitatiivisen reaaliaikaisen TaqMan PCR Mx3000P Reaaliaikainen PCR System (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) käyttäen spesifisiä koettimia varten OGR1 (Mm01335272), TDAG8 (Mm00433695), GPR4 (Mm00558777), G2A (Mm00490809 ), CCR7: (Mm01301785), ja GAPDH (4352932E), kuten aiemmin on kuvattu [14].

mittaus Solunsisäiset Ca

2+ pitoisuus

ei-pulssi BMDCs kerättiin 10-cm ruokia 4 mM EDTA /PBS ja merkitty fura2 /AM. Solunsisäiset Ca

2+ pitoisuus ([Ca

2 +]

i) mitattiin solujen suspensiota varovasti sekoittaen ehto HEPES-puskuroidussa väliaineessa, joka perustuu muutokseen fura-2 fluoresenssia kuten aiemmin on kuvattu [14 ]. HEPES-puskuroitu väliaine koostui 20 mM HEPES (pH 7,4), 134 mM NaCl, 4,7 mM KCI, 1,2 mM KH

2PO

4, 1,2 mM MgSO

4, 2 mM CaCl

2 , 2,5 mM NaHCO

3, 5 mM glukoosi ja 0,1% BSA: ta. PH elatusaine säädettiin lisäämällä sopiva määrä HCl: ää.

virtaussytometria

BMDCs värjättiin PE-konjugoidulla monoklonaalisia vasta-aineita (mAb: t), laimennettu PBS: ään, joka sisälsi 1% BSA: ta ( FACS-puskuri). PE-konjugoitu Abs, mukaan lukien anti-CD11 c ja anti-CCR7, ja isotyyppikontrolli saatiin BD Biosciences, San Diego, CA. Kun oli inkuboitu ABS 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa, solut pestiin kahdesti FACS-puskurilla ja analysoitiin ®FACScan virtaussytometrillä käyttäen CellQuest -ohjelmistoa (Becton Dickinson, Mountain View, CA).

In vitro migraatiokokeessa

päivänä 7, WT tai

OGR1

– /-

BMDCs inkuboitiin kanssa tai ilman OVA: lla (100 ug /ml), kuten edellä on kuvattu. 24 tunnin kuluttua, viljellyt solut kerättiin ja suspendoitiin uudelleen RPMI 1640 väliaineessa pH: ssa 7,4 ja 0,1% BSA: ta. Solut (4 x 10

5) lisättiin päälle Transwell viljelyinsertistä kanssa 8 mm halkaisijaltaan ja 5-um huokoskoko chemotaxicell (Kurabo, Osaka, Japani). Testin aineet lisättiin alempaan osastoon 24-kuoppaisilla levyillä. Solujen lukumäärä siirtynyt alempaan kammioon 2,5 h määritettiin fluoresenssin muutos CyQuant GR Dye (Molecular probes, Inc., Eugene, OR), sen jälkeen, kun solujen lyysin.

Tilastollinen analyysi

Kaikki kokeet suoritettiin kahtena tai kolmena kappaleena. Tulokset on useita havaintoja esitetään keskiarvona + SEM tai edustavia tuloksia yli kolmesta eri erien soluja, ellei toisin mainita. In vivo kokeissa olemme suoritetaan yleensä viisikymmentäkuusi yli viisi hiirtä per ryhmä kussakin kokeessa ja suorittaa kaksi tai kolme kertaa samalla kokeissa. Esittämistä tuloksista in vivo -tutkimuksesta, me yleensä yhdistetty kaikki tulokset, ellei toisin mainita. Kaikki tilastolliset laskelmat suoritettiin GraphPad Prism 5 (La Jolla, Kalifornia). ANOVA käytettiin määrittämään tasojen välinen ero kaikissa ryhmissä. Vertailut kaikkien parien suoritettiin parittomia Student

t

testiä. Arvo

p

0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Generation of OGR1

– /- BALB /c-hiiret

roolin ymmärtämiseksi OGR1 astmaatikko hengitystietulehdusta, loimme OGR1 puutteesta BALB /c-hiirissä. OGR1 mRNA: n ilmentymisen on havaittu keuhkojen WT-hiirissä, vaikka ekspressiotasot eivät ole yhtä suuri kuin muiden protoni-sensing GPCR: ien (kuvio 1). Kun astma malli, hiiret herkistettiin injektoimalla vatsaonteloon OVA aluna adjuvantissa kahdesti ja altistettiin OVA aerosoli kolme kertaa (katso kuvio 2A), mikä johtaa 2,5 kertaa kasvu OGR1 mRNA: n ekspressio keuhkoissa (kuvio 1). Tällainen merkittävä kasvu mRNA-ekspressiota ei havaittu muissa protoni-sensing GPCR: ien. Kuten odotettua, OGR1 mRNA: n ekspressio oli täysin kadonnut, kun taas muut OGR1 perheen GPCR: n mRNA: n ilmentyminen oli ennallaan, keuhkoissa

OGR1

– /-

hiirissä riippumatta OVA hoitoa (kuvio 1).

WT ja

OGR1

– /-

hiiret herkistettiin OVA /aluna ja kiistänyt OVA. Jotta nonsensitized hiiriä, PBS ruiskutettiin ja hengitettynä. Lung mRNA ilmaus OGR1 ja muiden protoni-tunnistava GPCR: ien mitattiin 48 tunnin kuluttua viimeisen antigeenialtistuksen. Tulokset ovat keskiarvo + SEM 9. määrityksen kolmesta erillisestä kokeesta. * Vaikutus OVA-käyttökuntoon (WT-PBS vs. WT-OVA) oli merkittävä.

§The ilmentymistä OGR1 mRNA oli havaittavissa.

(A) OVA herkistymistä ja haaste protokollaa. WT ja

OGR1

– /-

hiiret herkistettiin i.p. injektio OVA /aluna ja haastaa OVA aerosoli (kolmio). Jotta nonsensitized hiiriä, PBS injektoitiin ja hengitettynä (ympyrä). AHR että hengitetään metakoliinilla arvioitiin muutokset invasiivisen Penh (B) ja dynaaminen vastus (C) 48 tuntia viimeisen antigeenin altistumista. Tiedot ovat keskiarvo + SEM

n

= 13-16 per ryhmä. *

p

0,05 (WT-OVA vs. OGR1

– /- OVA).

OGR1 puutos vaimentaa AHR ja hengitystietulehdusta OVA-herkillä hiirillä

Patofysiologinen roolit OGR1 keuhkoastmassa leimasi käyttäen OVA astman malli (kuvio 2A). Ensin arvioitiin kasvu PENH (Penh) käyttämällä barometrinen koko kehon pletysmografia indeksinä hengitysteiden supistuminen vastauksena kasvavia annoksia metakoliinilla (kuvio 2B). Inhaloitu aerosolisoidussa metakoliiniherkkyys tiedetään aiheuttavan keuhkoputkien. OVA herkistyminen /haaste selvästi lisääntynyt Penh vastauksena metakoliinille WT hiirillä; kuitenkin, AHR OVA herkistyminen /haaste oli merkittävästi heikennetty OGR1-hiirissä tasolle, että hiirten herkistetty ja altistettiin PBS: llä yksinään (kuvio 2B). Koska mittaus Penhin kuten AHR on kiistanalainen [31-33], mittasimme keuhkojen vastuksen suora invasiivinen menetelmä samoin. Johdonmukaisesti tuloksiin Penhin OVA herkistyminen /haaste lisäsi keuhkojen vastustuskykyä vastauksena metakoliinille WT hiirillä ja OGR1 puutos heikennettyjä OVA-indusoidun lisääntymistä keuhkojen vastustuskykyä tasolle, että valvonta hiiret herkistetty ja altistettiin PBS (kuvio 2C ).

OVA herkistyminen /haaste aiheutti tiheä peribronchial ja verisuonia kertymistä tulehdussolujen sekä metaplasiaa ja lima hyperproduction hengitysteiden seinämien WT hiirillä (kuvio 3A ja B). Nämä muutokset olivat vähäisiä vuonna OGR1-hiirissä OVA herkistyminen /haaste (kuvio 3A). Aste pikarisolumuuntumista ja limaa hyperproduction arvioitiin PAS-värjäyksellä, joka on määrällisesti PAS-värjättiin solujen määrä per pituus tyvikalvon (mm) (kuvio 3C). Kannustanut PAS värjäys OVA herkistyminen /haaste merkittävästi inhiboi OGR1 puute. Mitä peribronchial ja verisuonia tulehdusta aste kertymistä tulehdussolujen arvioitiin tulehduksen pisteet (kuva 3D ja E), joka osoitti, että OGR1-puutos ehkäisi merkittävästi OVA herkistyminen /haaste aiheuttaman tulehdussolujen kertymistä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että OGR1 on mukana pikarisoluliikakasvua ja peribronchial ja verisuonia tulehdusta.

Hiiret herkistettiin ja altistettiin OVA- tai PBS, kuten on kuvattu kuviossa 2. (A) Histologinen analyysi keuhkojen kohdissa suoritettiin 48 h kun viimeinen antigeeni altistumista. Hematoksyliini- ja PAS-värjättiin osat esitetään edustavat kolme keuhkoleikkeissä per hiiri 5-6 hiirtä kussakin ryhmässä. Mittakaava, 200 um. (B) Mitä korkeampi suurennus kuvan neliön WT-OVA on esitetty. (C) Pikarisoluliikakasvua kvantifioitiin kuten PAS-värjäys solujen määrä (C), ja aste peribronchial tulehduksen (D) ja verisuonia tulehdus (E) arvioitiin subjektiiviseen asteikolla 0-3 tulehduksellinen pisteet, käyttäessään samoja osia kuin ne, joita käytetään (A). Pylväs suunnittelu määrittämällä kunkin ryhmän (D) ja (E) on sama kuin kohdassa (C). Vaikutukset OGR1 puutos (WT-OVA vs. OGR1

– /- OVA) olivat merkittäviä (*

p

0,05) koko kuva.

Analysoimme numerot ja väestön solujen läsnä BAL nesteitä (kuvio 4A ja B). Lisääntynyt yhteensä solumäärät hiirten OVA herkistyminen /haaste vähensi merkittävästi OGR1-hiirissä suhteessa WT hiirillä. Differential solumäärät paljasti näkyvä eosinofiilien osaksi BAL nesteiden WT hiirillä OVA herkistyminen /haaste, joka huomattavasti pienentää OGR1-hiirissä samalla hoitoja. Pitoisuus lymfosyyttien BAL nesteissä myös vähentää merkittävästi OGR1 puute. Ei ollut merkittävää vaikutusta OGR1 vajauksen makrofagien määrä ja neutrofiilien.

Hiiret herkistyneet ja riitauttanut OVA tai PBS kuten on kuvattu kuviossa 2. BAL-nesteessä analysoitiin 48 tunnin kuluttua viimeisen antigeenin valotuksen koko solumäärä ja profiilin solutyyppejä. Edustavat kuvat tulehdussolujen (A) ja ero solumäärät (B) BAL nesteissä. Arrowheads ja nuolet edustavat makrofagien ja eosinofiilit, vastaavasti. Mittakaava, 200 um. Mac, makrofagi; Lym, lymfosyyttien; Eos, eosinofiilit; ja Neu, neutrofiilit. Tiedot ovat keskiarvo + SEM

n

= 10-12 per ryhmä. Sama BAL nesteitä käytettiin mittaamaan IL-4, IL-5, IL-13, ja IFN-γ (C). Tiedot ovat keskiarvo + SEM

n

= 10-12 per ryhmä. Plasma kerättiin mittausta OVA-IgE-tasot BAL fluidinkokoojalaite (D). Tiedot ovat keskiarvo + SEM

n

= 6-15 ryhmää kohti. Pylväs suunnittelu määrittämällä kunkin ryhmän (C) ja (D) on samat kuin (B). Vaikutukset OGR1 puutos (WT-OVA vs. OGR1

– /- OVA) olivat merkittäviä (*

p

0,05) koko kuva.

arvioida mekanismeja vähentää AHR, eosinofilia, ja pikarisolumuuntumiseen, Th1 /Th2-sytokiinien BAL nesteiden mitattiin ELISA: lla (kuvio 4C). OVA herkistyminen /haaste indusoi merkittäviä lisäyksiä Th2 sytokiinien, mukaan lukien IL-4, IL-5 ja IL-13, ja Th1-sytokiini IFN-γ WT-hiirissä. Th2 sytokiini pitoisuus BAL nesteissä oli merkitsevästi pienempi OGR1-hiirissä kuin WT hiirillä. Toisaalta, OVA herkistyminen /haasteen indusoima lisäys IFN-γ tuotanto ei vaikuttanut OGR1 puute (kuvio 4C). Plasmatasot IgE spesifisiä OVA myös inhiboi OGR1 puute OVA herkistymistä /hiiriin (kuvio 4D).

DC Express Functional OGR1

in vivo Edellä kuvatut tulokset viittaavat siihen, että OGR1 näytelmiä rooli tässä prosessissa tai ylävirran prosessin induktioon Th2-vasteen patogeneesissä hengitysteiden astma. Me spekuloida, että DC toimintoja ohjaa OGR1. Ei ole edellisen raportin koskevia OGR1 ilmaisun ja sen toimintoja DC. Koska vasta-aineita spesifisiä OGR1 ei ollut saatavilla, OGR1 ekspressiotaso arvioitiin mRNA mittaus (kuvio 5A). Olemme vahvistaneet OGR1 mRNA: n ilmentymisen arvioitiin reaaliaikaisen TaqMan PCR epäkypsiä BMDCs WT hiirillä. Mielenkiintoista on, että mRNA: n ilmentyminen OGR1 on hieman, mutta kasvoi merkittävästi OVA herkistyminen (kuvio 5A). Kuten odotettua, OGR1 mRNA: n ekspressio on täysin menetetty DC riippumatta OVA herkistymisen

OGR1

– /-

hiirissä (kuvio 5A). Olemme myös mitattu ilmaus mRNA muut protonin tunnistava GPCR: ien in DC. Toisin kuin keuhkojen näytteet (kuvio 1), GPR4 ekspressio oli hyvin alhainen DC riippumatta OVA pulssin (kuvio S1). Toisaalta, samalla tavalla kuin OGR1, TDAG8 ja G2A mRNA: n ilmentymisen kasvatti merkittävästi OVA herkistyminen (kuvio S1).

DC näihin OGR1 mRNA: ta ja toiminnallista OGR1 toimintaa. Expression of OGR1 mRNA DC ja sen kasvaa OVA-esikäsittely (A). Ilmentyminen OGR1 mRNA arvioitiin kvantitatiivisen tosiaikaisen TaqMan PCR: llä. Tiedot ovat keskiarvo ± SEM 9 määrityksen kolmesta erillisestä kokeesta. Effect of OVA-käyttökuntoon (WT-PBS vs. WT-OVA) oli merkitsevä (*

p

0,05).

§The ilmentymistä OGR1 mRNA oli havaittavissa. Happamoitumisen indusoi [Ca

2 +]

i lisätä kautta OGR1 /G

q /11-proteiinin DC (B ja C). DC valmistettiin WT ja

OGR1

– /-

hiiret ja inkuboidaan seurata [Ca

2 +]

i arvioi muutoksen Fura-2 fluoresenssi. Soluja esi-inkuboitiin suspension pH: ssa 7,4, ja nuolella, HCl: lla (lopullinen pH 7,0) tai ATP: tä (100 uM) lisättiin. Arvioida roolin G

q /11-proteiinia, solujen suspensiota käsiteltiin YM-254890 (100 nM) (tai DMSO: ta ajoneuvo). Edustava jälkeäkään [Ca

2 +]

muutan osoitettiin (B). Netto [Ca

2 +]

muutan (huippuarvo – perusarvosta) arvioitiin (C). Pohjapinta-arvo [Ca

2 +]

i pH 7,4 oli 125 ± 12 nM ja arvo ei merkittävästi vaikuta OGR1 puute. Tiedot ovat keskiarvo ± SEM 8 määrityksen neljästä erillisestä kokeesta. Vaikutus OGR1 puutos (WT vs. OGR1

– /-) oli merkittävä (*

p

0,05).

varmistamiseksi edelleen toiminnallisen OGR1 ilmaisun DC, Ca

2+ vaste solunulkoiseen protoneja tutkittiin koska OGR1 tiedetään yhdessä G

q /11-proteiinia /fosfolipaasi C /Ca

2+ signalointireiteissä erityyppisissä soluissa [8,13-19]. Happamoituminen solunulkoiseen pH-arvoon 7,0 selvästi lisäsi solunsisäistä Ca

2+ pitoisuus ([Ca

2 +]

i), joka oli lähes täysin estää OGR1 puutos ja YM-254890, joka on spesifinen estäjä G

q /11-proteiineja (kuvio 5B ja C). Esiin tulee [Ca

2 +]

i vastaus ATP, ligandi G

q /11-proteiiniin P2Y-tyyppinen purinergisille reseptoreita, ei vaikuttanut OGR1 puute (kuvio 5B ja C). Siten

OGR1

– /-

hiiret eivät osoittaneet yleinen vika G

q /11-proteiinin signalointi. Pidetään Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että DC ilmentävät funktionaalista OGR1 kytkentä G

q /11 proteiineja.

Intratrakeaalinen siirtäminen OGR1-puutteellinen DC Kehittää Ala AHR ja eosinofilia verrattiin WT DC

arvioimiseksi kriittinen rooli OGR1 DC: issä on astman, otto- OVA DC: eitä siirron kokeet suoritettiin. OVA-pulssi tai ei-pulssitetun DC: henkitorveen siirrettiin WT-hiirissä, jota seurasi OVA hengitettynä 10 päivää sen jälkeen, kun DC-annon (kuvio 6A). AHR mitattuna kasvaa Penh hengitetään metakoliinilla oli huomattavasti korkeampi henkitorvensisäisen siirtoa OVA-pulssi DC kuin ei-pulssitetun DC kun DC valmistettiin WT hiirillä (kuvio 6B). Sitä vastoin, hiiret, jotka saivat OVA-pulssi OGR1 puutteesta DC kehitetty pienempi nousu Penh verrattuna, jotka saivat OVA-lisättyjä WT DC.

(A) pöytäkirja DC antamisen koetta. OVA tai PBS-pulssi BMDCs valmistettiin WT ja

OGR1

– /-

hiirille ja annettiin henkitorveen WT hiirillä. Kymmenen päivää myöhemmin hiiret altistettiin OVA inhalaatiolla 20 min kolmena peräkkäisenä päivänä. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia viimeisen OVA-altistusta, AHR metakoliinille mitattiin Penh toimintaa (B). Mittauksen jälkeen hengitysteiden reagointikykyä, BAL nesteet kerättiin ja analysoitiin lasken solujen kokonaismäärästä ja erilaistuneita soluja (C). Tiedot ovat keskiarvo + SEM

n

= 10-12 per ryhmä.

#

p

0,05 (DC (WT) -PBS vs. DC (WT) -OVA) ja *

p

0,05 (DC (WT) -OVA vs. DC (

– /-) – OVA).

Lisäksi mitattiin numerot ja tyypit tulehdussolujen BAL nesteissä hiirten siirtyvät DC (kuvio 6C). Eosinofiilien lukumäärää ja lymfosyyttien BAL nesteissä hiirillä, jotka saivat OVA-lisättyjä OGR1-puutteellisia DC oli merkittävästi alhaisempi kuin hiirillä, jotka saivat OVA-lisättyjä WT DC. Nämä tulokset osoittavat, että muuttaminen DC toiminnot voivat selittää ainakin osittain alennettu AHR ja hengitysteiden tulehduksen

OGR1

– /-

hiirillä.