Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Viimeaikaiset tutkimukset ovat korostaneet aiheuttajaa yhteyksiä MikroRNA (miRNA) sääntelyn purkaminen ja kasvainten kehittymiseen. Maksasolukarsinoomassa (HCC), enemmän ja enemmän miRNA tunnistettiin ja ennustavia syöpä biomarkkerit, sekä muita hoitomenetelmien. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää toiminnalliset merkitys ja sääntelyn mekanismi miR-199a2 /214 klusteri HCC etenemiseen.

menetelmät ja havainnot

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että miR-214, kuten sekä miR-199-3p ja miR-199-5p tasot vähensi merkittävästi useimmissa tutki 23 HCC kudosten ja HepG2 ja SMMC-7721 solulinjoissa verrattuna niiden nontumor kollegansa. Tutkimaan edelleen rooli miR-214 hepatokarsinogeneesin, me paljastaa, että ER stressin aiheuttama pro-eloonjäämistekijänä XBP-1 on kohteena miR-214 käyttämällä western blot määritystä ja lusiferaasireportterilla määritys. Re-ilmentyminen miR-214 HCC solulinjoissa (HepG2 ja SMMC-7721) esti proliferaatiota ja indusoi apoptoosia. Lisäksi ektooppinen ilmentyminen miR-214 dramaattisesti tukahdutti kykyä HCC solujen muodostamaan pesäkkeitä in vitro ja kehittää kasvaimia ihonalaisen ksenotransplantaatio mallin BALB /c kateenkorvattomia nude-hiirissä. Lisäksi uudelleen XBP-1s heikennettyjä miR-214 välittämää tukahduttaminen HCC-solujen lisääntymistä, siirtomaa ja kasvainten muodostumiseen. Edelleen ymmärtää mekanismia miR-199/214 cluster alas-ilmaisun HCC, huomasimme, että thapsigargin (TG) ja tunikamysiinillä (TM) tai hypoksian indusoiman laskostumattoman proteiinivaste (UPR) vaimentaa ilmaus miR-199 /214 klusteri HCC-soluissa. Promoottoriaktivoinnilla analyysi miR-199a2 /214 geeniä, me conjectured NFKB mahdollisena negatiivisena säätelijänä. Olemme lisäksi havainneet, että UPR ja LPS-indusoidun NFicB aktivaation tukahdutettu miR-199a2 /214 transkriptio, ja tämä tukahduttaminen purettiin NFKB eston HCC-soluissa.

Johtopäätökset

Tutkimuksemme osoittavat, että modulaatio miR-214 pitoisuudet voivat tarjota uuden terapeuttinen lähestymistapa syövän hoitoon ja paljasti, että UPR voi tarjota uuden selityksen sille, miksi miR-199/214 cluster oli säädellä vähentävästi etenemisen HCC.

Citation: Duan Q, Wang X, Gong W, Ni L, Chen C, hän X, et al. (2012) ER Stressi Negatiivisesti moduloi ilmentäminen miR-199/214 Cluster ja säätelee Kasvaimen Survival ja Progression Human Hepatosellulaarinen Cancer. PLoS ONE 7 (2): e31518. doi: 10,1371 /journal.pone.0031518

Editor: Terence Lee, University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 16 syyskuu 2011; Hyväksytty: 9. tammikuuta 2012 Julkaistu: 16 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Duan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (nro 30930039, 81000097 ja 30770882), ja National Basic Research Program of China (973 Ohjelmanro 2007CB512004). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

miRNA ovat uusi luokka endogeenisiä, ei-koodaavat RNA: t 19-25 nukleotidin pituisia, jotka välittävät tukahduttamisesta tavoite selostukset sitoutumalla täydentäviä siemenet sekvenssien 3’alueet (UTR) kohde- mRNA: iden [1 ]. Koska alustava havainto, yli 1400 ihmisen miRNA on rekisteröity miRBase (v.17.0). Aiemmat tutkimukset ehdotti dysexpression on miRNA on havaittu eri syövissä, ja liittyy myös kliiniseen tulokseen syöpäpotilaiden [2]. Lisäksi kyvyt miRNA saavuttaa samanaikaisesti hienosäätöä lukuisten eri kohdegeenien tekee niistä olennainen säätelijöinä solusignalointi ja syytöksiä ne kasvainprogression [3], [4]. Mutta niiden erityisiä rooleja ja toimintoja suurten syöpien ja pahanlaatuinen etenemistä syöpä ei ole vielä täysin selvitetty.

maksasolusyövän (HCC) on yksi yleisimmistä syövistä maailmanlaajuisesti ja yksi johtavista syistä syöpää liittyvä kuolema Aasiassa, erityisesti Kiinassa [5]. Useita miRNA, kuten miR-101 [6], miR-122 [7], [8], [9] miR-373 [10], miR-221/222 [11], [12], [13], miR-195 [14], miR-30d [15], miR-125b [16], miR-18a [17], miR-139 [18], miR-223 [19] ja miR-29 [20], on jo raportoitu säätelemään HCC kasvainprogression ja etäpesäkkeiden säätelemällä avaimen geenejä, kuten Mcl-1, ADAM17, YAP, DDIT4, sykliini D1, CDK6, E2F3, Galphai2, LIN28B, estrogeenireseptori-α, Rho-kinaasi 2, Stathmin 1 ja Bcl-2 ja niin edelleen. Kuitenkin olemassa olevat tiedot eivät voi täysin selittää monimutkaisuuden HCC.

Äskettäin miR-199-3p /5p tarkistettiin pienentyneen HCC kudoksissa, ja sen vähennys merkittävästi korreloi selviytymisen HCC potilaiden, jossa hahmotellaan mahdollinen merkki ennustamiseksi ennustetta HCC potilaista [5], [21], [22]. On hyvin tunnettua, että on olemassa kaksi geeniä, jotka mahdollisesti koodaavat pri-miR-199, ensisijainen esiaste HSA-mir-199. Ensimmäinen geeni on MIR199a1 kromosomissa 19 (NCBI GeneID 406976) ja toinen on MIR199a2 kromosomissa 1 (NCBI GeneID 406977) [23]. Mielenkiintoista on, 3′-pää pri-miR-199a2 transkripti on prekursori-sekvenssi toisen miRNA parin HSA-mir-214: n ja HSA-mir-214 * [24]. miR-199a2 ja miR-214 on raportoitu tuotettu yhden intronin vähemmän transkriptio liikkeellepaneva voima 3 vastapäätä (Dnm3os), joka on upotettu vastakkaiseen juosteen sisällä introni liikkeellepaneva voima hiiren ja ihmisen [23], [24] . Lisäksi miPPR-199a2 alue on tässä esitetty olevan aito miR-199a2 promoottorin, joka tuottaa ensisijaisen transkriptin kätkeminen miR-199-3p, miR-199-5p ja miR-214 sekvenssien klusterin [25]. Yhä useammat tutkimukset dokumentoitu, että miR-214 on mukana ihmisen munasarjasyöpä, kohdunkaulan syöpä ja melanooma kasvaimen etenemiseen [26], [27], [28], [29]. Kuitenkin nykyinen tietämys miR-214 ilmentymistä ja toimintaa HCC on edelleen varsin epäselvä. Lisäksi mekanismeista miR-199a2 /214 sääntelyn purkamista HCC ei ole vielä selvä.

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että miR-199-3p, miR-199-5p ja miR-214 ilmentyminen oli pienentynyt merkittävästi HCC kudoksissa. XBP-1: n osoitettiin olevan suoraan kohteena miR-214 vuorovaikutuksella 3′-UTR. Lisäksi tukahduttava vaikutus miR-214 HCC kasvainten muodostumista ja kasvua tutkittiin

in vitro

ja

in vivo

, ja uudelleen XBP-1s heikennettyjä miR-214-välitteisen suppression. Olemme lisäksi havainneet, että NFKB aktivoituu laskostumattoman proteiinivaste (UPR) vaimentaa miR-199a2 /214 transkriptio, ja osoitti, että aktivointi UPR ja endoplasmakalvoston (ER) stressi on tärkeä mekanismi vastaa miR-214 ja miR-199-3p /5p alassäätöä HCC kehittämiseen.

tulokset

miR-199/214 on vaimentua HCC solulinjoissa ja kudoksissa

tutkimiseksi roolin miR-199 /214 klusteri HCC, tasot miR-214 ja miR-199-3p /5p määritettiin 23 paria HCC ja viereisten hyvänlaatuinen kudoksia käyttäen reaaliaikaista PCR. Tulokset osoittivat, että nämä miRNA olivat merkitsevästi alassäädetty ja miR-199-3p miR-199-5p miR-214 verrattuna viereisten nontumorous maksan kudoksissa. Vähentynyt miR-214 ilmentymistä havaittiin 65% HCC (15 23 tapausta), ja johdonmukainen alas-säätely Sekä miR-199-3p ja miR-199-5p myös havaittiin peräti 73% HCC (17 23 tapausta) (kuva 1A ja B). Samanaikaisesti HCC solulinjoissa HepG2 ja SMMC-7721, miR-199-3p /5p ja miR-214 ilmentyminen oli merkittävästi vähentynyt verrattuna ihmisen normaalissa maksassa (kuvio 1 C).

(A) Box juoni graafiset näytöt 23 HCC ja sovitettu viereisten hyvänlaatuinen kudoksiin ryhmitelty miR-199-3p ja miR-199-5p ilme. (B) rasiakuvaaja graafiset näytöt 23 HCC ja sovitettu viereisten hyvänlaatuinen kudoksiin ryhmitelty miR-214 ilme. (C) miR-199 a /b-3p ja miR-214 ilmentymistä ihmisen normaalia maksan, HepG2 ja SMMC-7721 HCC solulinjoissa havaittiin käyttäen reaaliaikaista qRT-PCR. Pylväät, keskiarvo kolmen erillisen kokeen; baaria, SD; * P 0,05 kontrolliryhmään.

miR-214 suoraan suunnattu XBP-1 vuorovaikutuksella 3′-UTR

tunnistaminen miRNA-säänneltyjen geenikohteet on välttämätön askel ymmärtää miRNA toimintoja. Vaikka miR-199-3p ja miR-199-5p on raportoitu edistää maksan syövän synnyn [5], [21], [22], rooli miR-214 HCC kasvainten synnyssä ei ole selvitetty. Siksi me seuraavaksi etsineet kohdegeenien miR-214 HCC. Otaksutuista miR-214 tavoitteet ennustettiin käyttämällä kohde ennustus ohjelmia, miRBase ja TargetScan. Olemme havainneet, että rinnastus HSA-miR-214 3′-UTR ihmisen XBP-1-geeni tunnistettiin miR-214 sitoutumiskohta (kuvio 2A). Sen vahvistamiseksi, että XBP-1 on oletettu tavoite miR-214, rakensimme kaksi lusiferaasin reportterivektoreita villityypin XBP-1 3’UTR ja mutatoitu XBP-1 3′-UTR (komplementaarinen sekvenssi siemenen alueen asennuspalveli- 214 sitoutumiskohta mutatoitiin). Kun ko-transfektoitiin miR-214 jäljittelee osaksi HepG2-soluissa, suhteellinen lusiferaasin aktiivisuuden XBP-1 3’UTR lusiferaasireportteri merkittävästi tukahdutti -50% verrattuna transfektion negatiivisen kontrollin. Sen sijaan, ei muutosta suhteellisessa lusiferaasiaktiivisuuden havaittiin soluissa, jotka oli transfektoitu mutantti-reportteri tai tyhjän vektorin (kuvio 2B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-214 tavoitteet XBP-1 suoraan sitomalla 3 ’UTR: XBP-1.

(A) Sekvenssiryhmittely ihmisen miR-214 3′-UTR XBP-1. Siementen sekvenssi miR-214 vastaa 3′-UTR XBP-1 luomiseksi XBP-1 3′-UTR tai mutantti lusiferaasireportterilla konstruktio. (B) miR-214 estää XBP-1 3′-UTR toimittaja mutta ei mutantti toimittaja tai tyhjä reportteriaktiivisuutta. HepG2-soluja transfektoitiin ohimenevästi ilmoitetuilla plasmidit miR-ohjaus, miR-214 jäljittelee. Seuraavat 36 h inkubaation jälkeen solut altistettiin lusiferaasianalyysissä. Pylväät, keskiarvo kolmen erillisen kokeen; baareja, SD. * P 0,05 vs miR-con. (C) miR-214 vähentää XBP-1 ilmentymisen HepG2 (vasemmalla) ja SMMC-7721 (oikealla) solut analysoitiin Western blot -menetelmällä.

lisäksi havaittu, että lyhytaikaista transfektiota HepG2 ja SMMC-7721 solut miR-214 tehokkaasti vähentää XBP-1-proteiinin tasot havaitaan western blotting -analyysi (kuvio 2C), joka on itsenäinen suhteessa ATF6 ja IRE1 signalointi (kuvio S1). Samanlaisia ​​tuloksia saavutettiin ihmisen epiteelin kohdunkaulan syövän Hela-solut (kuva S2). Nämä tiedot viittaavat siihen, että miR-214 suoraan tunnistaa 3’UTR XBP-1-mRNA: n ja estää XBP-1 käännös.

Lisäksi, Western blot-analyysi osoitti, että XBP-1-proteiinin tason nostettiin miR-214- vaimentua ihmisen HCC kudoksiin verrattuna viereisten nontumorous maksakudoksissa (kuva S3). Meidän analyysi paljasti, että XBP-1 oli mahdollinen kohde miR-214.

miR-214 säätelee HCC-solujen lisääntymisen ja apoptoosin

Aiemmat tutkimukset ovat sekaantuneet XBP-1 olennaisena eloonjäämistekijänä ER stressiä ja kasvaimen kasvua [30], joten valitsimme onko miR-214 käyttää päinvastainen vaikutus HCC lisätutkimuksia varten. Voit selvittää vaikutus miR-214 HCC soluproliferaatioon, HepG2 ja SMMC-7721-soluissa, olivat vastaavasti transfektoitu miR-214 jäljittelee tai miR-ohjaus ja analysoitiin solujen kasvua. CCK-8 lisääntymisen määrityksessä osoitti, että solujen kasvu väheni miR-214 jäljittelee-transfektoitujen HCC-soluissa verrattuna miR-ohjaus -transfected soluja tai käsittelemättömiä soluja (kuvio 3A). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin, jonka Br-dU sisällyttäminen määritys HepG2 ja SMMC-7721-soluja (kuvio 3B). Tulokset

in vitro

tutkimukset osoittivat, että eksogeenista miR-214 inhiboi merkittävästi proliferaatiota hepatoomasolulinjassa linjat.

(A) Suhteellinen solujen määrä HepG2 ja SMMC-7721-solujen 48 tunnin transfektion arvioitiin käyttäen CCK-8 määrityksessä. (B) Solujen kasvu HepG2 ja SMMC-7721-solujen 48 tuntia transfektion arvioitiin käyttäen Br-dU sisällyttäminen määrityksessä. (C) 48 tunnin kuluttua miR-214 jäljittelee transfektion jälkeen solut leimattiin anneksiini V: n ja analysoitiin virtaussytometrialla. (D) 48 tunnin kuluttua AGOMIR-214 käsittelyä, SMMC-7721-solut leimattiin anneksiini V: n ja analysoitiin virtaussytometrialla * P 0,05 vs käsittelemätön (HepG2 tai SMMC-7721) tai miR-con-käsitelty.

Lisäksi testasimme voimistunut miR-214 indusoi HCC apoptoosia ja solukuolemaa, määrittämällä joukko aikaisin ja myöhään apoptoottiset HepG2-soluissa seuraavat käsittelyt miR-214 matkii virtaussytometrisellä analyysi. Kuten odotettua, muutaman anneksiini V-positiivisia soluja havaittiin miR-ohjaus-käsitellyt tai käsittelemättömät solut, kun taas miR-214 palauttaminen prosenttiosuus kasvoi apoptoottisten solujen (-20% HepG2), kuten on päätelty anneksiini V-värjäyksellä (kuvio 3C) . Johdonmukaisesti samanlaisia ​​vaikutuksia on havaittu myös SMMC-7721-soluja käsiteltiin kolesterolia konjugoitu 2′-O-metyyli-muunnetun miR-214 jäljittelee (AGOMIR-214) (kuva 3D). Nämä tulokset osoittavat kasvua estävää roolia miR-214 HCC.

miR-214 säätelee HCC kasvainten muodostumista ja kasvua in vitro ja in vivo

Edellä esitetyt havainnot sai meidät tutkimaan biologista merkityksen miR-214 HCC kasvainten synnyssä in vivo. Aloitusvaiheessa, kapasiteetti pesäkkeen muodostumista arvioitiin SMMC-7721-soluja transfektoitiin AGOMIR-214 ja AGOMIR negatiivinen kontrolli (AGOMIR-NC). Tulokset osoittivat, että AGOMIR-214-käsitellyt solut näytetään paljon vähemmän ja pienempiä pesäkkeitä verrattiin AGOMIR-NC käsitellyt solut (kuvio 4A), mikä oli sopusoinnussa soluproleferaatiomäärityksessä. Edelleen, AGOMIR-NC- ja AGOMIR-214-käsitelty SMMC-7721 solua injektoitiin s.c. kumpaankaan posterior kylkeen saman nude-hiirten, vastaavasti. Sen jälkeen, kun 4 viikkoa, koko kasvaimen kyhmyt tutkittiin. Olemme havainneet, että kasvaimen koossa ja tuumorin paino lopussa havainto merkittävästi vähentynyt AGOMIR-214 hoitoryhmässä verrattuna, että AGOMIR-NC-hoitoryhmässä (kuvio 4B). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös HepG2 solujen ksenografteissa trandfected kanssa miR-214 jäljittelee in vivo (kuvio S4 ja S5) .Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-214 voi toimia oletetun tuumorisuppressori HCC-soluissa.

(A ) XBP-1 uudelleen käänteinen tukahduttaminen pesäkkeiden muodostumisen aiheuttama AGOMIR-214 käsittely SMCC-7721-soluissa. (B) XBP-1 uudelleen käänteinen tukahduttaminen kasvaimen muodostumisen aiheuttama AGOMIR-214 käsittely nude mouse SMCC-7721-solujen ksenograftimallissa. Kasvaimen paino 4 viikon kuluttua inokulaation mitattiin. (C) XBP-1 uudelleen käänteinen tukahduttaminen solujen lisääntymistä aiheuttama AGOMIR-214 käsittely SMCC-7721-soluissa. Tulokset olivat toistettavissa kolmessa riippumattomassa kokeessa. * P 0,05 vs AGOMIR-NC-käsitelty; # P 0,05 vs AGOMIR-214 tai AGOMIR-214 + vector saaneista.

varmistamiseksi edelleen voimakas rooli miR-214 /XBP-1-reitin välittämisessä tuumorisoluissa selviytymistä ja säätelyssä HCC kasvaimen kasvua, me uudelleen ilmaistaan ​​XBP-1 in miR-214 käsiteltyjen HCC-soluissa. Tulokset osoittivat, että palautettu XBP-1 ilmentymisen transfektoimalla pCMV-XL5-XBP-1s heikennettyjä AGOMIR-214 välittämä XBP-1 tukahduttaminen ja tuumorisuppressoriproteiinia vaikutukset

in vitro

ja

in vivo

(kuva S6 ja 4A-C).

taitettuna proteiinivaste downregulates miR-199/214 ilmentymisen HCC-soluissa

miR-214 tavoitteet XBP-1 ja XBP-1 on tärkeä efektori UPR ja ER stressi [31], [32], me tutki tarkemmin sitä saattaa olla yhteys miR-214 down-ilmaisun ja aktivointi UPR HCC in hepatoomasolujen. Validoida vaikutus UPR Mir-214 ilmentyminen HCC-soluissa, kaksi klassista UPR indusoijan thapsigargin (TG) ja tunikamysiinillä (TM) synnyttämiseen käytettiin aktivointi UPR HepG2-soluissa. Inkubointi HepG2-solujen TG (5 mikromol /l) ja TM (5 ug /ml) selvästi kohonnut GRP94 ja XBP1 liittämiseen proteiinin taso, joka osoittaa UPR aktivointi. Reaaliaikaisen RT-PCR tulokset osoittivat, että miR-214 ilmentyminen oli merkitsevästi alassäädetty HepG2-soluissa jälkeen TG ja TM hoitoa 24 h (kuvio 5A). Kuten miR-199-3p, miR-199-5p ja miR-214 sekvenssit olivat klusteri, Huomasimme myös, että tasot miR-199-3p ja miR-199-5p vähennettiin verrattuna ajoneuvon ryhmä (kuvio 5A). Lisäksi olemme edelleen testata vaikutusta hypoksian aiheuttaman UPR tasosta miR-199/214 ilme. Ilmentymistasojen miR-199 ja miR-214 oli myös pienempi HCC-soluissa alttiina hapettomuudelle aiheuttama CoCl

2 (100 umol /l) (kuvio 5B). Siten miR-199 ja miR-214 ekspressiotasot ovat alas-säätelee UPR erilaisissa fysiologisissa ja patologisissa tiloissa.

(A) HepG2-solut käsiteltiin Thapsigargin (TG, 5 umol /l) ja tunikamysiiniä (TM , 5 ug /ml) 24 tuntia analysoitiin western-blottauksella ja GRP94 ja XBP1 ekspressiotasot ja analysoitiin reaaliaikaisella RT-PCR: llä miR-199-3p /-5p ja miR-214 ilmentymistä. (B) HepG2-solut käsiteltiin CoCl

2 (100 uM) 24 tunnin analysoitiin Western blottauksella varten GRP94 ja XBP1 ekspressiotasot ja analysoitiin reaaliaikaisella RT-PCR miR-199-3p /-5p ja miR -214 ilme. Pylväät, keskiarvo kolmen erillisen kokeen; baaria, SD; * P 0,05 vs käsittelemätön (HepG2) tai DMSO-käsitelty.

NFKB on mahdollinen negatiivinen säätelijä miR-199-2 /miR-214-geenin

Kuten on esitetty Kuva S7, miR-199a2 ja miR-214 oli säännelty klusterin pri-miR-199a2 sisällä ihmisen Dnm3os geenit; me seuraavaksi tutkinut miR-199a2 promoottori transkription tekijä sitoutumiskohdista, ja tunnistettiin 3 mahdollisten otaksuttu NFKB sitoutumiskohtia on 1,2-kb DNA-fragmentti ylävirtaan pre-miR-199a2 (Kuva S8). Joten testasimme NFKB on mukana sääntelyn miR-199a2 /214 ilme. Kuten on esitetty kuviossa 6A, lipopolysakkaridi (LPS) (10 ug /ml), joka on tunnettu indusoija NFKB aktiivisuus, indusoi NFKB aktivaation ja esti miR-199a2 /214 ilmentymisen SMMC-7721-soluja. Sen sijaan, transfektio siRNA kohdistaminen ihmisen p65 vähentää NFKB ilmaisun ja lisääntynyt miR-199a2 /214 tasolla SMMC-7721-solut (kuvio 6B). Nämä tiedot osoittivat, että NFKB on mahdollinen negatiivinen säätelijä miR-199-2 /miR-214 klusterin.

(A) LPS (10 ug /ml) indusoi NFKB p65 ilmentymistä, vaimentaa miR-199 /214 ilmentymisen SMMC-7721-soluissa. (B) siRNA erityisesti suunnattu ihmisen NF-kB P65 alayksikköä (100 nM) dereased NFkB p65 n ekspression ja lisääntynyt ilmentyminen miR-199/214 SMMC-7721-soluissa. (C) NF-KB aktivoituu ER stressiä ja hypoksia HepG2-soluissa analysoitiin Western-blottauksella. (D, E) miR-199/214 ilmentymisen HepG2-soluissa käsitelty ER stressiä indusoijan (5 mikromol /l TG ja 100gM CoCl

2) ja NFKB estäjät PDTC (100 uM). * P 0,05 vs käsittelemätön (HepG2 tai SMMC-7721) tai DMSO tai siRNA con käsitelty; # P 0,05 vs TG tai CoCl

2 hoitoa.

Lisäksi huomasimme, että altistuminen TG aiheuttamaa NFKB aktivaation HepG2-soluissa (kuvio 6C), ja tukahdutti miR-199a2 /214 lauseke ( kuvio 5A). Yhdenmukainen Näiden tulosten voimakas NFKB estäjän pyrrolidiiniditiokarbamaattiliuoksella (PDTC) (100 uM) merkittävästi käänteinen estävä vaikutus UPR Mir-199a2 /214 lauseke (kuvio 6D), merkityksen korostaminen UPR /NFKB väylän miR-199a2 /214 ilme.

lisäksi olemme myös selvittäneet NFKB pystyy säätelemään miR-199/214 ilmaisun yhteydessä anoxia. Tulokset osoittivat, että 100 mikromol /l CoCl

2 hoitoa myös indusoi NFKB ja laski miR-199a2 /214 tasoja HepG2-soluissa samanaikaisesti, ja esto NFKB vaimenee vähentäminen miR-199a2 /214 jälkeen todetut hapettomissa hoidon (kuvio 6C ja E). Siten nämä tiedot osoittivat, että UPR välittämä negatiiviseen säätelyyn miR-199a2 /214 vaikka aktivointi NFKB osallistua HCC etenemiseen.

Keskustelu

miRNA ovat negatiivisia säätelijöitä geenien ilmentyminen ja voi toimia tuumorisuppressoreilla tai onkogeenien [33]. Joissakin erityisesti miRNA ilmoitettiin ilmentyä erilailla eri syövän, kuten miR-199/214 klusteri. Lisääntynyt taso miR-214 löytyi munasarjasyöpä [28], mahasyöpä [34] ja melanooma [26], joka indusoi kemoterapian resistenssin tai kasvaimen etäpesäke. Mutta kohdunkaulan syövän [27], [29] ja rintasyövän [35], miR-214 ilmentyminen väheni, mikä viittaa siihen, kasvainsuppressorigeenin kaltainen toiminto. Mahdollinen selitys oli, että yksittäiset miRNA tavoitteet useita kohteita eri soluissa. Useat miR-214 tavoitteet on tunnettu eri kasvaintyypeissä (munasarjasyöpä, kohdunkaulan syöpä ja melanooma), mukaan lukien MEK3, JNK1 [29], PTEN [28], [36], Plexin-B1 [27], Ezh2 [35], [37], ja TFAP2C [26] ja niin edelleen. Tutkimuksessamme olemme edelleen tunnistettu XBP-1 uutena kohteena miR-214 sitomalla sen 3′-UTR HCC-soluissa. Lisäksi olemme havainneet, että ilmaukset Ezh2 ja plexin-B1 ei korreloi negatiivisesti miR-214 miR-214-vaimentua HCC kasvainnäytteet (tuloksia ei ole esitetty). Perustuen näihin huomautuksiin, on oletettu, että XBP-1, mutta ei Ezh2 ja plexin-B1, on ”ensisijainen” tavoite miR214 HCC riippuen eri solujen yhteydessä.

Kuten tiedämme, XBP- 1, merkittävä transkription säätelijä avatulla proteiinivaste, säätelee osajoukko ER asuvien kaperoni- geenien levitetyssä proteiinivaste suojella syöpäsolujen riittämättömästä ympäristössä kuten hypoksiaa tai glukoosin poisto [31], jotka ovat yleisesti kohtaamat vahvimmista kasvaimet mukaan lukien HCC. Klonogeeniset selviytyminen XBP-1-puutosta kasvainsolujen väheni merkittävästi aikana vaikean hypoksian /anoxia in vitro ja XBP-1-pudotuspelit kasvainsolut eivät pystyneet kasvamaan kuten kasvaimiin in vivo [30], mikä viittaa siihen, että XBP-1 on välttämätön kasvainsolun eloonjäämistä hypoksisissa olosuhteissa ja kiinteiden kasvainten muodostumista ja kasvua. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että korkeus silmukointia XBP-1-mRNA: n, jolloin aktivointi XBP-1product, sekä Grp78 ja ATF6, esiintyi HCC kudosten lisääntynyt histologinen luokittelua [38]. Samoin olemme havainneet, että XBP-1-proteiinin tason nostettiin miR-214-downexpressed ihmisen HCC kudoksissa. Yhdessä nämä tutkimukset osoittivat, että alassäädetty miR-214 HCC syöpä aiheuttaa yli-ilmentyminen XBP-1, mikä puolestaan ​​kiihdyttää kasvainten synnyssä. Mielenkiintoista, samanlainen tulos miR-214-välitteistä XBP-1 tukahduttaminen saavutettiin myös Hela-soluissa. Se on yhdenmukainen viimeaikaisten raporttien mukaan miR-214 säätyy alas ihmisen kohdunkaulan syövän ja säätelee negatiivisesti Hela-solujen lisääntymisen [27], [29]. On mielenkiintoista nyt selvittää yli-ilmentyminen miR-214 tai modulaatio sen kohdentaminen voisi tarjota uutta hoitomuotoa Mir-214-puutosta kasvain, kuten HCC, kohdunkaulan syövän ja rintasyövän.

vuonna Toisaalta tutkimuksemme osoitti, että merkittävä alas-säätely MIR-199/214 klusteri havaittiin ihmisen HCC kudoksissa ja HCC solulinjoissa verrattuna normaaliin maksan, yhdenmukaisia ​​aiempien havaintojen profiloinnin miRNA ilmaisun HCC [ ,,,0],9], [39], [40], [41], [42]. Mutta mikä on mekanismi miR-199/214 cluster alas-ilmentymisen HCC? Kasvava tulokset ovat osoittaneet, että aikana ER stressi, UPR edustaa mukautuva mekanismi, joka tukee selviytymistä ja chemoresistance kasvainsolujen, ja on myös kehittymässä keinona kasvainsolujen lisäämään eloonjäämistä olosuhteissa metabolisen stressin, hypoksia, ja ehkä jopa kemoterapiaa [43]. Lisäksi aktivointi MEK /ERK ja mTOR on raportoitu olevan keskeinen rooli valvoa solujen eloonjäämistä tai solukuolema signalointi aiheuttama ER stressin [44], [45], [46]. Kuten UPR transkriptiotekijä XBP-1 tunnistettiin tavoitteeksi miR-214 ja viimeaikaiset tutkimukset ovat paljastaneet tärkeitä toimintoja miR-199 a /b-3p HCC syövän synnyn ja etenemisen kohdentamalla mTOR ja c-Met tai PAK4 /Raf /MEK /ERK Pathway HCC-soluissa [5], [21], päätimme tutkia tarkemmin korrelaatio UPR aktivointi ja miR-199/214 alas-ilmaisua. Tulos osoittaa, että miR-214 ja miR-199-3p /5p oli merkitsevästi alassäädetty HepG2-soluissa jälkeen TG ja TM hoitoja tai hapenpuute edelleen viittaa siihen, että UPR aktivoitu XBP-1 tai mTOR ja ERK-reitin suojella kasvainsolun eloonjäämistä vaikka tukahduttaminen n miR-199a2 /214 klusteri HCC.

Voit aloittaa purkautuu sääntelymekanismit Mir-199a2 /214 ilmentymistä UPR olosuhteissa yksityiskohtaisemmin, olemme edelleen havainneet, että UPR aktivoitu NFKB samanaikaisessa tukahduttaminen asennuspalveli- 199a2 /214 transkriptio, ja tämä tukahduttaminen purettiin NFKB estäjä PDTC HepG2-soluissa, joka ehdotti, että NFKB on mahdollinen negatiivinen säätelijä MIR-199 a-2 /miR-214 klusteri. NFKB on tärkeä transkriptiotekijä, joka on viime vuosina tullut keskeinen säätelijä muuttuneen geenin ohjelmien ja pahanlaatuisen fenotyypin kehittämisessä syöpien [47]. Varhaiset tutkimukset osoittivat, että monet syövät, kuten rintasyöpä, keuhkosyöpä ja lymfooma, ja HCC, konstitutiivisesti ilmentävät korkeita NFKB [48], [49]. Lisäksi, hypoksia HCC-soluissa ja kudoksissa indusoitu NFKB yliekspressio ja /tai konstitutiivinen aktivaatio [50], [51]. Oli sääntely SP1 /NFKB /HDAC /miR-29b verkossa, ohjaamaan onkogeenin ilmentymisen akuutti myelooinen leukemia (AML) [52]. Tutkimuksessamme osoitimme että NFKB ja XBP-1 olivat pääasiassa ilmaistiin mutta miR-214 väheni merkittävästi ihmisen HCC kudoksissa, miR-214 suoraan suunnattu XBP-1, ja UPR tai hypoksian indusoiman-NFicB aktivaation negatiivisesti ohjaa miR-199 /214 klusteri transkription HCC-soluissa. Siksi uusi UPR /NFKB /miR-214 /XBP-1 sääntelyyn piiri ehdotettiin HCC etenemistä, jossa NFKB aktivoitiin UPR ja osallistui negatiiviseen säätelyyn miR-199/214 säädellä HCC etenemisen (kuvio 7) . Tämä sääntelymekanismina osittain selittää sen PDTC hoito estyy NFicB aktivointi, edistänyt HCC-solut apoptoosin ja tukahdutti kasvaimen kasvua [53], kun taas LPS indusoi NFicB aktivaation ja edistettävä kasvainsoluproliferaation ja metastaattista kasvua [54], [55], [56], [57]. Varmasti enemmän todisteita NFKB sitoa sivuston promoottori miR-199/214 klusteri tarvitaan tulevaisuudessa tukemaan tätä hypoteesia ja lisää tutkimuksia tarvitaan selvittämään, onko ER stressiä myös aktivoida muita tekijöitä (egSp1) yhdessä mukana downregulation Mir-199/214 kohteessa HCC. Tästä huolimatta edelleen ymmärrystä molekyylimekanismin ja verkko jolla miR-199/214 cluster toiminnot voidaan tarjota uusia keinoja tutkimusta, jotka voisivat auttaa varhainen diagnosointi ja hoito tämän erittäin pahanlaatuinen kasvain.

miR-214 /XBP-1-reitin osoitettiin tässä työssä, kun taas miR-199-3p /mTOR ja miR-199-5p /DDR1 reittejä raportoitu muissakin tutkimuksissa.

Yhteenvetona havaintomme paljasti, että ER stressi estää ilmentymisen miR-199/214 cluster aktivoimalla NFKB upregulate pro-eloonjäämisen XBP-1 ilmentymisen, joka ehdotti uutta UPR /NFKB /miR-214 /XBP-1 sääntely piiri joiden toimintahäiriö voi myötävaikuttaa kasvaimen selviytymisen ja etenemisen HCC. Tutkimuksemme tarjoaa uutta tietoa tuumorisuppressorigeenin aktiivisuutta myönnetty miR-199/214 ja mahdolliset mekanismit hepatokarsinogeneesin.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit ja reagenssit

Materiaalit olivat saatu seuranta toimittajilta: vasta-aineet XBP-1, ATF6, NFKB, GAPDH, ja β-aktiini oli Santa Cruz bioteknologian Inc. (Santa Cruz, CA); antibodie vastaan ​​GRP94 Cell Signaling Technology (Beverly, MA); vasta-aine aganist p-IRE1 olivat Thermo Scientific Pierce Vasta-aineet (Rockford, IL); solulaskennan kit-8 saatiin Beyotime Biotekniikan instituutti (Nantong, Kiina); Br-dU soluproliferaatiota ELISA kit saatiin Roche (Penzberg, Saksa); pCMV6-XL5-XBP-1s plasmidi ostettiin Origene (Rockville, MD); miRNA negatiivinen kontrolli (miR-con ja anti-miR-con), miR-214 jäljittelee ja anti-miR-214, AGOMIR-214 ja AGOMIR-NC, antagomir-214 ja antagomir-NC, siRNA kohdistaminen ihmisen NFKB /p65 saatiin alkaen RiboBio (Guangzhou, Kiina); Kaikki muut kemikaalit ja reagenssit hankittiin Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich Kiina Inc., Shanghai, Kiina) ellei toisin mainita.

Human kasvainnäytteestä

Yhteensä 23 snap-jäädytetty normaali ja pahanlaatuiset maksakudoksissa (14 miestä ja 9 naista, keski-ikä, 65,0 y, alue, 50-78 y) kerättiin Tongji sairaala (Wuhan, Hubein Kiina). Ihmisen normaali maksakudoksissa saatiin distaalisesta normaali maksan kudoksen maksan hemangioma potilaista. Tutkimus hyväksyi Review Board Tongji sairaalan ja Tongji Medical College. Koehenkilöt rekrytoitiin tutkimukseen esittänyt kirjallisia lupaa. Tutkimus noudattaa esitettyjä periaatteita Helsingin julistus. Otettiin kudosnäytteet ja säilytetään pakastettuina nestemäisessä typessä ja säilytetään sen jälkeen -80 ° C: ssa käyttöön asti.

Soluviljely

Ihmisen hepatoomasolulinjaan HepG2 ja ihmisen kohdunkaulan syövän solulinja Hela saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA), ja Human hepatoomasolulinjassa SMMC-7721 oli valiokunnan Type Culture Collection of Kiinan tiedeakatemia (Shanghai, Kiina), ja ylläpitää suosittelemia lähteen. Soluja viljeltiin DMEM: ssä, joka oli säädetty sisältämään 4 mM L-glutamiini, 1,5 g /l natriumbikarbonaattia, 4,5 g /l glukoosia, 10% FBS, 100units /ml penisilliiniä, ja 65units /ml streptomysiiniä. Kaikkia solulinjoja pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa, joka sisälsi 5% CO

2.

Cell transfektio ja hoitoja

HepG2 ja SMMC-7721-soluja transfektoitiin miRNA /siRNA negatiivinen kontrolli (miR-con ja SIR-con), miR-214 jäljittelee tai siRNA kohdistaminen ihmisen NFKB /p65 (RiboBio, Guangzhou, Kiina) käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan protokollaa. SiRNA sekvenssit ihmisen NFKB /p65 olivat: 5’GCC CUA UCC CUU UAC GUC A-3 ’[58]. SMMC-7721-soluja käsiteltiin 100 nM AGOMIR-214 ja AGOMIR-NC, antagomir-214 ja antagomir-NC ja kerättiin 24 tuntia käsittelyn jälkeen ksenotransplantaatioon nude-hiiriin modle ja Br-dU sisällyttäminen määrityksessä. HepG2 Soluja käsiteltiin 5 ug /ml thapsigargin ja 5 mikromol /l tunikamysiinillä ja kerättiin 24 tunnin kuluttua hoidon western blotting (WB) analyysit ja RNA. Hypoksinen olosuhteet luotiin käyttämällä 100pM CoCI

2 24 tuntia ennen solujen keräämistä.

Western blot-analyysi

Proteiinit solulysaateista (20 ug) erotettiin 10% SDS -polyacrylamide geelielektroforeesi ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvo. Kun oli salvattu 5% rasvaton maito, proteiini blotteja inkuboitiin spesifistä vasta-ainetta, jota seuraa inkubointi peroksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen estopuskurissa.