Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ptp4a3

(yleisesti tunnettu PRL-3) on arvoituksellinen jäsen ja

Ptp4a

perheen prenyloituja proteiinin tyrosiinifosfataasien, jotka ovat erittäin ilmaistaan ​​monissa ihmisen syövissä. Huolimatta vahvat korrelaatiot tuumorimetastaasin ja huono potilaan ennuste on hyvin rajallinen ymmärrys tämän geeniperheen roolia maligniteetti. Siksi loimme geenin kohdennettu hiiren Knockout malli

Ptp4a3

, laajimmin tutkittu

Ptp4a

perheenjäsen. Hiiret puutteellinen varten

Ptp4a3

olivat selvästi normaalia. Vähemmän homotsygoottinen-null urokset havaittiin vieroituksen kuitenkin ja ne säilyttäneet vähentynyt painoindeksi. Vaikka

Ptp4a3

normaalisti liittyy myöhäisvaiheen syövän ja etäpesäkkeitä, havaitsimme lisääntynyt

Ptp4a3

ilmentymistä paksusuolessa villityypin hiirten välittömästi hoidon jälkeen syöpää azoxymethane. Tutkia roolia

Ptp4a3

vuonna maligniteetti, käytimme yleisimmin tutkittu hiiren koliitti liittyvä paksusuolensyöpä malli. Villityypin hiirillä, joita hoidettiin azoxymethane ja dekstraaninatriumsulfaatti kehitetty noin 7-10 kasvaimia hiirtä kohden distaalisessa paksusuolessa. Tuloksena kasvainkudoksessa oli 4 kertaa enemmän

Ptp4a3

mRNA suhteessa normaaliin paksusuolen epiteelin ja lisääntynyt PTP4A3 proteiinia.

Ptp4a3-

null hiirille kehittyi 50% vähemmän koolontuumoreissa kuin villityypin hiirillä altistuksen jälkeen azoxymethane ja dekstraaninatriumsulfaatti. Kasvaimet alkaen

Ptp4a3

-null hiirillä oli kohonneet Sekä IGF1Rβ ja c-MYC verrattuna kasvaimiin täynnä

Ptp4a3,

viittaa parannettu solu signalointireitin sitoutuminen puuttuessa fosfataasi. Nämä tulokset tarjoavat ensimmäisen lopullisen todisteita siitä

Ptp4a3

paksusuolen kasvainten synnyssä ja painottaa näiden arvo fosfataasin terapeuttisena kohteena varhaisen vaiheen pahanlaatuinen sairaus.

Citation: Zimmerman MW, Homanics GE, Lazo JS (2013) Kohdennettu deleetio etäpesäke liittyvää fos-

Ptp4a3

(PRL-3) Estää Hiiren Colon Cancer. PLoS ONE 8 (3): e58300. doi: 10,1371 /journal.pone.0058300

Editor: Manlio Vinciguerra, University College London, Iso-Britannia

vastaanotettu: 22 marraskuu 2012; Hyväksytty: 01 helmikuu 2013; Julkaistu: 28 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Zimmerman et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä oli rahoittama National Institutes of Health avustuksen AA10422 ja keskinäisessä F31AA019597A. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

proteiinityrosiinifosfataasi-4a3 (

Ptp4a3

) sekä

Ptp4a1

ja

Ptp4a2

, käsittävät 4a-perheen proteiinin tyrosiinifosfataasien. Tämä vaatimaton geeni perhe on yleisesti kutsutaan fosfataasit regeneroimaan maksan (PRL), koska löytö

Ptp4a1

on uudistava maksasoluja hiirien seuraavaa osittaista hepatektomiaa [1]. Merkittävä homologia ( 75% aminohappojen identtisyys) joukossa

Ptp4a

perheenjäsenet voivat osoittavat samanlaisia ​​entsymologiaa mutta kaikki kolme perheenjäsenet ovat säilyneet koko nisäkäslajeista, mikä viittaa ei-tarpeeton biologisia rooleja jokaiselle.

in vivo

ominaisuudet ja tehtävät näistä arvoituksellisia fosfataasien edelleen huomattavan huonosti.

Kiinnostus

Ptp4a3

voidaan katsoa johtuvan sen huomattava potentiaali biomarkkerina ja terapeuttisena kohdistaa pahanlaatuinen syöpiä. Monet ihmisen syövissä ilmentävät korkeita PTP4A3 tasolla mukaan lukien paksusuoli- [2], rintojen [3], munasarja [4], maksa [5], vatsa [6], ja strooman [7], ja kohonnut PTP4A3 ilmaisun usein korreloi lisääntynyt kasvain invasiivisuus ja huonon ennusteen [8]. Lisäksi kohdunulkoinen PTP4A3 yliekspressio parantaa kasvainsolun muuttoliikettä ja invaasiota

in vitro

[9]. Vaikka lopullinen näyttö puuttuu,

Ptp4a3

on ehdotettu moduloivan useiden signaalireittien, joihin SRC [10], Rho GTPaasit [9], ja PI3K-Akt [11] eri syövän muotoja. Monimutkaisuus koulutusjakson muutokset havaittiin, kun

Ptp4a3

on yli-ilmentynyt voi myös heijastaa sen kykyä toimia fosfatidyyli 5-fosfataasia [12]. Raportteja ei lopullisesti osoitettu rooli

Ptp4a3

fysiologiassa normaalien solujen tai kudosten.

azoxymethane (AOM) on procarcinogen että kun metaboloituu paksusuolessa on mutageeninen ja ajaa kasvaimen kehittymisen. AOM yhdessä limakalvotulehdusta dekstraaninatriumsulfaatti (DSS) tuottaa laajasti käytetty hiirimallissa että uskollisesti jäljittelee paksusuolen syöpäsairauksia vetämänä kroonisia tulehdustiloja kuten haavainen paksusuolen tulehdus [13]. Useat signalointireiteissä on patogeneesiin AOM aiheuttaman paksusuolen syöpä, mukaan lukien KRAS [14], β-kateniinin [15], c-MYC [16], Insulin-like Growth Factor-1-reseptorin β (IGF1Rβ) [17], ja transformoivan kasvutekijän β (TGFli) [18]. Mielenkiintoista,

Ptp4a3

on tunnistettu suoraan sääntelyn kohteena TGFp signaloinnin paksusuolen syöpä [19].

Nykyisessä tutkimuksessa käytimme geeni kohdistamisen lähestymistapa tuottaa joilta puuttuu

Ptp4a3

ja kuulustella mahdollista asemaa

Ptp4a3

paksusuolen kasvainten synnyssä. AOM altistus akuutisti lisääntynyt

Ptp4a3

ilmentymistä paksusuolessa.

Ptp4a3

-null hiiret olivat resistenttejä paksusuolen tuumorigeneesiin syytetään tämän geenin patogeneesissä pahanlaatuisen sairauden. Lisäksi kasvaimet johdettu

Ptp4a3

-null hiiret overexpresssed syöpä liittyy IGF1Rβ ja c-MYC viittaa edistää näiden onkogeenisten signalointireittien.

Tulokset

luominen Ptp4a3 mutanttihiirien

häiritsi

Ptp4a3

genomista lokukseen käyttäen Cre-lox järjestelmä paikkakohtaisten rekombinaatio sijainnin perusteella kahden asetettu loxP (Fig. 1A ja yksityiskohtaisemmin kuvassa. S1) . Mutant hiiret takaisinristeytettiin C57BL /6J-kannan vähintään viiden sukupolven ajan. Knockout-alleeli luotiin risteyttämällä

Ptp4a3-

floxed-hiirten siirtogeenisiä hiiriä, jotka ekspressoivat CRE-rekombinaasia, jota ohjataan yleisesti promoottorin (EIIA) yhdistää uudelleen kohdepaikan ja luoda maailmanlaajuinen hiirten [20]. Insertio 3’oxP tuhotaan endogeenisen HindIII kasvaa koko genomi-DNA-fragmentti on tuotettu restriktiopilkonnalla 5,6-10,2 kb. Myöhemmin poistetaan kohdesekvenssin vähensi restriktiofragmentin koko 10,2-6,4 kb. Erillinen vyöhyke koot vastaavat jokaista alleelin havaitaan, kun analysoidaan Southern blot hybridisaatio -300 emäsparin koetin vastaa eksonia 6 (Fig. 1 B).

)

Ptp4a3

floxed alleeli oli luotu lisäämällä loxP (punainen nuolenpäät) noin eksonin 2. Tämä mutaatio johti häiriöitä Hindlll-sekvenssin, joka lisää koko DNA-fragmentin tuotettu restriktiopilkonnalla 5,6-10,2 kb. Ekspression jälkeen Cre-rekombinaasin, välinen sekvenssi loxP poistetaan jättäen yhden loxP päällä ja koon pienentäminen restriktiofragmentin 6,4 kb. Tämä mutaatio johtaa poisto aloituskodonin aiheuttaa lukukehyksen tuottaa funktionaalinen proteiini tuote. B) Southern blot-analyysi genomisen DNA: ta käytettiin seuraamaan näitä geneettisiä muutoksia ja genotyyppi hiiret, jotka sisältävät villityypin, floxed tai Knockout alleelit. Kukin kaista on yksittäisen hiiren. C) Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi kokonais- mRNA sikiön sydämen kudoksesta paljastanut mitään muutosta

Ptp4a1

ja

Ptp4a2

mRNA kun

Ptp4a3

vähennettiin eikä havaittavissa heterotsygoottinen ja homotsygoottinen-null kudosta, vastaavasti. (* = P 0,05; n = 4 /genotyyppi). D) PTP4A3 proteiinituote oli havaittavissa Western blot kokonaan proteiinin teissa villityypin ja heterotsygoottisia sikiön sydämen kudoksen, mutta ei homotsygoottisia

Ptp4a3-

null näytteitä.

analyysi 500 pentua, jotka ovat tuottaneet heterotsygoottinen pariutumisen paria ilmoitetaan kaikki mahdolliset genotyypit havaittiin jälkeläiset. Vaikka naisilla havaittiin odotettu Mendelin suhdeluvut, olemme huomanneet merkittävää vähenemistä (p 0,05) määrä

Ptp4a3

-null urokset vieroituksen suhteessa ennustettu taajuus (taulukko 1). Koska tämä toteamus, on mahdollista, että tyrmäyksellä miehillä joko hallussaan selviytymisen haitta tai että

Ptp4a3

-null sukusoluilla oli ennakkokäsitys fenotyyppi.

Ptp4a3

-null uroshiirillä osoittivat noin 10% lasku painoindeksi (p 0,003) ja 7%: n lasku painoindeksi (p 0,004) verrattuna villityyppiin littermates 6 vk iässä (kuvio. S2). Tämä fenotyyppi esiintyi myös rajoittua uroshiirille kuin naisten

Ptp4a3

-null hiiret eivät osoittaneet merkittävää laskua painoindeksi tai painoindeksi.

Koska sikiön sydämen kudos oli on aikaisemmin ehdotettu on korkea

Ptp4a3

ilmaisun [21], seuraavan kerran suoritetaan kvantitatiivinen RT-PCR: llä kokonais-RNA-näytteet sikiön sydänkudoksen (E19.5) määrittää suhteelliset mRNA-tasot

Ptp4a1

,

Ptp4a2,

ja

Ptp4a3.

Vaikka

Ptp4a1

ja

Ptp4a2

pysyivät samanlainen genotyyppien,

Ptp4a3

mRNA väheni heterotsygoottinen kudokseen eikä havaita näytteissä

Ptp4a3

-null sikiön sydämen kudoksen (Fig. 1 C). Siten korvaus

Ptp4a3

menetystä säätelyä joko perheenjäsenten

Ptp4a1

tai

Ptp4a2

mRNA-tasolla suljettiin pois. Proteiini lysaatit sikiön sydänkudoksen analysoitiin Western blottauksella läsnäolon PTP4A3 proteiinituotteen. Vaikka havaittavissa näytteissä villityypin alkioista, PTP4A3 oli alhaisempi lysaateissa Heterotsygoottisista alkioista ja homotsygoottisia-null kudos ei sisältänyt havaittavia PTP4A3 (Fig. 1 D). Sen lisäksi edellä mainitut fenotyyppiset huomautukset, hiiret ilman toiminnallisia

Ptp4a3

näyttivät selvästi normaalia suhteessa villityyppiin littermates.

Expression and knockout of Ptp4a3 hiiren kudoksissa

Koska endogeenistä PTP4A3 proteiinin normaaleissa kudoksissa ei ole hyvin tunnettu, tutkimme kudosproteiini- näytteiden villityyppistä ja

Ptp4a3

-null hiirillä. Ensin analysoidaan useita kudosta tyypit PTP4A3 proteiinin ilmentymisen Western blotilla (kuvio. S3). Sikiön sydämen, sikiön suolistossa, aikuisen sydämen, luurankolihaksessa, haimassa, keuhkoissa, pernassa, aivot, kateenkorva, paksusuoli ja ohutsuoli ilmaisivat havaittavia määriä PTP4A3 toisin maksan ja munuaisten, jossa ei ollut havaittavaa PTP4A3 proteiinia. Nämä tulokset vahvistavat myös, tehoa maailmanlaajuisen geenin deleetio lähestymistapaa, koska ei PTP4A3 proteiini ei ollut havaittavissa missään lysaatit

Ptp4a3

-null hiirillä. Histologinen analyysi suoritettiin myös villityypin ja

Ptp4a3

-null kudosnäytteistä (Fig. S4). Kun tarkastellaan useita kudostyyppejä, ei avoimien poikkeavuuksien havaittu ja kaikki näytteet näyttivät laadullisesti normaali.

Ptp4a3 ilmaisun kasvaa heti AOM altistuksen

Koska alhainen PTP4A3 oli havaittavissa normaalissa paksusuolen epiteelin, me määritettiin

Ptp4a3

geenin ilmentymisen välittömästi hoidon jälkeen suoliston procarcinogen AOM (12,5 mg /kg) tai suolaliuosta valvonta villityypin C57BL /6J-hiirissä. Hiiret tapettiin 8 ja 24 tunnin kuluttua AOM injektion ja paksusuolen epiteelin solut kerättiin analyysiä varten. Kokonais-mRNA eristettiin ja kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin määritys

Ptp4a3

geenien ilmentymisen tasoa. Mielenkiintoista,

Ptp4a3

oli voimistunut 78% 8 tunnin ja 60% 24 tunnin kuluttua in AOM-käsitelty normaalia epiteelin suhteessa kontrolliin (Fig. 2C). Proteiini lysaatit AOM käsitellyistä hiiristä viittaavat siihen, että PTP4A3 proteiini tasot ovat myös lisääntynyt näissä kudoksissa (Fig. 2D). Vaikka rooli

Ptp4a3

paksusuolen syöpä on perinteisesti ajatellaan kuuluvan myöhäisvaiheen kasvaimia ja etäpesäkkeitä, tämä havainto viittaa mahdollisen roolin Taudin alkuvaiheessa ja kasvaimen kehittymisen.

EN) AOM -DSS hoitomuoto käytettiin tässä tutkimuksessa on kerta-annos AOM seurasi 3 hoitojaksoa DSS juomavedessä. B) Histologinen esitys normaalista paksusuolikudos suhteessa kasvainkudoksen osoittaa tehoa AOM-DSS malli. Sen jälkeen yksi sykli DSS hoidon krypta dysplasia ja mononukleaaristen solujen infiltraatiota olivat ilmeisiä. Kasvainkudoksessa oli läsnä sekä 12 ja 16 vk päätepisteet. Ennen tappamista, hiiriä käsiteltiin BrdU 4 tuntia, ja solujen lisääntyminen tehtiin näkyväksi värjäämällä BrdU-vasta-ainetta. C) Kvantitatiivinen RT-PCR: ää käytettiin määrittämään

Ptp4a3

geenin ilmentymisen normaalissa paksusuolen epiteelin kudoksen hoidon jälkeen joko AOM tai suolaliuokseen.

Ptp4a3

kohosi 73% paksusuolen kudoksessa seuraavissa mitattuna 8 tunnin kuluttua injektion ja 60% 24 h (* = p 0,001; n = 6 /hoitoryhmään baaria = SEM). D) Western blot paksusuolen lysaatit osoitti kasvua PTP4A3 proteiinia seuraavissa AOM altistumista. E) Kvantitatiivinen RT-PCR osoitti muutoksia geenien ilmentymisen tasojen

Ptp4a

perheenjäsenet normaalissa paksusuolen ja kasvainkudoksen.

Ptp4a3

kohosi 3,7-kertaiseksi (** = p 0,01), kun taas

Ptp4a1

ja

Ptp4a2

tasot olivat merkitsevästi vähentynyt (* = p 0,0001 ja p 0,05, vastaavasti) (n = 15, baareja = SEM). F) Western blot-analyysi osoittaa korkeampi PTP4A3 proteiinin tasot paksusuolen kasvaimissa verrattuna normaaliin kudokseen. G) Western blot yhdistettynä qRT-PCR-analyysi osoitti myös, että verrattaessa

Ptp4a3

mRNA-tasot (lueteltu edellä kunkin kaistan) ja PTP4A3 proteiinin, korkea geeni-ilmentymisen näytti vastaavan korkeamman proteiinin tasoja.

Knockout of Ptp4a3 estää suolen kasvainten muodostumiseen

Tutkitaan mahdollisen toiminnallista roolia varten

Ptp4a3

kasvaimen muodostumiseen, me altistetaan hiiriä laajasti käytetty AOM-DSS malli koliitti liittyvän paksusuolen syöpä. Villityypin ja

Ptp4a3

– null-hiiriin injektoitiin yhden annoksen AOM (12,5 mg /kg), jota seurasi kolme sykliä 2,5% DSS kulutus (Fig. 2A). Tämä malli tuottaa erillisiä histologisia muutoksia suhteessa normaaliin ohjaimet, mukaan lukien tulehdus vastaa DSS hoitoon, ja myöhemmin dysplasia (Fig. 2B). Kasvaimet olivat visuaalisesti ilmeinen distaalisessa paksusuolessa villityypin hiiriin uhri 12 tai 16 vk kuluttua ensimmäisen AOM hoitoon ja olivat (Fig. 2B ja 3A). Kuten kuviossa 3B,

Ptp4a3

-null hiirillä pienenemiseen 54% kasvaimen numero (p 0,004) seuraavien 16 vk hoidon. Vaikka keskimäärin vähemmän kasvaimia havaittiin 12 wk

Ptp4a3

-null hiiriä suhteessa villityyppiseen, tämä ei ollut tilastollisesti merkitsevä (p 0,2). Mielenkiintoista on, että kasvainten määrä (p = 0,05) sekä kasvaimen halkaisija (P 0,001) oli merkittävästi lisääntynyt 12-16 wk, kun taas

Ptp4a3

-null kasvaimia ei merkittävästi kasvaa lukumäärää tai kokoa. Keskimääräinen halkaisija kasvainten tuotettu malli oli 3-4 mm (Fig. 3C).

A) esittävä kuva ulkonäkö villityypin ja

Ptp4a3

-null paksusuolikudos seuraavat 16 wk hoidon kanssa AOM-DSS. B) keskimääräinen lukumäärä kasvaimia kirjattiin hiirissä genotyypin jälkeen 12 ja 16 vk hoidon. Keskimäärin kasvainten lisääntynyt merkittävästi villityypin hiirillä välillä 12- 16 wk ajankohtina (* = p = 0,05). Tänä aikana kasvainten määrä havaittiin

Ptp4a3

-null hiirillä oli sama (p = 0,70). 12 viikkoa, villityypin hiirillä (n = 6) ei ollut merkittävästi enemmän kasvaimia hiirtä kohti kuin

Ptp4a3

-null (n = 5) hiirillä (p = 0,27). 16 wk, villityypin hiiret (n = 14), joka näkyy selvästi vähemmän kasvaimia hiirtä kohti kuin

Ptp4a3

-null-hiiriä (n = 7) (** = p 0,005). C) Tuumorin koko (mitattuna kasvaimen keskimääräinen halkaisija kullekin hiirelle) määritettiin kussakin aikapisteessä. Tuumorin läpimitta havaittiin merkittävästi villityypin hiirissä 12 ja 16 viikkoa (* = p 0,001). Mitään merkittävää eroa ei havaittu

Ptp4a3

-null hiiriä 12- 16 viikkoa, tai välillä genotyyppien joko ajankohtana. Bars = SEM.

Ptp4a3 on kohonnut AOM-johdettu koolontuumoreissa

Koska korkea ilmentymä PTP4A3 on raportoitu ihmisen ensisijainen koolontuumoreissa [22], tutkimme

Ptp4a3

ekspressio hiirimallissa paksusuolen syöpä. Ensimmäinen, kokonais-mRNA uutettiin tuumorikudosta villityypin hiirissä ja kvantitatiivinen RT-PCR: ää käytettiin määrityksessä ilmaisua kunkin tason

Ptp4a

perheenjäsenen (kuvio. 2E). Suhteessa normaaliin paksusuolen epiteelin,

Ptp4a3

kohosi 3,7-kertaiseksi keskimäärin (p 0,01). Vaikka huomattava heterogeenisyys

Ptp4a3

ilmentymistä havaittiin, vaihdellen 1,4-6,7-kertainen voimistumista,

Ptp4a3

mRNA kasvainkudoksessa olivat jatkuvasti korkeampia kuin normaali kudos jokaisesta testatusta näytteestä (n = 15 ). Mielenkiintoista on, että geeni-ilmentymisen tasot

Ptp4a1

ja

Ptp4a2

olivat molemmat vaimentua 64% ja 36% (p 0,0001 ja p 0,05), vastaavasti, paksusuolen kasvaimet suhteessa normaaliin kudokseen. PTP4A3 proteiinin tasot normaaleissa paksusuolen epiteelin lysaatit olivat hyvin alhaiset, kun määritettiin Western blottauksella (kuvio. 2F). Sen sijaan, PTP4A3 oli helposti havaittavissa, mutta vaihteleva, paksusuolen kasvain näytteissä. Kuten voidaan olettaa, näytti olevan jonkin verran korrelaatiota PTP4A3 proteiinin tasot ja mRNA-tasot (kuvio. 2G). Puute toimivia vasta-aineita varten PTP4A1 ja PTP4A2 esti pitämästä arvioidaan tuumoriproteiinia tasot näiden perheenjäseniä.

Menetys Ptp4a3 lisää IGF1Rβ ja c-MYC ilmentyminen kasvaimissa

tutkimme seuraavaksi lysaatit saatu sekä villityypin ja

Ptp4a3

-null koolontuumoreissa. Ensin käytetään käänteisfaasi- proteiinijärjestelmäksi määrittämään tasoa yli 130 erilaista proteiinia tuotteiden sisältämä villityypin ja

Ptp4a3

-null kasvaimia (Fig. S5). Vaikka proteiinin tasot näiden kasvainten esillä huomattavaa heterogeenisyyttä, kaksi tunnettua onkogeeniset signalointia proteiinien, reseptori tyrosiinikinaasin IFG1Rβ ja transkriptiotekijä C-MYC esitettiin korkeammalla tasolla

Ptp4a3

-null kasvaimia (Fig. 4A). Sen jälkeen kvantifiointiin, IGF1Rβ proteiini oli keskimäärin 2,1-kertainen (p 0,001) ja c-MYC oli noin 2,5-kertainen (p 0,02) in

Ptp4a3

-null suhteessa villityyppiseen koolontuumoreissa (Fig. 4B-C). Sitä vastoin emme havaita merkittävää eroa AKT aktivointi välillä genotyyppien (Fig. 4D). Tämä tulos viittaa siihen, että tuumorit voivat mahdollisesti kompensoida

Ptp4a3

puutos vaikka muuttunut signalointireitteihin.

A) Cluster näyte heatmap tuotetaan RPPA analyysi, joka suoritettiin käyttämällä paksusuolen kasvain lysaatit AOM-DSS käsitelty villityypin ja

Ptp4a3

-null hiirillä. Proteiinikohteiden olivat joko korkeampia (keltainen), alempi (sininen), tai muuttumaton (musta). B) Proteiini tasot vahvistettiin Western blot -analyysillä paksusuolen kasvaimen lysaatit villityypin ja

Ptp4a3

-null hiirillä. IGF1Rβ ja c-MYC-proteiinia valittiin, koska ne näyttivät olevan kaikkein johdonmukaisesti yliaktiivista proteiinien

Ptp4a3

-null näytteitä. C) Kun määrällisesti, IGFIRβ proteiini tasot olivat 2,1 kertaa suurempi

Ptp4a3

-null kasvaimet (p 0,001). D) c-MYC-proteiinia pitoisuudet olivat 2,5-kertaisesti korkeampi

Ptp4a3

-null kasvaimet (p 0,02). E) tasot aktivoitu AKT, kuten fosforylaatio Ser473, eivät olleet merkittävästi erilaiset genotyypin suhteen yhteensä Akt-proteiinia.

Keskustelu

määrä geenejä on implikoitu kehittämisessä ja etenemisen peräsuolen syöpä. Edellinen geeniekspressioprofilointi tutkimuksissa todettu 144 geenejä, jotka säädellään ylöspäin metastasoitunutta kolorektaalisyöpää maksan näytteet [2]. Ainoa geeni kuitenkin, että oli johdonmukaisesti koholla kaikissa metastaattisen näytteistä oli

Ptp4a3

. Sekä geenimonistus ja parannettu transkriptioaktiviteettia todennäköisesti syy, että korkea. Huolimatta näennäinen merkitys

Ptp4a3

kasvaindiagnostiikassa, ymmärrystämme toimivuudesta

Ptp4a3

on erikseen rajattu johtuu osittain ilman informatiivinen eläinmalleissa. Geeni suunnattu hiirimallissa häiriöitä

Ptp4a3

genomista lokukseen että olemme kehittäneet on hyötyä paitsi tutkimalla fenotyyppisten muutoksia, jotka tapahtuvat maailmanlaajuisen menetys fosfataasin, vaan myös tulevia tutkimuksia kudosten ja ajallista erityinen geeni poistetaan ja yhteistyöhön vuorovaikutus muiden geenien myös kaksi muuta jäsentä

Ptp4a

perhe. Mallimme vahvistetaan, että hiiret voi selvitä ilman toiminnallisen

Ptp4a3

geeni, joskin hieman pienempi määrä mies hiirille, ja ne pystyvät elämään juoksuaika normaalioloissa ilman suuria terveyteen puutteita . Tämä on päinvastoin kuin mitä on raportoitu hiirillä, joilta puuttuu erittäin homologisia

Ptp4a2,

minkä uskotaan olevan kaikkein ekspressoituvat perheenjäsen normaaliolosuhteissa.

Ptp4a2

-null hiirten puutteellinen istukan kehitys ja molempia sukupuolia osoitti kasvun hidastumista klo alkion ja aikuisen vaiheissa [23].

Ptp4a2

tappio pienentää spongiotrophoblast ja decidua kerroksia istukan haittaavaa ravinteiden kulkeutumista ja aiheuttaa alkion kasvun hidastumista. Lisäksi menetys

Ptp4a2

tuloksia AKT inaktivaation, mikä ei ollut ilmeistä meidän koskevat tiedot

Ptp4a3

menetys. Yhdessä erot kahden geenin poisto mallit ovat yhdenmukaisia ​​ei-päällekkäisiä toimintoja näiden kahden lähellä fosfataasin perheenjäsenet.

poistaminen PTP4A3 proteiinin varmistettiin Western blot -analyysillä käyttämällä erilaisia ​​kudosta lysaatit villityypin ja

Ptp4a3

-null hiirillä. Vaikka aluksi tutkimukset oli ehdottanut

Ptp4a3

ilmentyminen rajoittui sydämen, luuston lihaksen, ja haima [24], meidän data paljasti enemmän läsnä ilme kuvio. Vaikka korkeimman PTP4A3 havaittiin sikiön sydämen, proteiini oli havaittavissa myös alemmilla aikuisen sydämessä, luurankolihaksessa, perna, haima, aivot, keuhkot, kateenkorva, paksusuoli ja ohutsuoli; ei PTP4A3 proteiini oli havaittavissa maksan tai munuaisten.

Koska ihmisen PTP4A3 on ollut patogeneesiin Ihmisen metastaattinen kolorektaalisyöpä, tutkimme vaikutuksia

Ptp4a3

poistetaan hiirimallissa paksusuolen syöpä. Hoito AOM /DSS on yksi suosituimmista paksusuolen kasvain hiiri malleja ja C57BL /6J-kannan, jota tämä malli oli takaisinristeytettiin on erityisen altis koliittia liittyviä syöpään [13], [16], [17].

Ptp4a3

on perinteisesti luokiteltu liittyvän geenin etäpesäkkeitä eikä tiedetään liittyvän alkuvaiheessa syövän etenemistä. Nykyisessä tutkimuksessa olemme osoittaa, että

Ptp4a3

mRNA ja PTP4A3 proteiinin arvo nousee pian altistumisen jälkeen AOM, aloittava askel paksusuolensyöpä malli. Tämä on tärkeää näyttöä siitä PTP4A3 voitaisiin myös mukana esineoplastiset vaiheessa maligniteetti.

Hiiret altistettiin AOM /DSS malli johdonmukaisesti kehitetty kasvaimia distaalisessa alueella paksusuolen. Näiden primaaristen kasvainten näytetään jatkuvasti korkeampia

Ptp4a3

suhteessa normaaliin paksusuolen epiteelin – samanlainen kuin mitä nähdään ihmisen paksusuolen syövän potilaille [22]. Erityisesti hiiret puutteelliset varten

Ptp4a3

oli 50% vähennys kasvaimen muodostumiseen tarjoaa lisätodiste siitä, että

Ptp4a3

on keskeinen välittäjäaine paksusuolen syövän etenemisessä. Kuitenkin täydellinen puuttuminen PTP4A3 fosfataasi oli riittämätön poistaa paksusuolen kasvaimen kehittymisen, mikä viittaa siihen, että osajoukko kasvaimia ei voi vaatia

Ptp4a3

kuin kuljettaja taudin. Tätä tukee havainto, että ei kaikki kasvaimet tässä mallissa oli korkea ( 2-kertainen säätelyä)

Ptp4a3

ekspressiotasoja.

eläinmalli Olemme kehittäneet esittelee ainutlaatuisen mahdollisuuden puuttua rooli

Ptp4a3

kasvaindiagnostiikassa. AOM altistuminen aiheuttaa DNA-vaurioita ja genotoksinen stressi. Merkittävä vaste DNA vaurio on induktio

p53

, mikä voi aiheuttaa

Ptp4a3

ilmaisun [25] ja se voi antaa selityksen induktioon

Ptp4a3

paksusuolessa AOM käsitellyillä hiirillä. Lisäksi

Ptp4a3

on tunnistettu suoraan sääntelyn kohteena TGFp signaloinnin koolonkarsinoomasoluissa. Aktiivisen TGF-signaali indusoi Smad3 /4 sitoutumisen

Ptp4a3

genomisen lokuksen ja siten estämällä geenin transkription [19]. Menetys TGFp on usein havaittu ilmiö ihmisen paksusuolen syöpä [26], samoin kuin AOM hiirimallissa paksusuolensyöpä [18]. On todennäköistä, että tämä tapahtuma vaikuttaa kohonnut

Ptp4a3

geeniekspression syöpä Smad3 /4 inaktivointia. On kiinnostavaa, että hiiren malli puutteellinen ja

Smad3

on raportoitu spontaanisti kehittää paksusuolen syöpä [27], ja

Smad4

puute pahentaa suu- resti hiirimallissa paksusuolensyöpä [28]. Muodostuminen uudisvaurioiden

Ptp4a3

-null hiiret voivat olla seurausta värväämään lisää kasvutekijän signalointireittien tai onkogeenien, kuten IFG1Rβ ja c-MYC. c-MYC tiedetään lisätään kasvaimia jälkeen AOM /DSS hoitoon ja sekä IFG1Rβ ja c-MYC olivat huomattavasti koholla

Ptp4a3

-null kasvaimia suhteessa villityyppiin peräisin kasvaimiin.

Vaikka

Ptp4a3

geenituotteen aluksi ajateltiin olevan osallisena tuumorimetastaasissa ja myöhäisessä vaiheessa tauti, tuloksemme tuottaa näyttöä mahdollisista rooleista muissa vaiheissa taudin lukien preneoplasti- muutosta ja varhaisen syövän syntymistä. Käsite terapeuttisesti kohdistaminen

Ptp4a3

voisi siis olla houkutteleva useissa vaiheissa syöpä.

Materiaalit ja menetelmät

luominen

Ptp4a3

mutanttihiirissä

ehdollinen geeni-Kohdennusvektoria rakennettiin käyttäen faagi-pohjainen

E. coli

uudelleenyhdistelyjärjestelmässä [29]. Erityisiä yksityiskohtia koskien vektorin rakentaminen ja kohdistusstrategia kuvataan kuvassa. S1. Olemme erityisesti kohdennettu eksoni 2, koska se sisälsi transkription aloituspaikan ja oli tarpeen asianmukaisen käännös mRNA transkriptin. Sen jälkeen transfektointi konstruktilla osaksi R1 alkion kantasolujen [30], hiiret luotu oikein kohdennettuja klooneista tavallisilla kimeerisen eläimen tuotantotekniikkaa C57BL /6J blastokysteihin. Romaani-kanta takaisinristeytettiin C57BL /6J (The Jackson Laboratory) ja 5 sukupolvea ja hiiret kokeisiin valmistettiin käyttämällä heterotsygoottinen pesivää paria. Genotyypitys suoritettiin Southern blot-analyysi, jossa on radioaktiivisesti koetin, joka vastaa -300 bp: n eksonin 6, joka oli ulkopuolinen geeninkohdennusvektori. Tutkimus toteutettiin suositusten mukaisesti oppaasta Care ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Kaikki asiaankuuluvat pöytäkirjat hyväksyttiin Institutional Animal Care ja käyttö komitea University of Pittsburgh.

AOM syöpä malli

villityypin ja

Ptp4a3

-null hiiriä (uros, 6 -8 viikkoa) annettiin kerta-annos AOM (12,5 mg /kg) (Sigma) steriiliin suolaliuokseen IP injektiona. DSS-liuosta (2,5%) (MP Biomedicals) annettiin

mielin määrin

7 d seurasi 14 d normaalia juomaveden ja tämä sykli toistettiin kaikkiaan 3 kertaa [13]. Kokeellinen hiiret lopetettiin 12 tai 16 wk jälkeen hoidon aloittamista, missä pisteessä paksusuolen kudosta eristettiin, huuhdeltiin, ja avattiin pituussuunnassa analyysiä varten. Tuumorin ja normaalin kudoksen oli joko jäädytettiin nestetypessä tai upotetaan 10% neutraaliin puskuroituun formaliiniin. Kunkin hiiren yksittäisen kasvaimet laskettiin ja mitattiin digitaalisen paksuus ja kasvaimen keskimääräinen lukumäärä ja läpimitta on määritelty jokaiselle genotyypin.

Western blot-analyysi

soluja ja kudoksia hajotettiin käyttäen RIPA-puskurilla ja kvantifioidaan Bradfordin menetelmällä. Kaikkiaan proteiini näyte 40 ug erotettiin käyttäen Novex SDS-PAGE-reagenssit (Invitrogen) ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Kalvot blokattiin Odyssey puskurissa (Licor Biosciences) ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla yhdessä yössä seurasi sekundaarinen fluoresoiva vasta mukaan valmistajan ohjeiden. Käytimme seuraavia kaupallisesti saatavissa ensisijainen vasta: PTP4A3 klooni 318 (Santa Cruz Biotechnology), GAPDH, IGF1Rβ, c-MYC, p-AKT (S473), ja AKT (Cell Signaling Technology).

kvantitatiivinen RT- PCR

Kokonais-RNA uutettiin kudoksesta käyttäen Trizol-reagenssia kohti valmistajan protokollaa (Invitrogen). Yhteensä 500 ng mRNA: ta muutettiin cDNA: ksi käyttäen iScript ensimmäisen juosteen synteesiin kit (Bio-Rad). Alukkeet (taulukko. S1), jota käytetään monis- laimennettiin lopulliseen konsentraatioon 500 pM, ja reaaliaikainen seuranta PCR-reaktio suoritettiin Biorad iQ5 thermocycler 2X SYBR Green Mastermix (Bio-Rad). Seuraava ohjelma ajettiin 40 sykliä: 95 ° C 00:30; 58 ° C 01:00; ja 72 ° C 0:30.

Käänteisfaasi proteiinijärjestelmäksi

Protein lysaatit (100 ug kutakin) paksusuolen kasvain näytteistä (n = 5 /genotyyppi) denaturoitiin ja kuljetetaan jäädytetty MD Anderson Cancer Center (Houston, TX) analysoitavaksi. Lyhyesti, lysaatit oli kaksi-sarja- laimennettiin 5 laimennuksia ja järjestetty nitroselluloosalle päällystetty dioja, vasta-aineilla, ja visualisoitiin diaminobentsidiini kolorimetrisen reaktion. Suhteellinen proteiinin tasot kullekin näytteelle määritettiin interpoloimalla jokaisen laimennuksen käyrien standardikäyrästä vasta-dia. Kaikki datapisteet normalisoitiin Proteiinilisäyksen ja muuttuu lineaarisesti arvoon. Lineaarinen arvot muunnetaan loki2 arvoon ja sitten mediaani keskitetty hierarkkinen klusterianalyysillä. Heatmap tuotettiin Cluster 3.0 hierarkkisesta klusterin käyttämällä Pearsonin korrelaatio ja keskus metrinen (lisätietoja tarjotaan on Fig. S5).

Tilastot

Tilastollinen jälkeläisten genotyypin laskettiin Chi-Square-testin verrataan havaitut ja odotetut tulokset. Tiedot solukokeet, western blot, ja qRT-PCR kvantitatiivinen analysoitiin käyttämällä 2-tailed t-testiä. Molemmissa tapauksissa merkitys määriteltiin p≤0.05.

tukeminen Information

Kuva S1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0058300.s001

(PDF) B Kuva S2.

doi: 10,1371 /journal.pone.0058300.s002

(PDF) B Kuva S3.

doi: 10,1371 /journal.pone.0058300.s003

(PDF) B Kuva S4.

doi: 10,1371 /journal.pone.0058300.s004

(PDF) B Kuva S5.

doi: 10,1371 /journal.pone.0058300.s005

(PDF) B Taulukko S1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0058300.s006

(PDF) B

Kiitokset

Kirjoittajat kiittää Carolyn Ferguson hänen teknistä asiantuntemusta ja apua.