Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

eturauhasen epiteelisolujen riippuu androgeenien selviytymisen ja toiminta. In (varhainen) eturauhassyöpä (PCA) androgeenien säätelevät myös kasvaimen kasvua, jota hyödynnetään hormonaalisia hoitomuotojen etäpesäkkeitä. Tavoitteena tässä tutkimuksessa oli luonnehtia androgeenireseptorin (AR) vaste hormonihoidon kestävä PC346 solut ja tunnistaa mahdolliset sairauden merkkiaineita.

Menetelmät /Principal Havainnot

Ihmisen 19K oligoarrays käytettiin perustaa androgeenisäädellyn ilmentymisen profiili androgen reagoiva PC346C soluissa ja sen johdannainen hoito-resistenttejä alalinjoja: PC346DCC (surkastunut AR tasot), PC346Flu1 (AR yli-ilmentyminen) ja PC346Flu2 (T877A AR mutaatio). Kaikkiaan 107 transkriptit differentiaalisesti ilmaistut PC346C ja johdannaisten jälkeen R1881 tai hydroksiflutamidi ärsykkeet. AR-säännelty ekspressioprofiileja heijasti AR muunnoksia kunkin terapia-resistenttejä alalinjoja: AR yli-ilmentyminen johti vahvempi ja laajempi transkription vastaus R1881 stimulaatio, AR alassäätöä korreloi puutteellinen vaste AR-kohdegeenien ja T877A-mutaatio johti transkription vastauksena sekä R1881 ja hydroksiflutamidi. Tämä AR-tavoite allekirjoituksen liittyi useita julkisesti saatavilla solulinjaa ja kasvain peräisin PCa tietokantoja, paljastaen että erilliset toiminnalliset klusterit ovat eri tavoin moduloida aikana PCa etenemisen. Erilaistumista ja sekretorisen toiminnot säädellään ylöspäin ensisijainen PCa mutta tukahdutettu etäpesäkkeitä, kun taas leviäminen, solun tukirangan remontin ja tarttuvuus yli-ilmentynyt etäpesäkkeitä. Lopuksi, andro- geenien ENDOD1, MCCC2 ja ACSL3 valittiin mahdollisiksi tauti merkkiaineita RT-PCR kvantifiointiin selvä joukko ihmisen eturauhasnäytteissä. ENDOD1 ja ACSL3 osoitti alassäätö korkea-asteen ja metastaattinen PCA taas MCCC2 yliekspressoitiin heikompilaatuisen PCa.

Johtopäätökset /merkitys

AR muutokset muuttivat transkription vastaus (anti) androgeenien terapiassa-resistentit solut. Lisäksi valikoivat alas-säätely geenien erilaistumiseen ja ylössäätöä geenien edistää leviämisen ja invaasion ehdottaa häiriintynyt tasapaino kasvua ja erilaistumista toiminnot AR koulutusjakson aikana PCa etenemisen. Nämä havainnot saattavat vaikuttaa nykyisessä hoidossa ja kehittää uusia terapeuttisia lähestymistapoja metastasoineeseen PCa.

Citation: Marques RB, Dits NF, Erkens-Schulze S, van IJcken WFJ, van Weerden WM, Jenster G (2011 ) modulointi androgeenireseptorin Signaling hormonihoidossa hylkivät Eturauhassyöpä Cell Lines. PLoS ONE 6 (8): e23144. doi: 10,1371 /journal.pone.0023144

Editor: Laszlo Tora, Institute of Genetics and Molecular and Cellular Biology, Ranska

vastaanotettu: 08 joulukuu 2010; Hyväksytty: 13 heinäkuu 2011; Julkaistu: 04 elokuu 2011

Copyright: © 2011 Marques et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ esitetään tässä käsikirjoitus tukee taloudellisesti Alankomaiden Organization for Scientific Research (NWO), kautta ZonMW avustus 903-46-187, ja Alankomaiden Cancer Society (KWF), avustuksina NKB97-1479 ja DDHK 2001-2455. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on useimmin diagnosoitu ei-kutaaninen syöpään miehillä ja toinen johtava syy syöpäkuolemista länsimaissa [1]. Eturauhassyöpä on hyvin heterogeeninen ehto, jolla on laaja valikoima biologisia ja kliinisiä ilmenemismuotoja. Vaikka jotkut potilaat kehittää oireeton taudinkulku ja mieluummin kuolla syöpään kuin alkaen syöpä, toiset läsnä aggressiivisempi ja /tai kehittyneempää tautien aikaan diagnoosi [2]. Kun kasvain on ainoastaan ​​eturauhasen, se voidaan tehokkaasti hoitaa radikaaleja ja /tai sädehoitoa, mutta kun kasvain on levitetty, systeeminen hoito on tarpeen. Koska syöpäsolujen edellyttävät androgeenien niiden selviytymistä ja kasvua, kultainen standardi hoitoon välttelevä eturauhasen kasvaimia on androgeeniablaatio kemiallisella tai kirurgisen kastraation, joka voidaan yhdistää hallinnon androgeenireseptorin (AR) antagonistit [2]. Useimmat potilaat hyötyvät tästä hormonihoitoa, kasvaimet saattavat kutistua ja oireita parantaa. Kuitenkin lopulta kaikki syövät tulee vastustuskykyisiä ja uusiutua terapiana tulenkestävä tai kastraatio-resistenttejä, joille ei tällä hetkellä ole parantavaa hoitoa ei ole olemassa [3], [4]. AR polku on hyvin monipuolinen, on mukana monissa biologisissa prosesseissa kuten solujen lisääntymisen, apoptoosin säätelyyn ja erilaistumista [5]. Tasapaino näiden eri toimintojen sanelee homeostaasin eturauhasen rauhanen. Oikeutettu kysymys on, miten eturauhassyövän solut, jotka ovat aluksi riippuvaisia ​​androgeenien voi jatkaa kasvua androgeeni-riistää ympäristössä. Yksi mahdollisuus on, että eturauhassyövän solut saavuttaa tämän mukauttamalla AR väylän matalan androgen /korkea antiandrogen tasot, esimerkiksi mutaation, vahvistus tai katkaisu on konstitutiivisesti aktiivinen AR, sääntelyn purkaminen AR kofaktoreita ja /tai kasvaimeen androgeenituotantoa [6] [7]. Toisaalta, syöpäsolut voivat aktivoida vaihtoehtoisia kasvun polkuja, kun taas sulkemalla tuumorisuppressoreilla ja apoptoottisia signaaleja [6], [7].

Tässä tutkimuksessa olemme keskittyneet roolia AR väylän eturauhassyöpä etenemisen. Ekspressiokuviota androgeenisäädellyn geenien androgen-reagoiva ja kastraatio kestävät solulinjat perustettiin, jonka tavoitteena on: (i) onko AR-reitti on edelleen toiminnallisesti aktiivinen hormonihoidon vastustuskykyisten PC346 soluissa; (Ii) tunnistaa mekanismia (t), jolla AR reitti voi säätää matalan androgen /korkea antiandrogeeni tasolla; (Iii) tunnistaa androgeenisäädellyn geenien voitaisiin mahdollisesti käyttää diagnosoinnissa /ennuste eturauhassyövän tai terapeuttisena kohteena. Tätä tarkoitusta varten käytimme sirutekniikalla kuvaamaan transkription ohjelma aktivoidaan synteettisen androgeenin R1881 ja antiandro- hydroksiflutamidi. Kuten mallijärjestelmä käytimme PC346 solulinjoja (taulukko 1): androgeenin reagoiva PC346C emosolulinjassa ja sen hoito-fenikoliresistenttiin alalinjoja PC346DCC, PC346Flu1 ja PC346Flu2 [8]. Nämä kastraatio kestävä alalinjoja jäljentää yhteistä AR muutoksia havaittiin hoito-resistenttejä: AR alassäätöä (PC346DCC), AR mutaatio (PC346Flu2) ja AR yli-ilmentymisen (PC346Flu1), joten se on ainutlaatuinen ja arvokas malli tätä tutkimusta.

Methods

Ethics lausunto

Normaali ja kasvain näytteitä potilaista saatiin jäädytetty kudospankille Erasmus Medical Center (Rotterdam, Alankomaat). Näytteet kerättiin vuosina 1984 ja 2001. koemenettelyn hyväksyi Erasmus MC Medical eettisen komitean mukaan Medical Research ihmiseen kohdistuvan Act.

Reagenssit ja solulinjoissa

Perus kulttuuri käytettävä väliaine ylläpitoon PC346 solulinjojen koostui DMEM-F12 -alustassa (Cambrex BioWhitaker, Belgia), jota oli täydennetty 2% naudan sikiön seerumia (FCS; PAN Biotech GmbH, Aidenbach, Saksa), 1% insuliinin-transferriini-seleeni (Gibco BRL ), 0,01% naudan seerumin albumiinia (Boehringer Mannheim, Saksa), 10 ng /ml epidermaalista kasvutekijää (Sigma-Aldrich), penisilliiniä /streptomysiiniä antibiootteja (100 U /ml penisilliiniä, 100 mg /ml streptomysiiniä, BioWhitaker, Belgia); ja seuraavien lisäysten: 100 ng /ml fibronektiiniä (Harbor Bio-Products, Tebu-bio, Alankomaat), 20 mg /ml fetuine (ICN Biomedicalsin, Alankomaat), 50 ng /ml choleratoxin, 0,1 mM fosfoetanoliamiiniin, 0,6 ng /ml trijodityroniinin ja 500 ng /ml dexametason (kaikki Sigmalta). PC346C soluja ylläpidettiin viljelmässä täydellisessä väliaineessa edellä mainittiin, täydennettynä 0,1 nM 17-metyylitrienolonia (R1881, NEN, Boston MA, USA). PC346DCC valinta alustaan ​​lisättiin edellä kuvatulla tavalla, mutta köyhdytettyä päässä androgeenien käyttämällä dekstraani-päällystetyllä puuhiilellä (DCC) käsiteltiin FCS. PC346Flu1 ja PC346Flu2 viljelyväliaine myös androgeenin köyhdytettyä käyttämällä 2% DCC-FCS, ja johon oli lisätty 1 uM hydroksiflutamidi (OH-flutamidi, Schering-Plough Research Institute, New Jersey, USA). Hormonin ärsykkeitä, yksinkertaistettu versio elatusaine käytettiin, joka sisälsi 2% DCC- FCS ilman edellä mainittuja lisäyksiä (minimaalinen elatusaine). Soluja kasvatettiin T25 Primaria ™ kudosviljelypulloon (BD Biosciences Benelux NV, Hollanti) 37 ° C: ssa 5% CO

2 kosteutetussa ilmakehässä.

Hormoni ärsykkeet ja ilmaisun mikrosiruanalyysillä

Solut ympättiin niiden selektioelatusaineessa saavuttaa -50% konfluenssiin ja annettiin kiinnittyä yön yli. Seuraavana päivänä elatusaine korvattiin 2% DCC-FCS minimiväliaineessa ja soluja ilman ravintoa 48 tuntia, jotta AR aktiivisuuden perustasoihin ennen hormoni ärsykkeet. Sen jälkeen soluja stimuloitiin joko vehikkelillä, 1 nM R1881 tai 1 uM OH-flutamidi 4, 8 tai 16 tuntia. Stimulaation jälkeen, solut huuhdeltiin kahdesti PBS: lla ja säilytettiin -20 ° C: ssa, kunnes RNA: n eristämistä. Kokonais-RNA eristettiin RNAzol B reagenssilla (Campro Scientific, Veenendaal, Alankomaat) ja puhdistettiin edelleen RNeasy pylväät (Qiagen) ja on-sarakkeen DNA ruoansulatusta, mukaan valmistajan protokollaa. RNA laatu tarkistettiin 1% agaroosigeelillä.

Cy3- tai Cy5-leimatun RNA-koettimet tuotettiin sisällyttämällä amino-allyyli UTP aikana RNA-monistuksen, ja sen jälkeen kytkemällä N-hydroksisukkinimidiä modifioitu väriainetta. Lyhyesti, 3 ug RNA: ta käytettiin T7-lineaariset mRNA vahvistus-protokollaa, joka on kuvattu aiemmin [9]. Amino-allyyli UTP, plus yhtä suuri määrä modifioimatonta rUTP, sisällytettiin arna T7 Megascript Kit (kaikki Ambion) mukaisesti valmistajan protokollaa. Amplified RNA puhdistettiin ja konsentroitiin käyttämällä Microcon-YM 30 saraketta (Amicon) huuhtomaan kolme kertaa 300 ul RNAasi-vapaaseen veteen. Lopuksi, 2 ug aminoallyl-modifioitua RNA: ta, on enintään 3,33 ui RNAasi-vapaata vettä, inkuboitiin 1,66 ui natriumbikarbonaattipuskuria (0,3 M, pH 9) ja 5 ui Cy3- tai Cy5-väriaine (CyScribe Post-Labeling Kit, Amersham, NJ, USA), 1 tunnin ajan pimeässä huoneen lämpötilassa. Reaktio pysäytettiin 5 ui 4 M hydroksyyliamiinia HCI: ää (Sigma), vasta-leimatut koettimet yhdistettiin ja puhdistettiin /konsentroitiin käyttäen Microcon-YM 30 saraketta. Probe kerättiin 5-15 ul lopputilavuudessa ja resuspendoitiin 80 ul Ambion hybridisaatiopuskuria numero 1.

mikromatriisi käytimme double-väriaine oligoarrays eli noin 15000 ihmisen geenejä, joihin leimattu hormoni stimuloiman RNA cohybridized sen vasta-leimattu aika-Hyväksytty ajoneuvo (etanoli) kontrolli. Kaksi mikrosirut tehtiin per ehto: yhdessä kokeessa stimuloituun näytteet leimattiin Cy3 ja stimuloitumattomassa viite kanssa Cy5, muissa kokeilu päinvastoin (väriaine-swap); tämä tehtiin jättää väriaine-etuoikeutetut sitoutuminen oligonukleotidien microarray. Lisäksi kaksi riippumatonta solujakojen käytettiin kussakin näistä kokeista, tilille biologisen vaihtelevuuden.

oligoarrays Tässä tutkimuksessa käytetyt tuotettiin Erasmus Center for Biomics. Lyhyesti, ihmisen 18584 oligonukleotideja kirjaston (Compugen, Sigma-Genosys) bongattiin päälle aminosilaanil- dioja käyttäen Virtek Chipwriter Professional ryhmittäjällä (Virtek Vision International, Waterloo, Kanada). Ohjaus paikkoja mukana maamerkkejä, tiputtelua puskuri, ulkomaalainen oligonukleotidit (SpotReport Alien Oligo Array, La Jolla, Stratagene), poly d [A] 40-60, lohen sperman DNA: ta ja ihmisen COT-1 DNA. Ennen hybridisaatiota mikrosiru liukuu esihybridisoitiin 5 x SSC, 0,05% SDS: ää, 4% BSA-liuoksella 30 minuutin ajan 45 ° C: ssa, pestiin kahdesti RNAasi-vapaata vettä 2 minuutin ajan, huuhdeltiin isopropanolin ja spin-kuivattiin 3 minuuttia 1500 g. Microarray hybridisaatiot suoritettiin yön yli 45 ° C: ssa, jatkuvasti sekoittaen, joka HS4800 Hybridization Station (Tecan Benelux BV). Lopuksi paneelit pestiin automaattisesti Hybridisaatio Station käyttäen: 2 x SSC /0,05% SDS (45 ° C), 1 x SSC ja 0,2 x SSC (huoneenlämmössä), ja kuivataan juoksevassa N

2, ennen skannausta.

Data louhinta ja analysointi

Array skannattiin on ScanArray Express HT skanneri (Perkin Elmer, Nederland BV) ja spot intensiteetit kvantitoitiin käyttäen Imagene ohjelmistoa (Bio Discovery Inc, El Sequndo , CA, USA). Tasapainottamiseksi Cy3 ja Cy5 paikalla intensiteettiä, Loewess normalisointi per alaryhmä suoritettiin käyttäen Limma-paketti (https://bioinf.wehi.edu.au/limma/) peräisin Bioconductor (https://www.bioconductor.org) [10] , [11]. Mittakaavassa välillä paneelit, globaalin mediaani intensiteetti ryhmää kohti asetettiin 1000. Dye intensiteettiä alle 200 sitten kynnysarvo 200, minimoimaan melun ja tehdä kertamuutosta matalan intensiteetin alue vankempi vastaan ​​poikkeavia havaintoja. Täplien intensiteetti kynnyksen alapuolella (200) sekä Cy3 ja Cy5-kanavien, yli 50% ( 3/6) ja paneelit kerta-kurssin, jätettiin pois analyysistä. Näyte ajoneuvon-ohjaus suhteet laskettiin sitten ja 2log muuttunut. Paikkoja, jotka osoittivat vastapäätä vaikutuksia väriaine-swap /biologinen rinnakkaista jätettiin lisäanalyysiä; vaikutuksia kutsuttiin vastapäätä jos keskiarvo 2log suhde kolmen ajankohtina testatuissa ≥0,5 yhden väriaineen ja alapuolella ≤-0,5 väriaine-swap. Sen jälkeen normalisointi ja kaikki edellä mainitut laadun valvonta, 2log intensiteettisuhteet molemmista rinnakkaista otettiin keskiarvo kunakin ajankohtana. Nämä tiedot tallennettiin SRS7 (Sequence Retrieval System versio 7, Lion Bioscience AG, Heidenberg, Saksa) [12], jota käytetään myös vertailuja muihin aiemmin julkaistu /julkiset tietokannat [13], [14], [15 ], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23], [24].

Hierarkkinen klusterointi ja visualisointiin oli suoritettiin käyttäen Cluster ja TreeView ohjelmat (Eisen Labs: https://rana.lbl.gov), tässä järjestyksessä. Merkitys analyysi mikrosirut (SAM; https://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM) käytettiin sen määrittämiseksi, mitkä geenit olivat tilastollisesti erilaiset stimuloitujen näytteiden ja ei-stimuloiduissa viittauksia. Gene ontologia klustereiden tehtiin käyttäen Tietokanta Annotation, visualisointi ja integroitu Discovery (DAVID: https://david.abcc.ncifcrf.gov) [25], [26]. Reitti ja toiminnalliset analyysit luotu käyttämällä Ingenuity Pathways Analysis (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com).

Kaikki microarray data on MIAMI yhteensopiva ja on talletettu Gene Expression Omnibus arkistoon ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), alle GEO hakunumerolla GSE22914.

cDNA-synteesi ja RT-PCR-analyysi

Kokonais-RNA eristettiin, kuten on kuvattu edellä, ja cDNA syntetisoitiin käyttäen MMLV-käänteistranskriptaasia kit ja Oligo (dT)

12-18-aluketta (Invitrogen), mukaan valmistajan protokollaa. cDNA näytteitä säilytettiin -20 ° C: ssa. Sillä validointi mikrosirun Tulosten kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi suoritettiin käyttäen ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). KLK2, part1, TPD52, FKBP5, GPR88, STEAP1, TRIB1 ja ID3 kvantitoitiin absoluuttiseen QPCR SYBR Green ROX Mix (Thermo Scientific) ja 330 nM kutakin aluketta, mukaan valmistajan protokollaa. Alukkeet suunniteltiin käyttäen tietokoneohjelmaa Oligo Primer Analysis Software version 6.22 (Molecular Biology Insights Inc, USA). Gene spesifisyys tarkistettiin BLAST ja mahdollisuuksien mukaan introni-ulottuen alukkeet päättänyt välttää monistaminen kontaminoivien DNA. Primer prosesseja kuvataan taulukossa 2. TMPRSS2, PSA ja GAPDH kvantitoitiin TaqMan reaaliaikaista PCR-analyysiä käyttäen absoluuttista QPCR ROX Mix (Thermo Scientific). TMPRSS2 (määritys ID Hs00237175_m1) ja GAPDH (määritys ID Hs99999905_m1) sarjat hankittiin Applied Biosystems ja ajaa seuraten valmistajan ohjeita. PSA kvantitoitiin kuten aiemmin on kuvattu [8]. Kullekin geenille, standardikäyrän konstruoitiin laimennossarjoja käänteiskopioitu PC346 RNA-allas, jota sitten käytettiin määrän määrittämiseksi kohde-viestin kynnyksen (Ct) arvo. GAPDH taloudenhoito geeni käytettiin endogeeninen kontrolli.

kvantitatiivinen PCR-analyysi ihmisen kudoksen paneelin, normaali ja kasvain näytteissä potilailta saatiin jäädytetty kudospankille Erasmus Medical Center (Rotterdam , Alankomaat). Lisätietoja näistä näytteistä annettiin aiemmin [27]. TaqMan reaaliaikainen PCR-analyysi suoritettiin ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA) käyttäen AmpliTaq Gold DNA-polymeraasia (Applied Biosystems), mukaan valmistajan ohjeiden. Validoitu alukkeet ja koettimet TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems) käytettiin kvantifiointia ACSL3 (Hs01071247_m1), MCCC2 (Hs00223257_m1), ENDOD1 (Hs00826684_m1) ja GAPDH (Hs99999905_m1), mukaisesti PCR-antamat asetukset Applied Biosystems. PBGD kvantifioitiin käyttämällä 330 nM alukkeita eteenpäin: 5′-CAT GTC TGG TAA CGG CAA TG-3 ’ja reverse: 5’-GTA CGA GGC TTT CAA TGT TG-3-alukkeet, Power SybrGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems ), mukaan lämpösyklitystä protokollan valmistajan suosittelemia. Transcript määrä jokaisen näytteen normalisoitiin vastaan ​​keskimäärin kaksi endogeenisen viittauksia ja suhteessa kalibraattori. Kaksi siivous geenejä käytettiin endogeenista viitteet olivat PBGD ja GAPDH; seos cDNA eturauhasen ksenografteja käytettiin kalibraattori. Kaaviot ja tilastot suoritettiin GraphPad Prism (versio 3.0). P-arvot 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

Gene ekspressiokuviota PC346 käsiteltyjen solujen R1881 ja hydroksiflutamidi

luonnehtivat ilmentymisen profiilia androgeenireseptorin kohdegeenien eturauhassyöpäsoluissa, käytimme ilme mikrosiruanalyysi annetun PC346 solulinjasta paneeli inkuboitiin androgeenireseptorin analogisen R1881 tai antiandrogen OH-FLUTAMIDE. PC346 malli järjestelmä koostuu neljästä solulinjojen: androgeenisäädellyn herkkä PC346C ja kolme hormonihoito vastustuskykyisten alalinjoja, johdettu vanhempien PC346C pitkäaikainen androgeeniablaatio (PC346DCC), johon oli lisätty antiandrogeeni OH-FLUTAMIDE (PC346Flu1 ja PC346Flu2 ). Kaikki nämä alalinjoja näytteille erilaisia ​​ominaisuuksia suhteessa AR tila ja reagointikykyä (yhteenveto taulukossa 1) [8].

ilmentymisanalyysiä me stimuloi solut 1 nM R1881 tai 1 uM OH-FLUTAMIDE 4, 8 tai 16 tuntia ja cohybridized leimattu RNA sen ajan toisiaan ajoneuvo (etanoli) kontrolli. Kaksi mikrosirut tehtiin per ehto, käyttäen kahta itsenäistä solua kohtia väriaine-swap, tilille biologisen vaihtelevuuden ja mahdollisten väriaine-suosivista vaikutuksista. Varhainen ajankohtina valittiin, jotta rikastamiseksi ensisijaisen AR tavoitteita, ja minimoida epäsuorat toissijaisia ​​tavoitteita.

Kaksi rinnakkaista per aika-pisteen laskettiin keskiarvo ja yhteensä 107 differentiaalisesti ilmaisi transkriptien valittiin muodostavan AR polku allekirjoitus: 74 säädelty ja 33 alas-säädellä R1881 ja /tai OH-FLUTAMIDE (taulukot 3, 4, 5, 6). Täplät katsottiin differentiaalisesti ilmoitetaan, jos absoluuttinen 2log suhde ≥0.5 (suhde ≥1.42 tai ≤0.71) kaikkien kolmen aikapisteissä, vähintään yhdessä solutyypissä. Merkitys analyysi mikrosirut (SAM) käytettiin määrittämään, mitkä geenit olivat tilastollisesti erilaiset stimuloitujen näytteiden ja ei-stimuloiduissa viittauksia. Kokeellisessa suunnittelussa, päätimme suorittaa hormonaalista ärsykkeet 3 eri ajankohtina, jotta selostukset kanssa nopeammin tai hitaammin vastausta ei saa hukata. Kuitenkin aika vaikutus oli vähäpätöinen: eniten androgeenisäädellyn transkriptit ilmentyvät eri kaikkina ajankohtina kolmena ajankohtana ja tilastolliseen analyysiin päätimme yhdistää kaikki 3 ajankohtina kohden kunnossa. Kaikkiaan oli 253 SAM merkittäviä geenejä, joiden väärä löytö määrä (FDR) asetettu 0,05 (taulukot S1, S2, S3, S4). Meidän 107 allekirjoitusta selostukset, pidetään differentiaalisesti ilmaisi mukaan edellä mainittujen valintakriteerien 77 olivat tilastollisesti merkittäviä SAM. Itse asiassa ilmaus loput 30 (28%) selostukset meidän AR-tavoite allekirjoitus vaihteli 3 aika-pistettä, niin että nämä eivät saavuttaneet tilastollista merkittävyyttä yhdistetyssä SAM analyysi. Tätä muutosta ei voida selittää ilmeisesti hallitseva kineettinen malli, eikä sitä myöskään voida katsoa johtuvan 4 h ajankohtana erityisesti. Koska ajallinen sääntely havaittiin niin muutaman selostukset, ei analyysi suoritettiin dynamiikkaan geenien ilmentymisen vaihtelua ajan. Ilmaisu suhdeluvut esitetty taulukoissa ja kuvio 4 ovat keskimääräisestä kaikkien kolmen aikaa pistettä per kunnossa. Lopuksi se, että huomattava määrä SAM merkittäviä selostukset eivät sisältyneet meidän AR-säännelty allekirjoituksen johtui valinta asettaa 2log suhde kynnys 0.5.

androgen-herkkien PC346C alalinja vastasi R1881 stimulointia lisääntyneen ilmentymisen 18 geenien, kun taas 2 olivat alassäädetty. Näiden joukossa ovat joitakin tunnettuja AR geenien, kuten KLK2, STEAP1, TMPRSS2 ja FKBP5. Terapia kestävä alalinjoja osoitti selvästi vastauksia R1881 ja OH-flutamidi. PC346Flu1, joka ilmaisee 4-kertainen AR tasolla kuin emosolulinjassa, osoitti ”super-aktivointi” AR-reitin R1881, ei ainoastaan ​​suuruus geenin ilmentymisen, mutta myös monien säänneltyjen geenien (20 androgeeni -regulated geenien vanhempien PC346C versus 91 PC346Flu1). Sitä vastoin PC346DCC-alalinja, joka ilmaisee jäljellä tasoja AR proteiinin, ei näkynyt havaittavissa muutoksia geenien ilmentymisen jälkeen hormonihoitojen. Kumpikaan PC346C, PC346DCC eikä PC346Flu1 osoitti merkittäviä muutoksia transkription profiilin vastauksena OH-FLUTAMIDE. Sen sijaan PC346Flu2 soluja, jotka ilmentävät T877A mutatoitunut AR, vastasi sekä R1881 ja tämän antiandrogeeni, vaikka vastaus jälkimmäinen oli heikompi (14 geenit ajan säätelee R1881 versus 8 up-säännellään OH-FLUTAMIDE, taulukot 3 ja 5, vastaavasti).

validointi microarray tietojen

microarray data validoitiin kaksi lähestymistapaa: kokeellinen lähestymistapa käyttäen kvantitatiivista RT-PCR, ja bioinformatiikan lähestymistapa kytkemällä geeni allekirjoituksen asettaa yleisesti saatavilla olevien tietokantojen androgen vastaus. Valitsimme 10 androgeenisäädellyn geenien edelleen validoitu kvantitatiivinen RT-PCR: PSA, KLK2, part1, TPD52, GPR88, FKBP5, TMPRSS2, STEAP1, ID3 ja TRIB1. On syytä huomata, että meidän mikrosiruanalyysi ei havainnut sääntelyn PSA ilmaisun vastauksena hormonaalista hoitoja, mutta koska tämä on merkittävä AR kohdegeenin, se sisältyi RT-PCR tarkistettaessa. Määrällinen PCR-analyysi vahvisti ero ilmentymisen kaikkien valittujen geenien samaan suuntaan ennusti mikrosiruanalyysillä (Fig. 1). Lisäksi RT-PCR osoitti myös voimakkaampi vaikutus hormonin-kohtelu PC346Flu1 solulinja, toisin kuin lähes poissa induktion PC346DCC solujen, verrattuna emo-PC346C useimpien geenien analysoitiin. Kuten havaittiin microarray määrityksessä, PC346Flu2 osoitti vastaavia vastauksia R1881 ja OH-flutamidi monien geenien (Fig. 1, taulukot 3, 4, 5, 6).

kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi asettaa 10 androgeenisäädellyn geenien PC346 solulinjoissa. Soluja stimuloitiin 1 nM R1881 (R1881), 1 mM OH-FLUTAMIDE (Flut) tai ajoneuvon ohjaus (DCC-FCS) 16 tuntia. Kaaviot esittävät keskiarvo (± SE) normalisoitu geenin ilmentymisen (n.g.e.) suhteessa housekeeping-geeni GAPDH, kahden itsenäisen solun osia. ID3 ja TRIB1 olivat androgen-tukahdutettu vuonna microarray määrityksissä, kun taas muiden geenien kasvoi-säädellään Androgeenit.

Viime vuosina, joukko tutkimuksia on julkaistu, että analysoitu geeniekspressiota vasteena androgeenit stimulaation solulinjoissa ja ksenograftit (taulukko 7). Niistä 107 selostukset meidän allekirjoitus, 73 oli läsnä vähintään 3 5 tietokantojen ja olivat mukana lisäanalyysiä varten. Yli 90% liittyy geenien päällekkäinen aiemmin raportoitu androgeenisäädellyn tavoitteita. Geenit vahvin inductions tämänhetkiseen työhön myös osoittivat johdonmukaisesti korkeat inductions useita aiemmissa raporteissa, mikä viittaa siihen, että tuotteet näiden geenien voi olla perus rooli biologisen toiminnan eturauhasen (Fig. 2). Käyttämällä ainutlaatuista solulinjan paneelista, pystyimme tunnistamaan uusia androgen reagoiva geenejä, kuten MAFB, KLF9, NFIB, STBD1, BIK ja HLX.

vasemmalla puolella, PC346C, PC346Flu1 ja PC34Flu2 altistettiin 1 nM R1881 tai 1 uM OH-FLUTAMIDE 4, 8 ja 16 h, kun taas PC346DCC stimuloitiin 1 nM R1881 vain. Oikealla puolella, meidän geeni allekirjoitus arvioitiin niiden tietokantojen DePrimo

et al.

, Nelson

et al.

, Nickols

et al.

, Wang

et al.

ja Hendriksen

et al.

(katso taulukko 7 tietokannan tiedot). Lämpö-kartta on esitetty varten 2log ilmaisun suhdetta hormonikäsitellyn näytteitä ja kunkin ajan sovitettu ajoneuvon hallintalaitteita. Punainen ja vihreä väri edustaa induktio ja tukahduttaminen, vastaavasti, kun taas musta merkitsee ei asetusta. Harmaa neliöt ilmoittavat tiedon puuttumisen alhaisen ilmentymisen, huono tietojen laatua tai puuttuminen koettimien vastaavan transkriptin array alusta käytetään tutkimuksessa.

Biologinen prosessit koordinoi AR polku

androgeenisäädellyn allekirjoitus geenien luokiteltu Gene ontologia (GO) biologiset prosessit käyttävät Tietokanta Annotation, visualisointi ja integroitu Discovery (DAVID: https://david.abcc.ncifcrf.gov) [25], [26].

yhdenmukainen fysiologiset tehtävät androgeenien, tämä lähestymistapa osoitti, että AR kohdegeenien valitaan esillä olevassa tutkimuksessa toimivat transkription säätelyyn ja solunsisäisten signalointireittien, aineenvaihduntaa proteiineja , lipidit ja hiilihydraatit, ja säätelyyn solujen lisääntymistä ja erilaistumista (Fig. 3A). Suurin luokka sisältää geenejä, jotka koodaavat transkriptiotekijöitä ja transkription sääntelyviranomaisten, kuten NFIB, KLF9, HF1A, MAFB, EHF, NCOR1, NCOR2, PIAS1 ja useat sinkkisormipolypeptidiin proteiineja (ZNF189, ZBTB10, ZBTB16 ja CASZ1). Tämän jälkeen geenejä, jotka osallistuvat solunsisäisen signaalitransduktion, mukaan lukien G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien reitin (GPR88, RGS2, GNAI1), pienet GTPaasit Ras perheen (RHOB, RHOU), mitogeeni-aktivoitu proteiinikinaasi cascade (MAP2K4, MKNK2, TRIB1) ja muut proteiinikinaasit /fosfataasit (PPM1A, PPP2CB, PIK3R3, SGK1). Muut AR reagoiva geenit vaikuttavat solujen lisääntymisen säätelyn kautta solukierron ja apoptoottisten prosessien (esim RCC1, BBX, BIK, TP53INP1). Samanaikainen rooliin androgeenien eturauhasen kehittymisen ja kypsymisen, toinen suuri klusteri sisältyvät osallistuvien geenien solujen erilaistumista, kuten TPD52, TWSG1, NDRG1, ID1 ja ID3. Lopuksi, androgeenin indusoima metaboliaan proteiineja, hiilihydraatteja ja lipidejä, jotka edistävät tuotannon ja erityksen eturauhasen nestettä. Tällaiset R1881 kohdegeenien mukana MTHFD1, PSPH, PSAT1 ja MCCC2, jotka koodaavat entsyymien aineenvaihduntaan metioniini, seriini ja leusiini aminohappoa, vastaavasti. Lisäksi ylössäätöä käännöksen aloittamista tekijä EIF2C3 mahdollisesti edistää peptidisynteesillä. Lisäksi geenit osallistuvat proteiinin taitto (PDIAS5, FKBP5), glykosylaatio (FUT8, GALNT1) ja kaupan (DMN1L, KDELR2) on myös säännelty R1881. Sen lisäksi, proteiineja ja aminohappoja, eturauhasen nestettä on myös runsaasti lipidejä, polyamiinit, sorbitolia ja useita metalli-ioneja. Todellakin, R1881 myös stimuloi ekspressiota ACSL3 ja ELOVL5, jotka osallistuvat venymä rasva-happojen, spermiini-syntaasi (SMS), joka on osa polyamiinin Synteesireitissä, sorbitolidehydrogenaasi (Sord), jota erittää eturauhasen osaksi siemennestettä, ja ionikanavien ACCN4 ja KCNJ10.

(A) Pie-kuvaaja edustaa geenejä luokitellaan sen mukaan merkittävintä biologisen toiminnan. Gene ontologia merkinnät uutettiin käyttäen DAVID [25], [26]. (B) osallistuminen AR-reitin geenit sairaus määritetään käyttämällä Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com).

automatisoida toiminnallinen luokitus, määrällisesti Rikastusaste jokaisen klusterin ja valitse tilastollisesti merkitsevä toimintakategorioihin käytimme DAVID Functional Annotation klusterointi työkalu. Tämä työkalu tunnistaa 6 tilastollisesti merkitsevä Annotation klusterit, jotka liittyvät aineenvaihduntaan orgaanisten happojen (lipidien ja aminohappoa), apoptoosin, solujen erilaistuminen, kehitys- prosesseja, transkription säätelyyn ja säätely solujen prosessit (taulukko 8).

osallistuminen androgeenisäädellyn geenien patologisia tiloja tutkittiin tarkemmin käyttämällä Ingenuity tietokantaa (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com). Vahvin yhdistykset löydettiin syöpä, sukuelimiin, ihotautien ja sydän- ja verisuonitautien (Fig. 3B).

AR väylän eturauhassyövän kehitykseen ja etenemiseen

selvittämään, miten AR-reitti on moduloitu aikana kehittymistä ja etenemistä eturauhassyövän me liittyvät meidän androgeenisäädellyn geeni allekirjoitus seitsemästä itsenäisestä eturauhassyövän microarray tietokantoihin. Näihin tutkimuksiin osallistui yksilöitä ”normaalin eturauhasen” ja eturauhasen kasvaimia erilaisista tautia vaiheista, jonka pääpiirteet on koottu taulukkoon 7. yhteensä 89 hormonin vastanneilla geenit olivat läsnä vähintään 4 7 tietokantoja, ja valittiin edelleen analyysi. Kuviossa 4, näytämme hierarkkinen ryhmittely R1881 reagoivien geenien (ensimmäinen lohko 4 saraketta), vieressä ensisijainen syöpään ja normaalissa eturauhasessa (toinen lohko), etäpesäkkeitä verrattuna ensisijainen syöpä (kolmas lohko), ja lopuksi toistuvat vs. ei- toistuva ja hormonihoito kestävä versus hormoni-naiivi tauti (neljäs lohko).