Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Käyttämällä vasta-aine /aptameeriin-lääkekonjugaateilla voi olla lupaava menetelmä vähenee myrkyllisyys ja lisäävät tehokkuutta kemoterapiaa.

Menetelmät /Principal Havainnot

tässä tutkimuksessa, antituumoriaine Doksorubisiini (Dox) sisällytettiin muunnettu DNA-aptameeri TLS11a-GC, joka kohdistuu erityisesti LH86, ihmisen maksasyövän solulinjassa. Solujen elinkelpoisuus kokeet osoittivat, että TLS11a-GC-Dox konjugaattien näytteillä sekä tehon ja kohdistaa spesifisyys. Tärkeää on, interkalatoivat Dox osaksi modifioitua aptameeriin esti epäspesifinen otto kalvon läpäisevän Dox ei-kohdesolulinjana. Koska konjugaatit ovat selektiivisiä soluille, jotka ilmentävät suurempia määriä kohdeproteiinien, molemmat kriteerit edellä todettiin täyttyvät, jolloin TLS11a-GC-Dox-konjugaattien mahdollisia ehdokkaita kohdennettua antoa varten maksan syöpäsoluja.

Johtopäätökset /merkitys

Kun otetaan huomioon suuri määrä saatavilla aptameereillä että on erityisiä tavoitteita monenlaisia ​​syöpäsoluja, tämä uusi aptameeriin huumeiden intercalation menetelmä on lupaava vaikutuksia kemoterapeuttisten yleensä.

Citation: Meng L, Yang L, Zhao X, Zhang L, Zhu H, Liu C, et ai. (2012) Kohdennettu toimitus Kemoterapia Agents käyttäminen Maksasyöpä-Specific aptameeriin. PLoS ONE 7 (4): e33434. doi: 10,1371 /journal.pone.0033434

Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 lokakuu 2011; Hyväksytty: 08 helmikuu 2012; Julkaistu: 25 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Meng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health (NIH) GM066137, GM079359, ja CA133086. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

on hyvin tunnettua, että perinteiset syövän kemoterapia-aineisiin voi aiheuttaa vakavia haittavaikutuksia niiden epäspesifinen myrkyllisyys. Tämän ongelman voittamiseksi ja saavuttaa tietyn lääkeaineen, ryhmämme ja muut tutkijat ovat käyttäneet vasta-aineita [1], [2] tai aptameerien [3], [4], [5], [6], [7], [8] [9], [10] suunnitella ligandiin sidottu lääkekonjugaateilla kohdennetun toimituksen sovelluksia.

Aptameerit ovat yksijuosteisia oligonukleotideja, jotka voivat sitoutua spesifisesti pieniin molekyyleihin, [11], peptidit ja proteiinit. [12] Aptameerit ei ainoastaan ​​tarjota etuja vasta, kuten korkea spesifisyys ja affiniteetti, mutta niillä on myös alhainen immunogeenisyys ja korkea vakaus, helppo synteesi ja muuttamista. Äskettäin prosessia kutsutaan solun SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Eksponentiaalinen rikastamiseen) on kehitetty tuottamaan Aptameerien spesifisen tunnistamisen tavoite syöpäsolujen, mukaan lukien T-solujen akuutti lymfaattinen leukemia (T-solu ALL), pienisoluinen keuhkosyövässä , maksan syöpien ja virus-infektoitujen solujen. [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19] Nämä aptameerit ovat erittäin spesifisiä erityyppisten kasvainsolujen ja on erinomainen sitoutumisaffiniteetit. Koska aptameerit tarjoavat spesifisyyttä molekyylitasolla, uskotaan, että aptameerin-lääkekonjugaateilla voi tehostaa lääkeaineen, kun taas samaan aikaan, vähentää systeemistä toksisuutta.

maksasolusyövän (HCC) on yksi yleisin ja tappava syövistä maailmassa. Se aiheuttaa noin 600000 kuolemantapausta vuosittain. Tällä hetkellä hoitoja varhainen maksasyövän ovat luottaneet maksansiirron ja kirurginen resektio. Tavanomaiset kemoterapia ei ole ollut tehokasta maksasyövän potilaiden, ja koska kemoterapia-aineet eivät ole erityisesti maksan syöpäsoluja, myrkyllisiä sivuvaikutuksia seurauksena. Aikaisemmassa julkaisussa raportoimme kehittäminen useita konkreettisia aptameereillä perustuu hiirimallissa. [14] Yksi näistä aptameerit voivat myös spesifisesti tunnistavat ihmisen maksan syöpäsoluja, ja me raportoimme tässä uutta muotoilua varten kohdennetun toimituksen doksorubisiinin (Dox) maksan syöpäsoluja.

Doksorubisiinin on hoitoon maksasyövän muodossa paikalliseen syöttöön, mutta sen tehokkuus vaikeuttaa myrkyllisiä sivuvaikutuksia. Tämän ongelman voittamiseksi olemme interkaloitu Dox modifioituun aptameerin koetin. Dox tiedetään interkalatoi osaksi DNA-juosteen läsnäolo tasainen aromaattisia renkaita Dox-molekyylin. Viimeaikainen tutkimus on jo osoittanut, että Doxorubicin voi interkalatoi osaksi aptameerin A10 tarjota erityistä tappotehoon eturauhasen syöpäsoluja. [6], [20].

aptameerin TLS11a oli aiemmin valittu solu-SELEX vastaan ​​BNL 1ME A.7R.1 (MEAR) hiiren hepatoomasolulinja. [14] Se valittiin tähän sovellukseen, koska se osoitti suurta sitoutumisaffiniteetti LH86, maksan syöpäsolun linja. [21] Jotta suuremman interkalaation tehokkuus, pitkä GC hännän lisättiin TLS11a muodostamiseksi modifioitua aptameeriä, TLS11a-GC. Vuorovaikutuksen kautta, välinen suhde Doksorubisiini ja TLS11a-GC oli 25:1. Näin ollen toimituksen tehokkuutta Doksorubisiini oli paljon suurempi verrattuna alkuperäiseen TLS11a. Myös

in vitro

ja

in vivo

kokeet osoittivat, että TLS11a-GC-Dox konjugaateilla on paljon paremmat tappoa tehokkuuden tavoite syöpäsolujen verrattuna vapaan Dox ja ohjaus aptameeriin-Dox konjugaatteja.

tulokset

sitoutumisaffiniteetti aptameerin TLS11a

aptameerin TLS11a (Fig. 1a) on tuotettu vastaan ​​BNL 1ME A.7R.1 (MEAR) hiiren hepatoomasolulinja [ ,,,0],14] ja osoitti vahvaa sitoutumisaffiniteetti (Kd = 4,51 ± 0,39 nM). [14] LH86-solulinja perustettiin potilaasta, maksasyöpä. [21] Kun TLS11a käytettiin testaamaan LH86 solujen selvää sitova kyky havaittiin (Fig. 1 b). Myös silloin, kun ihmisen normaali maksan soluja, Hu1082, testattiin käyttämällä TLS11a, ei merkittävää sitoutumista ei havaittu (kuvio. 1c). Kuviossa. 1 b ja c, vihreä histogrammi osoittaa taustalla sitoutuminen (kontrolli aptameeri, TD05) ja punainen fluoresenssi-intensiteetit osoittavat sitoutumisen TLS11a tavoite ja kontrollisoluja. Kontrolliin verrattuna aptameeri, on olemassa merkittävä ero sitomisvoima TLS11a on LH86 ja Hu1082 soluja. Ei aiemmin raportoitu koetin erottelee maksan syöpäsoluja ja ihmisen normaali maksan soluihin. Myös Kd TLS11a on LH86 oli 7,16 ± 0,59 nM (Fig. 1 d), kun 4,51 ± 0,39 nM BNL 1ME A.7R.1. [14].

(a) sekundaarirakenne aptameerin TLS11a ja sen sitova kyky (b) LH86 ja (c) ihmisen normaalia maksan soluja, Hu1082. Vihreä histogrammi osoittaa taustalla sitoutuminen (kontrolli aptameeri, TD05) ja punainen fluoresenssi-intensiteetit osoittavat sitoutumisen TLS11a tavoite ja kontrollisoluja. Kaikki koettimet leimattiin fykoerytriinilla Cy5.5. (D) Kd määrittämiseksi.

Immunohistologiset kuvantaminen ja fluoresenssimikroskopiaa on käytetty laajalti tutkimuksessa kiinteitä kasvaimia; Siksi olemme myös arvioitava TLS11a voitaisiin käyttää kasvaimen kuvantamiseen kanssa LH86, positiivisen solulinjan. Kuvassa S1 esittää konfokaali kuvia LH86 havaita TLS11a ja säätelysekvenssi, TD05 (Text S1). Oli merkittävä signaalinvoimakkuus TLS11a verrattuna negatiiviseen kontrolliin, ja signaali kuvio osoittaa, että aptameerien sitoutuvat solujen pintaan.

Yleensä oletetaan, että aptameerit valittu vastaan ​​solulinjat sitoutuvat solun kalvoproteiinien . Tämä on osoitettu parhaiten SELEX protokollat, joihin liittyy kasvaimen solulinjojen. [22], [23] Tutkiakseen kohdemolekyyli TLS11a, teimme proteaasin määritys, jossa LH86-soluja käsiteltiin trypsiinillä 10 min ajan 37 ° C: ssa. Inkubointijakson jälkeen, proteaasiaktiivisuus pysäytettiin lisäämällä jääkylmää PBS: ää, joka sisälsi 20% FBS: ää. Solut pestiin nopeasti kaksi kertaa sentrifugoimalla ja sitten inkuboitiin aptameerejä. Kuten kuviossa S2, TLS11a hävisi tunnustamista merkittävästi trypsiini-käsitellyissä soluissa (ETA S1). Fluoresenssisignaalien vähennetty tausta, joka osoittaa, että solujen käsittelyä kanssa proteaasien aiheuttamaa ruoansulatusta kohdeproteiinin puolestaan ​​osoittaa, että kohdemolekyyli TLS11a on kalvoproteiini.

sisäistämisen määrityksessä oli sitten selvittää onko TLS11a voitaisiin sisäistää kun tavoite sitova. LH86-soluja inkuboitiin ensin biotiini- leimatun TLS11a tai TD05 ja sitten inkuboitiin edelleen streptavidiini- konjugoidun PE-Cy5.5. Sitten puskuri poistettiin, ja elatusainetta LysoSensor ™ Green DND-189 lisättiin soluihin ja inkuboitiin 37 ° C: ssa kahden tunnin ajan. LysoSensor toimi indikaattorina lysosomiin sijainti soluissa. Kuten kuviossa S3, oli selvää, sisäistämisen aptameeri (Text S1). TLS11a signaali peräisin solujen sisällä sen sijaan, että ulompi marginaaleja, ja se yhteistyössä paikallistaa LysoSensor. Ohjaussekvenssi ei osoittanut signaalin joko 4 ° C: ssa tai 37 ° C: ssa määrityksiin. Tulokset viittaavat siihen, että TLS11a voi olla sitoutunut proteiini, joka voidaan sisäistää.

konjugointi ja Property Study of aptameerin-Dox Complex

Dox tiedetään interkalatoi sisällä DNA-juosteen läsnäolo tasainen aromaattisia renkaita, ja se sitoutuu ensisijaisesti kaksijuosteinen 5′-GC-3 ’tai 5′-CG-3′-sekvenssejä. [24], [25]. Sekundaarirakenne TLS11a, kuten ennustaa NUPACK ohjelmisto (https://www.nupack.org/), on esitetty kuviossa 1a. Rakenteen mukaan, on kaksi 5’-GC-3 ’tai 5′-CG-3′ sekvenssien TLS11a sekvenssin siten, että yksi TLS11a sekvenssi voi interkalatoi enintään kaksi doksorubisiinin molekyylejä. Jotta interkalatoi enemmän Doksorubisiini molekyylejä, pitkä GC hännän lisättiin 5’-päähän TLS11a tuottaa modifioitua aptameeriä, TLS11a-GC (Fig. 2a). Koska pitkä GC hännän, TLS11a-GC muodostaa dimeerin rakenne. Nupack laskelma osoitti, että yksi TLS11a-GC dimeeri voi interkalatoi jopa 56 Doksorubisiini molekyylejä tuottaa TLS11a-GC-to-Doxorubicin suhde 01:28. Kontrolli aptameeriin järjestyksessä, TD05, myös modifioitu pitkä GC hännän antaa saman aptameerin doksorubisiinille suhde (Fig. 2b). Vaikka TLS1a-GC ja TD05-GC-dimeerit voivat interkalatoi jopa 28 Dox per aptameeri, suhde aptameerin ja doksorubisiinin pidettiin 01:25 näissä kokeissa.

interkalaation Dox osaksi GC-modifioitu aptameerit muodostunut fyysisiä konjugaatteja. (A) TLS11a-GC-Dox. (B) TD05-GC-Dox. (C) sammutus Dox fluoresenssin interkaloimisen jälkeen. Affiniteetti (d) TLS11a-GC tai (e) TD05-GC LH86 soluja seurataan virtaussytometriaa käyttämällä. Fluoresenssin signaali on peräisin fykoerytriinilla Cy5.5. Internalisaation (f) Dox, (g) TLS11a-gc-Dox, ja (h) TD05-GC-Dox havaittu konfokaalimikroskopialla.

On hyvin tunnettua, että Dox on fluoresenssi ominaisuuksia, mutta interkaloitu DOX osaksi DNA aptameeriin sammuttaa fluoresenssin Dox takia muodostumista varauksen siirtoa väliset kompleksit DNA perustaa ja antrasykliinin rengas. [26], [27], [28] Sen tutkimiseksi, onko tällainen vuorovaikutus tapahtuu modifioidulla TLS11a-GC ja TD05-GC aptameerejä, fluoresenssi hankittiin Dox puuttuessa ja läsnä ollessa yhden aptameereillä (Fig. 2c) . Ratkaisu Vapaan Dox oli korkein fluoresenssi signaali verrattuna mustan ryhmään (sidospuskuri). Kun muokattu aptameeriin (TLS11a-GC tai TD05-GC) lisättiin Dox liuokseen 1:28 suhde ja sekoitetaan hyvin, fluoresenssi laski jyrkästi lähes taustan tasolle, mikä osoittaa, että intercalation DOX osaksi DNA aptameeriin on toteutettavissa ja nopea . Senkin jälkeen aptameeri-Dox kompleksin liuosta pidettiin huoneen lämpötilassa 3 tuntia, fluoresenssi pysyi samana, mikä osoittaa, että aptameerin-Dox kompleksi on erittäin vakaa.

sitoutumisaffiniteetti TLS11a-GC määritettiin kilpailu menetelmällä. Kun oli inkuboitu leimaamattoman TLS11a-GC, sitova sivustoja LH86 solut täysin miehitetty. Sitten soluja inkuboitiin edelleen väriaine-leimatun TLS11a. Koska kaikki sitoutumiskohdat solukalvon hoitivat leimaamatonta TLS11a-GC, väriaine-leimattu TLS11a ei sitoudu LH86 soluihin, ja pesun jälkeen fluoresenssia signaalia ei havaittu (kuvio. 2d). Samaan aikaan, kilpailun kokeen välillä TD05-GC ja väriaine- leimattu TLS11a suoritettiin. Koska TD05-GC ei sitoudu LH86, sitoutumiskohtiin olivat käytettävissä vuorovaikutukseen väriaine-leimatun TLS11a, jolloin tuloksena on suuri fluoresenssin signaalin (Fig. 2e). Sen jälkeen muutos pitkän GC hännän, virtaussytometrillä tiedot osoittivat selvästi, että TLS11a-GC voi silti sitoutua LH86 soluihin, kun taas TD05-GC voinut.

Doksorubisiini vapautuminen tutkittiin käyttäen konfokaalimikroskopia. 1 h kuluttua inkuboinnin doksorubisiinin kanssa tai aptameeri-Dox-konjugaatteja, soluja inkuboitiin edelleen 3 tunnin ajan 37 ° C: ssa ennen kuvantamisen. Kuvio 2F osoittaa, että solut, joita käsiteltiin vapaan doksorubisiinin oli eniten Doksorubisiini niiden ytimet, kun taas ytimet käsiteltyjen solujen TLS11a-GC-Dox-konjugaattien (Fig. 2 g) sisälsi myös doksorubisiini. Kuitenkin ytimet käsiteltyjen solujen TD05-GC-Dox-konjugaattien (Fig. 2 h) sisälsi lähes doksorubisiini. Tämä koe vahvisti, että TLS11a-GC-Dox konjugaateilla oli spesifistä sitomisaffiniteettia LH86 soluihin verrattuna TD05-GC-Dox konjugaatteja. Lisäksi Dox voitaisiin vapauttaa TLS11a-GC-Dox konjugaatteja jälkeen sisäistämistä ja voisi tulla ydin.

Solun myrkyllisyys Aptameerin-Dox konjugaattien

solujen elinkelpoisuutta LH86 käsitelty TLS11a-GC -Dox, TD05-GC-Dox, doksorubisiini, TLS11a-GC, tai TD05-GC testattiin ja verrattiin käsittelemättömiin soluihin (kuvio. 3a). Doksorubisiinin pitoisuus TLS11a-GC-Dox, TD05-GC-Dox, ja vapaan doksorubisiinin pidettiin 7,5 uM, ja suhde doksorubisiinin ja aptameerin oli 25:1. Aptameeriä pitoisuus TLS11a-GC, TD05-GC, TLS11a-GC-Dox, ja TD05-GC-Dox ryhmiä pidettiin 300 nM. Datasta kuviossa 3a, TLS11a-GC ja TD05-GC ei ollut merkittävää vaikutusta solujen elinkykyä. On selvää, että käsittely TLS11a-GC-Dox-konjugaattien laski solujen elinkykyä. Tehokkuus solun myrkyllisyys oli Doksorubisiini TLS11a-GC-Dox TD05-GC-Dox. Vaikka solun myrkyllisyyttä TLS11a-GC-Dox oli pienempi kuin vapaan doksorubisiinin, myrkyllisyys vaikutus TD05-GC-Dox oli paljon huonompi. Lisäkokeita käyttäen Hu1229 ihmisen normaali maksan soluihin (Fig. 3b) osoitti, että vapaa Dox oli merkittäviä haittavaikutuksia, kun taas TLS11a-GC-Dox ja TD05-GC-Dox oli samanlaiset ja hyvin rajallinen myrkyllisyys. Nämä tiedot osoittavat, että spesifisyys aptameerin TLS11a-GC LH86 soluihin saavutetaan myrkyllisyys kohdesoluihin vain.

(a) Suhteellinen solujen elinkelpoisuus LH86 (kohdesolulinjana); (B) Suhteellinen solujen elinkelpoisuus Hu1229 (ihmisen normaalia maksasolut); (C) Hoechst 33258 värjäytymistä apoptoottisten ja kuolleiden LH86: lla käsiteltyjen solujen sarja pitoisuuksia TLS11a-GC-Dox tai TD05-GC-Dox; (D) Western blot tulokset katkaistun kaspaasi 3 LH86: lla käsiteltyjen solujen sarja pitoisuuksia TLS11a-GC-Dox tai TD05-GC-Dox.

Solun apoptoosia tutkittiin käyttämällä Hoechst 33258 värjäytymistä ( kuva 3c). Vuodesta fluoresenssi kuvien, kun Dox pitoisuus oli 60 uM, oli enemmän apoptoottisia ja kuolleita soluja TLS11a-GC-Dox ryhmässä (35,1%) kuin TD05-GC-Dox ryhmässä (13,7%), lisäksi osoittaa spesifisyyden of aptameerin-Dox konjugaatteja. Lisäksi kaspaasi 3 aktivaatio seurattiin Western blot (kuvio. 3d). Kaspaasi 3 on tärkeä rooli solujen apoptoosin, ja pilkottu kaspaasi 3 osoittaa sen aktivoinnin. Esitetyistä tiedoista, kun Dox-pitoisuus oli 60 uM, bändi tiheys pilkottiin kaspaasi 3: lla käsiteltyjen solujen TLS11a-GC-Dox oli 3,3 kertaa suurempi kuin, että soluissa, joita käsiteltiin TD05-GC-Dox.

In vivo

Studies

kolmekymmentä NOD. Cg-Prikdc (scid) IL2 hiiriä käsiteltiin, kuten on kuvattu kokeellisessa osassa. Kasvaimen koko kunkin hiiren mitattiin joka toinen päivä, ja keskimääräinen tuumorin tilavuus laskettiin (Fig. 4a). Tiedot osoittavat, että sekä vapaa Dox ja TLS11a-GC-DOX kompleksi oli selvää kasvain eston vaikutuksia verrattuna käsittelemättömän ryhmän. Myös TLS11a-GC-DOX kompleksi oli tehokkaampi vaikutus verrattuna vapaan Dox, mikä osoittaa, että TLS11a-GC-Dox konjugaatteja kohdennettua kasvainsoluihin ja saavuttaa korkeampi paikallinen Dox pitoisuus tuumoripaikkaan verrattuna vapaan Dox. Lisäksi, kasvaimet kunkin hiiren kerättiin ja kiinnitettiin käyttämällä 10% formaliinilla 24 h. Sitten kaikki näytteet lähetettiin molekyyli patologian ydin laboratorioon H (B) Microscopy kuvia H säätelysekvenssi TD05.

(5′-CACCGGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTCAGGGTCTCCTCCCG GTG-3 ’); modifioitua aptameeriä TLS11A-GC (5’

CGCGCGCGCGCGCGC GCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGACAGCATCCCCATGTGAACAATCGCATTGTGATTGTTACGGTTTCCGCCTCATGGACGTGCT G

-3 ’); ja modifioitu kontrollisekvenssin TD05-GC (5’

CGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGAACACCGTGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTCAGGGTCTCCTCCCGGTG

-3 ’) Syntetisoitiin ABI3400 DNA /RNA syntetisaattori (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Täytetty sekvenssit poistetaan suojaus, AMA (ammoniumhydroksidi /40% vesipitoista metyyliamiinia 1:01) 65 ° C: ssa 30 minuutin ajan ja puhdistettiin edelleen käänteisfaasi-HPLC: llä (ProStar, Varian, Walnut Creek, CA, USA) on C -18 pylväästä käyttäen 100 mM trimetyyliamiini asetaattipuskuria (TEAA, pH 7,5) ja asetonitriiliä liikkuvana faasina. Jotta aptameeri-Dox konjugaatteja joko TLS11a-GC tai TD05-GC sekoitettiin Doksorubisiini sitomispuskuriin (PBS, joka sisälsi 5 mM MgCI

2, 4,5 mg /ml glukoosia, 0,1 mg /ml hiivan tRNA: ta, 1 mg /ml BSA) tai DMEM klo 1:25 suhde aptameerin ja Dox.

seuranta Complex Formation fluoresoivalla

Fyysinen konjugaatit aptameeriin (TLS11a tai TD05) ja Doksorubisiini valmistettiin klo 1 :28 moolisuhde aptameerin doksorubisiinille (10 uM) sitomispuskuriin, ja fluoresenssia tarkkailtiin 500-720 nm (1,5 mm rako) on Fluorolog-Tau-3 spektrofluoro- (Jobin Yvon) virityksen ollessa 480 nm.

määritys aptameerin Affinity

LH86 solut irrotettiin ruokia, ei-entsymaattisesta soluhajotusprosessin liuosta (Cellgro) ja sitten pestiin pesupuskurilla (PBS, joka sisälsi 5 mM MgCI

2 ja 4,5 mg /ml glukoosi). Affiniteetti TLS11a määritettiin inkuboimalla LH86-solut (10

5) jäillä 30 minuutin ajan eri pitoisuuksia biotiini-leimattua TLS11a sitomispuskuriin (100 ui). Sitten solut pestiin kahdesti pesupuskurilla (1,0 ml) ja suspendoitiin fluoreskeiini-leimatulla streptavidiinilla (0,1 ml) ja inkuboitiin vielä (15 min jäillä). Ennen virtaussytometria-analyysiä varten solut pestiin pesupuskurilla kahdesti ja suspendoitiin pesupuskurissa (0,2 ml). Keskimääräinen fluoresenssi-intensiteetti soluja käytettiin laskettaessa tasapainodissosiaatiovakio (Kd) on TLS11a ja LH86 solujen vuorovaikutus sovittamalla riippuvuus fluoresenssin intensiteetti (F) pitoisuus biotiini-leimattu TLS11a (L) ja yhtälö F = BMAX [L] /(Kd + [L]). Sitoutumiskokeessa Kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa.

seurata sitoutumisaffiniteettia TLS11-GC, kilpailu koe suoritettiin. Lyhyesti, 200 nM TLS11a-GC inkuboitiin LH86 soluja 20 minuutin ajan jäillä, ja sen jälkeen 1 uM biotiini-leimattu TLS11a lisättiin 15 min ja vielä inkubointi. Sitten solut pestiin kahdesti pesupuskurilla (1,0 ml) ja suspendoitiin fluoreskeiini-leimatulla streptavidiinilla (0,1 ml) ja inkuboitiin vielä (15 min jäillä). Ennen virtaussytometrianalyysissä solut pestiin pesupuskurilla kahdesti ja suspendoidaan pesupuskurissa (0,2 ml).

Assessment of Cell sisäänotto Dox konfokaalimikroskopiaa

konfokaali kuvantaminen, doksorubisiini tai aptameeriin -Dox konjugaatteja inkuboitiin LH86 yksisolukerros on 35-mm: n lasin pohja viljelymalja (Mat Tek Corp.) DMEM-väliaineeseen 37 ° C: ssa 1 h. Pesun jälkeen kerran käyttäen media, tuoretta väliainetta lisättiin annoksia vielä 3 h inkuboinnin jälkeen 37 ° C: ssa. Sitten ruokia solut yläpuolella 40 x tavoite Olympus FV500-IX81 konfokaalimikroskoopilla (Olympus America Inc., Melville, NY). Vain 5 mW, 488 nm Ar + laser käytettiin sitten viritykseen doksorubisiinin. Tavoitteena käytetään kuvantamiseen oli Olympus LC Plan F1 40X /0,60 ph 2 40 x tavoite.

MTS solunelinkykyisyysmääritys

Kemosensitiivisyys on LH86 on Dox tai aptameeri-Dox konjugaattien määritettiin käyttämällä CellTiter 96 soluproleferaatiomäärityksessä (Promega, Madison, WI, USA). Lyhyesti, 100 ui alikvootti LH86-soluja (5 x 10

4 solua /ml) ympättiin 96-kuoppalevyille (

n

= 3), ja annettiin kasvaa yön yli. Jälkeenpäin soluja käsiteltiin 100 ui: 1) kontrolli aptameerin TD05-GC, 2) aptameerin TLS11a-GC, 3) Dox, 4) TD05-GC-Dox fyysinen konjugaattia (25:1 doksorubisiini ja TD05-GC moolisuhde) tai 5) TLS11a-GC-Dox fyysinen konjugaattia (25:1 Doksorubisiini on TLS11a moolisuhde) 1 tunnin ajan, pestiin ja inkuboitiin edelleen tuoretta väliainetta yhteensä 48 tuntia. Sytotoksisuuden mittaukseen, media poistettiin kustakin kuopasta, ja sitten CellTiter-reagenssia (20 ui) ja media (100 ui) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 3 tunnin ajan. Käyttämällä (TECAN Safire mikrolevynlukijaa, AG, Sveitsi), imeytyminen kirjattiin 490 nm. Prosenttiosuus solujen elinkelpoisuus määritettiin vertaamalla Dox ja aptameeri-Dox-konjugaatti-käsiteltyjen solujen kanssa käsittelemätön kontrolli.

Hoechst 33258 Värjäys varten apoptoottiset solut

Solun apoptoosia määritettiin tuman morfologian muutosta. LH86 solut eksponentiaalisen kasvun pantiin 48-kuoppalevylle, jonka lopullinen pitoisuus on 1,5 x 10

4 solua kuoppaa kohti. 12 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla TD05-GC-Dox fyysinen konjugaattia (25:1 doksorubisiini ja TD05-GC moolisuhde) tai TLS11a-GC-Dox fyysinen konjugaattia (25:1 Doksorubisiini on TLS11a moolisuhde) 1 tunti, pestiin ja inkuboitiin edelleen tuoretta väliainetta yhteensä 48 tuntia. Sen jälkeen solut pestiin kahdesti PBS: llä ja värjättiin Hoechst 33258 värjäys mukainen ratkaisu valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa 10 minuutin ajan, solun tumassa pirstoutumista /kondensaatio havaittiin fluoresenssimikroskopialla. Apoptoottista solukuolemaa arvioitiin laskemalla apoptoottisten solujen määrässä tiivistetyn ytimien kuudesta kahdeksaan satunnaisesti valituilla alueilla. Tulokset on esitetty edustavat kolmen erillisen kokeen.

Western-blottaus-analyysi

Solut kerättiin ja pestiin kahdesti fosfaattisuolaliuospuskuriin. Solupelletit suspendoitiin uudelleen lyysipuskuriin, joka sisälsi Nonidet P-40 (10 mM HEPES, pH 7,4, 2 mM EGTA, 0,5% Nonidet P-40, 1 mM NaF, 1 mM NAvó

4, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 1 mM ditiotreitolia, 50 ug /ml trypsiini-inhibiittoria, 10 ug /ml aprotiniinia, ja leupeptiiniä) ja inkuboitiin jäissä 30 min. Kun oli sentrifugoitu 12000 x g 4 ° C: ssa 15 min, supernatantti siirrettiin uuteen putkeen, ja proteiinipitoisuus määritettiin. Vastaavat näytteet (20 ug proteiinia), alistettiin SDS-PAGE 12% geeleillä. Proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvoille ja tutkittiin, jossa on esitetty ensisijaisen vasta-aineita (pilkotaan kaspaasi-3-vasta-aine, Cell Signaling Technology, Inc.), jota seuraa sopiva sekundaarisia vasta-aineita, jotka on konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin (HRP, Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Immunoreaktiivisia vyöhykkeet havaittiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssin (ECL, Pierce). Molekulaarinen koot proteiinien havaittiin määritettiin vertaamalla edeltäkäsin värjättyjä proteiinien markkereita (Bio-Rad). Kaikki band tiheydet laskettiin ImageJ ohjelmistoa.

In vivo

kokeessa

NOD. Cg-Prkdc (SCID) IL2 hiiriä hankittiin Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) ja sijoitettu eläimen laitokseen Floridan yliopistossa institutionaalisten viranomaisten hyväksyntää (Institutional Animal Care ja käyttö komitea). Tutkimus hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitea hyväksyvästi ID IC00001331. Kolmekymmentä NOD. Cg-Prkdc (SCID) IL2 hiiriin injektoidaan subku- 7 × 10

6

in vitro

-propagated LH86 soluja. Kun kasvaimet voidaan helposti nähdä ja mitata, hiiret jaettiin kolmeen ryhmään: (1) ryhmä 1, käsittelemättömät; (2) ryhmä 2, käsiteltiin ilmaiseksi Dox; ja (3) ryhmä 3, hoidettiin TLS11a-GC-DOX monimutkainen. Doksorubisiinin annos pidettiin samana ryhmissä 2 ja 3 2 mg /kg. Kaikki hoidot jatkettiin 11 päivää. Lääkeaineet injektoidaan häntälaskimoon päivinä 1, 2, 3, 4, 5, 9, 10, ja kaikki näytteet kerättiin päivänä 11 kasvaimen koko kullekin hiirelle mitattiin joka toinen päivä. Sydän-, keuhko-, maksa-, munuais- ja kasvaimen kunkin hiiren kerättiin päivänä 11 ja kiinnitettiin käyttämällä 10% formaliinilla 24 h huoneen lämpötilassa, ja sitten hematoksyliinillä ja eosiinilla (H & E-värjäys) suoritettiin.

tukeminen Information

Kuva S1.

Konfokaaliset kuvia Aptameerin värjäyksen viljellyt LH86 soluihin. Soluja inkuboitiin aptameeriin konjugoitu biotiiniin, ja sitova tapahtuma havaittiin AlexaFluor 633-konjugoitua streptavidiinia. Ei-sitovat sekvenssi TD05 osoitti tausta sitova. Aptameerit osoittavat merkittävää sitoutumista yli taustan signaali.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0033434.s001

(TIF) B Kuva S2.

Alustava määritys tyypin solun pinnan molekyyli, joka sitoutuu TLS11a.