Krooninen sairaus

tiivistelmä

PTEN on voimakas kasvaimen soriproteiini. Aggressiivinen ja metastaattinen eturauhassyöpä (PC) liittyy vähenemiseen tai menetykseen PTEN ilmaisua. PTEN vähentäminen tapahtuu usein ilman geenimutaatioita, ja sen downregulation ei ole täysin ymmärretty. Tässä osoitamme, että PTEN on sisällytetty lastin eksosomeiksi peräisin syöpäsoluja. PTEN ei havaita eksosomeiksi johdettu normaalista, noncancerous soluja. Huomasimme, että PTEN voidaan siirtää muihin soluihin kautta eksosomeiksi. Soluissa, jotka ovat vähentäminen tai täydellinen menetys PTEN ilmaisun, siirretyn PTEN on toimivalta antaa kasvaimeen suppressioaktiivisuutta vastaanottajarakkuloihin soluihin. PC potilailla, osoitamme, että PTEN on sisällytetty lastin eksosomeiksi jotka kiertävät veressä. Mielenkiintoista, normaalihenkilöihin ole PTEN ilmentymistä veressään eksosomeiksi. Lisäksi huomasimme, että eturauhasen antigeenin (PSA) on sisällytetty PC potilaiden ja normaalien koehenkilöiden veren eksosomeiksi. Nämä tiedot viittaavat siihen, että exosomal PTEN voi kompensoida PTEN menetys PTEN vajaiden solujen, ja saattaa olla diagnostista arvoa eturauhassyöpään.

Citation: Gabriel K, Ingram A, Austin R, Kapoor A, Tang D, Majeed F , et ai. (2013) asetus tuumorisuppressorigeenin PTEN kautta Eksosomit A Diagnostic Mahdolliset eturauhassyöpään. PLoS ONE 8 (7): e70047. doi: 10,1371 /journal.pone.0070047

Toimittaja: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 12 marraskuu 2012; Hyväksytty: 17 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 25 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Gabriel et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ myönsi Eturauhassyöpä Kanadassa ja on ylpeänä rahoittama Movember Foundation, Grant # D2013-2 varten K.Al. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PC) on yleisimmin diagnosoitu syöpä ja toiseksi eniten syöpään liittyvien kuolemien miesten [1], [2], [3]. Menetys yhden kopion PTEN geeni vaikuttaa eturauhasen kasvain aloittamista, kun taas edelleen vähentää PTEN ilme tukee hyökkäyksen ja metastaattisen käyttäytymisen PC [4]. PTEN on proteiini /rasva-fosfataasi. Sen proteiinityrosiinifosfataasi domeeni on piirteitä dual-spesifisyys fosfataasi, joka pystyy defosforyloida sekä tyrosiini- ja seriini /treoniinitähteissä. Tärkeimmät lipidisubstraatin PTEN on fosfatidyyli (3,4,5) trifosfaatin (PIP-3). Tärkein kasvainten tukahduttamisen PTEN on ylläpitää solu PIP-3 matalalla tasolla, estäen siten PI3K-AKT-reitin aktivaation ja edistää solujen apoptoosin tai solusyklin pysähtymiseen [5]. Vähentäminen PTEN-proteiinin ekspression tapahtuu usein ilman geenimutaatioita [6], [7], [8]. Kaikkiaan noin 70-80% ensisijainen PC kasvaimet ovat vähenemiseen PTEN ilmaisun [9]. Erilaisia ​​mekanismeja, jotka auttavat vähentämään PTEN ilmaisun kasvaimissa on tunnistettu, mukaan lukien promoottori metylaatio [10], [11], ja negatiivinen säätelijä proteiinit [12]. On ehdotettu, että muut, tuntematon mekanismeja voidaan toimivat monissa kasvaimissa [10], [11]. Tuloksemme viittaavat uusi mekanismi, jolla syöpäsolut säätelevät PTEN ilmaisun eksosomeiksi.

Syöpäsolut vapauttavat vesikkelit ympäristöönsä. Mikrovesikkeleitä ovat yksi erilaisia ​​irtoa rakkulat, avulla luotua suoraa orastava solukalvon. Eksosomit ovat toinen, suhteellisesti pienempi tyyppi rakkula jotka tallennetaan multivesikkelisten elimissä ja vapautetaan, kun multivesikkelisten runko sulakkeita solukalvon [13], [14]. Eksosomi sisältö heijastaa sen solu- lähde [15], [16]. Mielenkiintoista on, että nämä sisällöt voi kuulua onkogeenisten proteiinien, kuten olemme aiemmin raportoitu [17], [18], tai kasvaimia estävä proteiineja, kuten on raportoitu tässä. Siten voisi odottaa, että molekyylit siirtää eksosomeiksi anneta hankittu fenotyyppi vastaanottajarakkuloihin soluihin, mikä johtaa positiivisiin tai negatiivisiin vaikutuksiin nähden kasvaimen etenemistä riippuu luonteesta molekyylien siirretään. Lastin eksosomeiksi voisi siten muuttamaan tasapainon onkogeeninen ja kasvaimia estävä ominaisuuksia. Analyysi lastista voisi osoittaa ilmentymisen tilan tuumorisuppressorin proteiinien pahanlaatuisten solujen joutumatta suoraan näyte maligniteetti. Eksosomit ovat nousemassa tärkeä syövän biomarkkereita ja kuvataan biomarkkerina aarre arkkua PC [19]. On ehdotettu, että PTEN tilaansa PC potilaat voivat olla ennustaja potilaiden riski syövän etäpesäkkeiden tai toistumisen jälkeen eturauhasen [20], [21], [22]. Jo vuosikymmeniä, eturauhasen antigeenin (PSA) on käytetty standardin biomarkkerina havaitsemiseksi PC [23]. Kuitenkin käyttö PSA rajoittaa sen spesifisyyden puutteen ja kyvyttömyys erottaa veltto ja hengenvaarallisia tautimuodoille aikaan diagnoosi [24]. PSA saattaa vähentää kuolleisuutta PC, mutta se liittyy myös korkea ylidiagnostiikka ja ylihoito [25], [26]. Heidän tutkimuksessaan Harvey et al. päätteli, että PSA-testi on korkea vääriä positiivisia ja merkittäviä väärien negatiivisten tulosten osuus [27]. Tämä puute ennusteen arvioinnissa johtaa valtavaan kasvuun tarpeetonta koepaloja ja ylihoito vähäriskisten PC potilaista [23], [25]. Näiden havaintojen on vakava tarve löytää uusia merkkiaineita PC tai parantaa spesifisyys PSA-testi.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

monoklonaalisia vasta-aineita varten PTEN, AKT, Flotilin-1, P27, ja sykliini D1 ostettiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Kaikkien vastaavien HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineet hankittiin Cell Signaling. Alexa Fluor 488 sekundaariset vasta-aineet hankittiin Molecular Probes (Eugene, OR).

Solulinjat.

DU145, PC-3 (ihmisen eturauhasen syöpäsolujen), U87 (ihmisen glioblastooma astrosytooma) ja ihmisen normaalit solut [ihmisen aortan endoteelisoluja (HAOEC), Human aortan sileän lihaksen soluja (HAOSMC) ja ihmisen eturauhasen epiteelisolujen (HPEC)] ostettiin ATCC: ltä (Manassas, VA). DU145 soluja PTEN taintumisen (DU145Kd) ja DU145 solut transfektoitu epäspesifinen siRNA alun perin tuotettu yhdessä meidän laboratorioissa (D. T.) klo Hamilton Munuainen tutkimuskeskuksen (HKRC), McMaster University. DU145Kd solut muodostettiin käyttäen PTEN siRNA ilmaistaan ​​retroviruspohjaisia ​​H1 promoottoriajetun shRNA vektori, ja ohjaus DU145-solut infektoitiin retroviruksella, joka ekspressoi epäspesifinen siRNA, kuten aikaisemmin on yksityiskohtaisesti [12]. CHO ja CHO-EGFR-solut saatiin aikaisemmin antelias lahja tri Guha laboratoriossa The Hospital for Sick Children, Toronto. Kaikki solulinjat tässä tutkimuksessa käytetyt viljeltiin Mikrovesikkeliin-köyhdytettyä FBS (sentrifugoimalla yön yli 100000

g

). Vakio kulttuuri, soluja kasvatettiin Dulbeccon modifioidussa perusalustassa (DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS).

eristäminen Eksosomit esikäsitellystä väli- ja veriplasman

Eksosomit kerättiin median eri solulinjojen ja ihmisen plasmasta, kuten aikaisemmin on kuvattu [18], [28], [29]. Lyhyesti, elatusaine kerättiin soluista noin 80% konfluenssiin, ellei toisin ole mainittu, ja tämä materiaali altistettiin kahden peräkkäisen sentrifugoinnin 300

g

5 minuuttia ja sitten 12000

g

20 minuuttia solujen poistamiseksi ja roskat. Lopuksi, eksosomeiksi saatiin sentrifugoinnin jälkeen 2 tuntia 100000

g

ja sitten pestiin kaksi kertaa suurella tilavuudella fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS). Tämä protokolla nimenomaan kerää eksosomeiksi ja sulkee pois suurten rakkulat. Eksosomi proteiinit talteen mitattiin Bradfordin menetelmällä (Bio-Rad).

PTEN Expression Profiili

Solut (DU145, DU145Kd, ja DU145 ohjaus- siRNA) ja ensisijaisen soluja (HAOEC , HAOSMC ja HPEC), sekä niiden vastaavat eksosomeiksi, lyysattiin 10 minuuttia jäillä lyysipuskurissa, joka sisälsi: 10 mM Tris (pH 6,8), 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 30 mM natriumpyrofosfaatti, 2% (paino ./vol) SDS, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF), ja 1 mM Na

3Vo

4. Lysaatit erotettiin SDS-PAGE: lla ja alistettiin immunoblottaukselle kanin monoklonaalisia vasta-aineita PTEN. Immunodetektio saatiin aikaan käyttämällä sopivaa HRP-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta ja kemiluminesenssin plus-kittiä (ECL-kitti, Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, Yhdistynyt kuningaskunta), minkä jälkeen blotit skannattiin ja proteiinivyöhykkeet kvantitoitiin käyttäen Määrä One-ohjelmisto (Bio-Rad, CA) .

havaitsemiseen Signaling Tapahtumat liittyvät PTEN

vaikutusten arvioimiseksi eksosomeiksi jotka sisältävät PTEN on DU145Kd soluihin, jälkimmäinen maljattiin 100 mm maljoille tiheydessä 2 x 10

5 solua /ml, kasvanut lyhyesti, ja nälässä 24 tunnin ajan (joko DMEM täydennettynä 0,5% FBS, tai seerumivapaassa DMEM). Viljelmiä stimuloitiin sitten yön yli eri pitoisuuksilla eksosomeiksi peräisin DU145-soluissa. Jälkeen eksosomi hoito, solulysaatit valmistettiin ja analysoitiin niiden signaloinnin efektori sisällön käyttäen anti-fosfo-AKT-vasta-aineita (Cell Signaling), mukaan toimittajan suositusten. Havaitseminen ilmaisun p27 ja sykliini D1 suoritettiin käyttäen samaa kokeellista asetuksista havaitsemiseksi Pakt.

fluoresoiva kuvantaminen eksosomi otto

in vitro

analyysi PTEN ilmentymisen, soluja kasvatettiin kammiossa levyt (Nalge Nunc, NY). Viljelmiä pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin esilämmitettyyn (37 ° C) 4% (p./til) paraformaldehydiä (PFA) fosfaatilla puskuroidussa suolaliuoksessa 5 minuuttia. Seuraavaksi ne pestiin kolme kertaa PBS: ssä, ja antiquenching suoritettiin 50 mM NH

4CL 10 minuuttia huoneen lämpötilassa. Tämän jälkeen solut pestiin kahdesti PBS: ssä ja inkuboitiin BSA [1% (p./til) PBS: ssä], 30 minuuttia. Inkubaatio primaarisen vasta-aineen suoritettiin 1 h, mitä seurasi pesu PBS: ssä, ja sitten inkuboimalla sekundaarisen vasta-aineen 30 minuuttia. Värjäyksen jälkeen leikkeet kiinnitetään käyttäen Dako loisteputki kiinnitysväliaine ja tarkasteltiin konfokaalisella mikroskoopilla havaitsemiseksi exosomal sisältöä (PTEN) vastaanottajan solut.

PTEN Activity Assay

Lysaatit DU145Kd soluja, joita käsiteltiin eksosomeiksi alkaen DU145 soluista, tehtiin immunosaostus käyttäen PTEN-vasta-aineita (Cell Signaling) ja Protein G Sepharosea. PTEN aktiivisuus arvioitiin käyttäen vesiliukoista substraatti DiC8PtdIns (3, 4, 5) P3 (Echelon). Vapautuneet vapaat fosfaatit mitattiin BIOMOL Green reagenssin ja normalisoidaan reaktiossa, joka sisälsi vain PIP3 substraattia [12].

havaitseminen PTEN mRNA

DU145Kd soluja käsiteltiin eksosomi valmisteet, jotka ovat peräisin DU145, minkä jälkeen pesty ja RNA: n käyttäen Trizol-reagenssia (Invitrogen, NY). RT-PCR-analyysi suoritettiin käyttäen yksivaiheista menetelmää (Qiagen, CA), jossa PTEN havaittiin käyttäen alukesarjoja: sense 50-ATGACAGCCATCATCAAAGAG-30 ja antisense-50-GTGCCACTGGTCTATAATCCAG-30 [12]. Reaktiot suoritettiin 50 ul: alkuperäiseen Taq aktivointi 95 ° C: ssa 30 minuuttia, minkä jälkeen 30 sykliä denaturointi 95 ° C: ssa 30 sekuntia, alukkeen 60 ° C: ssa 1 minuutti, ja pidennys 72 ° C: ssa 30 sekuntia. Tuotteet erotettiin 1% agaroosigeelillä ja valokuvataan. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina käyttämällä alukesarjat: sense 50-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-30 ja antisense-50-TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT-30.

proliferaatiotestillä

lisääntymisen määritys suoritettiin käyttämällä määritystä kit (Chemicon ) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, 0,1 x 10

4 DU145Kd solua maljattiin 96-kuoppaiselle levylle; 24 tunnin kuluttua solut käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla eksosomeiksi peräisin DU145-soluissa. Muut DU145Kd soluja käsiteltiin DU145Kd johdettu eksosomeiksi osoittaa vaikutuksen eksosomeiksi kanssa vaimentua PTEN. DU145 soluja käytettiin kontrollina osoittaa kykyä eksosomeiksi kompensoida PTEN downregulation in DU145Kd. Tätä menettelyä käytettiin U87 ja PC-3-solut.

Eturauhassyöpä Potilaat ja Normaali aiheet

Tämä tutkimus tukee eettisen hyväksynnän McMaster University eettinen lauta (REB # 02-2174) . Osallistujat kerrottiin tutkimuksen tarkoituksesta, ja kirjallinen suostumus on saatu kaikilta henkilöitä, jotka osallistuivat tutkimukseen. Näytteitä 30 PC potilasta käytettiin tässä tutkimuksessa. Potilaat oli edennyt (T3 /T4) kasvain vaiheessa. Verinäytteet kerättiin ennen eturauhasen ja kasvaimen kudokset kerättiin leikkauksen jälkeen ja jäädytettiin nestemäisessä typessä. Kliiniset tiedot, kuten Gleason pisteet, PSA, kasvaimen koko, kasvain histopatologiset laatu ja etäpesäkkeiden kerättiin. Näytteitä kerättiin mukaisesti McMaster University eettiset vaatimukset, ja potilaan suostumus on saatu ennen näytteenottoa. Kahdeksan terveillä vapaaehtoisilla miehillä vuotiaista 50-65 (vastaa PC potilaan näytettä) käytettiin tässä tutkimuksessa; kaikki olivat ilman historiaan syövän ja normaali PSA-arvot.

Tilastollinen analyysi

Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa samanlaisilla tuloksilla. Määrälliset tiedot esitetään keskiarvo kopiot sisällä edustava koe ± SEM. Tilastollinen merkitsevyys arvioitiin käyttämällä tietokonepohjaista 2-tailed Studentin t-testiä. Erot katsottiin merkitsevä P 0,05.

Tulokset

PTEN on ilmoitettuna Eksosomit PC Solut, mutta ei normaalien solujen

määrittää tilan PTEN vuonna seuraavat PC-solut: DU145, DU145 stabiilisti transfektoitu PTEN siRNA (DU145Kd) varten PTEN downregulation tai knockdown, ja DU145 transfektoitu ohjaus siRNA [12]. Eksosomeiksi kerättiin elatusaineesta kunkin solutyypin, ja yhtä suuri kuin proteiinin pitoisuudet soluista ja eksosomeiksi tehtiin SDS-PAGE ja immunoblottaus, sitten tutkittiin PTEN-vasta-aineita. Molemmat DU145Kd soluja (kuvio 1A) ja eksosomeiksi (kuvio 1 B) oli downregulation PTEN ilmentymisen verrattuna villityypin DU145-soluja ja DU145-soluja transfektoitiin ohjaus siRNA. Olemme myös arvioinut fosforylaatiotilaa PTENin vuonna eksosomeiksi peräisin näistä soluista. Fosforylaatiota PTEN pitää sen suljetussa tilassa suojattu hajoamiselta; Myöhemmin PTEN on saatavilla aktivoitava sytoplasmassa, sitovat solukalvon kun defosforylaatiosta, ja sitten aloittaa solusignalointia [30], [31]. Huomasimme, että PTEN sisällytetty eksosomeiksi fosforyloituu (kuvio 1 B, keskimmäinen paneeli). Flotilin-1 käytettiin lastaus kontrollina eksosomeiksi [32]. Lisääntyminen hinnat DU145 vanhempien soluja, DU145 jossa ohjaus siRNA ja DU145Kd soluja (kuvio 1 C) osoittavat, että PTEN pudotus solut osoittivat merkittävästi suuremman leviämisen nopeudella kuin kaksi muuta solutyyppejä. Ihmisen ensiöparit (normaali, ei-syöpäsolujen), kuten Human aortan endoteelisoluja (HAOEC), ihmisen aortan sileiden lihassolujen (HAOSMC), ja ihmisen eturauhasen epiteelisolujen (HPEC) ilmaista PTEN, mutta huomasimme, että PTEN ei ole sisällytetty osaksi eksosomeiksi näiden solujen (kuvio 1 D). Tämä voi tarkoittaa, että sisällyttäminen PTEN in eksosomeiksi on yksinomainen ominaisuus syöpäsoluja, mutta tämä havainto vaatii vielä etsintä. Kuvio 1E on pyyhkäisyelektronimikroskooppikuva osoittaa vuodattamalla eksosomeiksi syöpäsoluista.

. DU145 PC-solut transfektoitiin ilmaistuilla siRNA. Solut transfektoidaan PTEN-spesifisten siRNA oli selvästi knockdown PTEN ilmaisun, kun taas solut transfektoitu ohjaus epäsuhta siRNA ei osoittanut laskua PTEN ilme. B. Eksosomit johdettu DU145, DU145Kd, ja DU145 ohjaus- siRNA osoittavat samaa mallia PTEN ilmaisun havaittua solu, josta ne ovat peräisin. PTEN sisällytetty eksosomeiksi fosforyloituu; fosforylaatio suojaa PTEN hajoamiselta, ja se voidaan aktivoida defosforyloimalla siirtyessään muihin soluihin. Eksosomit ovat positiivisia Flotilin-1. C. Erot leviämisen DU145, DU145 jossa ohjaus siRNA ja DU145Kd arvioitiin, huomattavasti korkeampi leviämisen näytteillä DU145Kd. D. Ihmisen ensiöparit, HAEC, HASMC ja HPEC, ja niiden eksosomeiksi profiloitiin varten PTEN ilme. Kaikki kolme solua ovat PTEN ilme, mutta PTEN ei ilmaistu niiden eksosomeiksi. Ilmaus sekä solujen ja niiden eksosomeiksi normalisoitui kanssa Flotilin-1. E. pyyhkäisyelektronimikroskooppikuvana osoittaa vuodattamalla eksosomeiksi peräisin DU145 soluista.

Intercellular siirtäminen PTEN tekijänä Eksosomit

tutkimiseksi solujen välisen vaihdon PTEN, eksosomeiksi johdettu natiivi DU145 PC solut kerättiin käyttäen tavanomaista menettelyä sentrifugoinnin. DU145Kd soluja inkuboitiin eksosomi valmisteen peräisin vanhempien DU145 soluista. Näennäinen otto microvesicular PTEN mukaan DU145Kd solut havaittiin käyttämällä immunosytokemian (taustan vähentäminen suoritettiin käyttämällä käsittelemättömiä soluja kontrollina, ja fluoresenssi vähennettiin sekä käsittelemätön ja käsitelty solujen osoittaa hankinnan PTEN on eksosomi käsitellyissä soluissa), ja immunoblottaus (Kuvio 2 A ja B).

DU145Kd soluja inkuboitiin eri pitoisuuksia eksosomeiksi peräisin DU145-solujen 24 tunnin ajan. A. DU145Kd Soluja viljeltiin slide kammioissa ja käsiteltiin DU145 johdettuja eksosomeiksi. Solut pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), ja immunosytokemia suoritettiin PTEN primaaristen vasta-aineiden ja Alexa fluor 488 sekundäärisiä vasta-aineita. Solut visualisoidaan konfokaalimikroskopia (IF- immunofluoresenssin). DU145Kd solut hankittu PTEN (vihreä) kanssa inkuboinnin jälkeen DU145 johdettuja eksosomeiksi. B. DU145Kd viljeltiin 100 mm ruokia ja käsiteltiin samalla tavalla kuin (A) eri pitoisuuksia DU145 johdettujen eksosomeiksi. Solut pestiin PBS: llä, lyysattiin RIPA hajotuspuskuria, ja analysoitiin PTEN ilmentymisen käyttäen immunoblotting. DU145Kd solut hankittu PTEN ilme. C. Eksosomit olla estävä vaikutus transkriptioon PTEN. DU145Kd käsiteltiin eri pitoisuuksilla eksosomeiksi peräisin DU145 emosoluilta. Kokonais-RNA kerättiin käsitellyistä soluista, DU145-solut, ja DU145 jossa ohjaus siRNA. RT-PCR suoritettiin käyttäen alukkeita, jotka ovat spesifisiä PTEN. GAPDH: ta käytettiin kontrollina. RT-PCR suoritettiin käyttäen yksivaiheista RT-PCR kit. Tuotteet erotettiin 1,1% agaroosigeelillä. D. Eksosomit siirto PTEN on U87 PTEN

– /- solut. U87-soluja viljeltiin slide kammioissa ja käsiteltiin DU145 johdettuja eksosomeiksi. Solut värjättiin PTEN-vasta-aineiden ja Alexa fluor 488 sekundaarisia vasta-aineita, ja sitten tehtiin näkyviksi käyttäen -konfokaalimikroskoopilla (IF-immunofluoresoiva). U87-solut, jotka eivät ilmennä PTEN koska niillä on mutaatioita kummassakin PTEN alleelit, hankittu PTEN ilmaisu (vihreä).

Jotta kasvu PTEN vuonna DU145Kd soluissa jälkeisen inkubaation DU145 johdettuja eksosomeiksi ei johtunut stimulaatio PTEN transkription eksosomeiksi, suoritimme RT-PCR PTEN vuonna DU145Kd soluissa käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla DU145 johdettujen eksosomeiksi. Havaitsimme estävä vaikutus PTEN transkription (kuvio 2C). Jotta edelleen varmistaa, että olimme tarkkailemalla solujen väliseen siirtoon PTEN-proteiinin, toisin kuin stimulaation transkription, käytimme glioblastoomasolulinjan U87, nolla genotyyppi, joka sisältää mutaation molemmissa PTEN alleeleista [33]. Kun käsitelty eksosomeiksi johdettu DU145 soluista, U87 solut positiivisiksi PTEN (kuvio 2D). Nämä tiedot vahvistavat, että hankittu PTEN vuonna DU145Kd ja U87 on yksinomaan liittyy solujen väliseen siirtoon PTEN-proteiinin avulla eksosomi vaihdon. Lisäksi käsittelimme eturauhassyöpäsolulinja PC-3, joka on PTEN null, jossa eksosomeiksi johdettu DU145 soluista, osoittaa hankinta PTEN (kuva S1). Päätimme PTEN ilmentymistä eksosomeiksi eri syöpäsolulinjasta eli keuhkojen (A549), rintasyövän (MDA-MB-231), peräsuolen karsinooma (HCT116), ja haiman adenokarsinooma (BxPC-3) (kuvio S2, A), ja osoittavat, että PTEN vuotaa ulos eksosomeiksi muista syöpäsolutyyppien. Olemme myös käsitelty PC-3-solujen kanssa eksosomeiksi peräisin HCT116 kolorektaalikarsinooma soluja, ja totesi, että PC-3-solut hankittiin PTEN lauseke (kuva S2, B).

eksosomeiksi Transfer Aktiivinen PTEN välillä syöpäsoluja

Sen arvioimiseksi, onko PTEN välittyy eksosomeiksi on aktiivinen, käsittelimme DU145Kd soluja erilaisilla pitoisuuksilla eksosomeiksi peräisin DU145 soluista. Käsiteltyjen solujen tehtiin immunosaostus ja PTEN. Immunopresipitaatit arvioitiin PTEN jossa käytetään lipidejä fosfataasianalyysi. DU145Kd solut osoittivat huomattavaa lisäystä fosfataasiaktiivisuus käsittelemällä eksosomeiksi johdettu DU145 soluista (kuvio 3A).

. DU145Kd soluja käsiteltiin eksosomeiksi peräisin DU145-soluissa. PTEN immunosaostettiin PTEN-vasta-aineita, ja PTEN fosfataasin aktiivisuus arvioitiin käyttämällä vesiliukoista substraatti DiC8PtdIns (3, 4, 5) P3 (Echelon). Vapautuneet vapaat fosfaatit mitattiin BIOMOL Green reagenssilla ja normalisoidaan reaktiossa, joka sisälsi vain PIP3 alustaan. Tulokset edustavat keskiarvoa kolmesta kokeesta ± SEM, ja ne ovat merkittäviä P 0,01. B. PTEN-positiivisia eksosomeiksi (maasta DU145) vähensi AKT fosforylaation akseptori soluissa (DU145Kd); AKT fosforylaatio laski tasolle verrattavissa DU145 solujen ohjaus siRNA, ja vanhempien vastine DU145 soluja (kaksi viimeistä kaistaa oikealle, tässä järjestyksessä). C. DU145Kd solut maljattiin 100 mm: n soluviljelymaljoille ja käsiteltiin eri pitoisuuksilla DU145-johdettujen eksosomeiksi. Solut hajotettiin ja analysoitiin im- kanssa p27 ja sykliini D1-vasta-aineita. PTEN indusoi ilmentymistä p27 ja vähentää ilmentymistä sykliini D1 (C). Molemmat tapahtumat johtivat solujen tekemästä solusyklin pidätyksen. Ilmaisu normalisoitiin P-aktiini.

Sen tutkimiseksi, siirretyn PTEN on toimivaltainen muuttamaan solusignaloinnille akseptori soluissa, DU145Kd soluja käsiteltiin eksosomeiksi peräisin DU145 soluista 24 tuntia. Fosforylointireaktio asema fosfatidyyli 3′-kinaasi /seriini-treoniinikinaasi (AKT), tärkein substraatti PTEN, arvioitiin. Vuonna DU145Kd soluissa, havaitsimme lasku fosforylaation AKT, joka saavutti tason verrattavissa DU145 emosoluista (PTEN positiivinen) ja DU145-soluja transfektoitiin ohjaus siRNA (kuvio 3B).

Sen määrittämiseksi, onko siirretty PTEN vaikuttaa loppupään soluun signalointipolkujen liittyy AKT, arvioimme sykliiniriippuvainen kinaasi (CDK) estäjä p27 (KIP1) lauseke. p27 säätelee solujen lisääntymistä, solun liikkuvuus, ja apoptoosin. Väheneminen p27 ilmentymistä havaitaan kaikkein vaarallisin epiteelisyövissä ja liittyy huono hoitotuloksia [34]. Pakt säätelee negatiivisesti p27 tukemaan antiapoptoottisten aktiivisuutta syövän etenemiseen. Huomasimme, että p27 ilmentymistä lisääntyy DU145Kd soluissa, kun niitä käsitellään DU145 johdettujen eksosomeiksi (kuvio 3C). On raportoitu, että G1 solusyklin pidätyksen koordinoi PTEN lipidien fosfataasiaktiivisuus kautta upregulation p27 ja PTEN-proteiinin fosfataasiaktiivisuus kautta downregulation sykliini D1 [35]. Olemme todenneet, että sykliini D1 on vaimentua in DU145Kd käsitellyissä soluissa DU145 eksosomeiksi, kuten odotettiin (kuvio 3C).

PTEN siirtyneet Eksosomit Vaikuttaa Biologinen Toiminnot Acceptor Solut

Sen arvioimiseksi, onko biokemiallinen havaitut muutokset kuviossa 3 liittyy muutos biologinen funktio, olemme arvioitiin vaikutus PTEN-positiivisia eksosomeiksi (johdettu DU145-solut) proliferaatioon kolme solulinjat, joilta puuttuu PTEN ilmaisua. DU145Kd, PC-3, ja U87-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla DU145 eksosomeiksi, ja proliferaatiota hinnat inhiboitui kaikissa kolmessa solulinjoissa annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 4 A, B ja C). Eksosomit puuttuu PTEN ilme, johdettu DU145Kd, osoittivat vain vähän vaikutusta proliferaatioon hinnat.

kolme solulinjojen puuttuu PTEN ilme, DU14Kd, PC-3, ja U87 (A, B ja C, vastaavasti), käsiteltiin eri pitoisuuksilla DU145 eksosomeiksi. Proliferaatiomääritys suoritettiin käyttämällä määritystä kit. Kaikissa kolmessa solulinjoissa, proliferaatio hinnat inhiboitui konsentraatiosta riippuvalla tavalla. Lisääntyminen hinnat DU145Kd solujen tasolle verrattavissa DU145 soluihin, mikä osoittaa, että eksosomeiksi täysin kompensoi menetystä PTEN (A). Eksosomeiksi peräisin DU145Kd, joista puuttuu PTEN, ei ollut vaikutusta solujen lisääntymisen kaikkien kolmen solulinjoissa. Tulokset on esitetty keskiarvona kolmesta kokeesta ± SEM. Erot ohjauspaneelista (0 eksosomeiksi) ovat merkittäviä * P 0,05, ** P 0,01, ja # erot eivät ole merkittäviä.

sisällyttäminen PTEN osaksi Eksosomit säätelee Onkogeenit

tutkimiseksi mekanismi sisällytetään PTEN osaksi exosomal lasti, testasimme rooli onkogeenisel- reseptorin epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) tässä prosessissa. Käytimme kiinalaisen hamsterin munasarja (CHO), jotka ovat spontaanisti ikuistettu [36] ja ei ole EGFR. CHO-soluja, jotka on transfektoitu stabiilisti ilmaista EGFR oli samalla tasolla PTEN ilmaistuna eksosomeiksi kuin vanhempien CHO-soluja (kuvio 5A). Stimuloitaessa CHO-EGFR-solujen eri pitoisuuksilla EGF (5, 10 ja 20 ng /ml), oli kasvu määrä PTEN on eksosomeiksi, pitoisuutena riippuvaisella tavalla (kuvio 5B). Lisäksi testasimme estävä vaikutus EGFR DU145 soluissa PTEN sisällyttämisestä eksosomeiksi. Käsittelimme solujen EGFR estäjän CI-1033 (5, 10 uM). EGFR vähentynyt sisällyttäminen PTEN osaksi eksosomeiksi pitoisuutena riippuvaisella tavalla (kuvio 5C).

. Esittelyssä EGFR CHO-soluissa ei havaittu ilmenemistä PTENin soluissa ja eksosomeiksi. B. stimulointi CHO-EGFR-solujen kanssa ilmoitettuina pitoisuuksina EGF (5, 10 ja 20 ng /ml) lisäsi PTEN sisällyttäminen eksosomeiksi. C. DU145-soluja käsiteltiin kahdella pitoisuudella (5 uM, 10 uM) CI-1033, irreversiibeli estäjä EGFR. PTEN sisällyttäminen eksosomeiksi estyi pitoisuusriippuvaisella tavalla; Flotilin-1 käytettiin latauskontrollina varten eksosomi pitoisuuden.

PTEN tila PC Potilaita voidaan arvioida veren Eksosomit

roolin tutkimiseksi eksosomeiksi arvioinnissa PTEN asema PC potilaille, keräsimme veren 30 PC potilaille ennen eturauhasen, ja 8 normaalilta henkilöltä vastaavia potilaan iästä (50-65 vuotta). Normaali vapaaehtoisia ei ollut ollut syöpää tai dokumentoitu seerumin PSA. Veri oli fraktioitu, ja plasma käytettiin lähteenä eksosomeiksi. PTEN-eksosomeiksi immunosaostettiin käyttäen PTEN-vasta-aineita ja Sepharose proteiini-G. Sisällyttäminen PTEN osaksi eksosomeiksi PC potilaiden veressä määritettiin immunoblottauksella, ja erilaiset ekspressiotasot havaittiin potilailla. Mielenkiintoista, löysimme PTEN ilmaisun eksosomeiksi kaikista PC potilaista, eikä PTEN ilmaisun eksosomeiksi verestä normaalin aiheista (kuva 6 A, B); t-testi osoitti, että tulokset olivat erittäin merkittävä P 0,001. Lisäksi voimme arvioida konsentraatio PTEN PC potilaiden eksosomeiksi immunoblottauksella standardin pitoisuudet rekombinantti-PTEN, ja pitoisuus PTEN määritettiin (ng PTEN /mg eksosomi proteiinia) (kuvio 6C).

. Eksosomit kerättiin plasmasta 30 ennalta prostatektomia PC potilaista ja 8 normaalihenkilöihin. Eksosomit tehtiin standardin immunoblottaus analyysi tilan PTEN. Kuvassa kyky eksosomeiksi tilan arvioimiseksi PTEN. Kuten kuviossa on esitetty, kuin terveillä koehenkilöillä ei ollut PTEN ilmentymistä niiden plasmassa eksosomeiksi. B. Optiset tiheydet PTEN nauhat (A) arvioitiin käyttämällä Määrä-1-ohjelmiston. Exosomal-PTEN ilmentymistä PC potilaiden ja normaalihenkilöihin laskettiin keskiarvo ± SEM, ja erot näiden kahden ryhmän välillä oli erittäin merkitsevä (P 0,001). C. PTEN pitoisuus eksosomeiksi PC potilaan verestä arvioitiin immunoblottauksella standardin pitoisuudet rekombinantti PTEN yhdessä potilaan näytteitä. Tulokset ovat keskiarvo PTEN ilmaisun ± SEM ja ovat tilastollisesti merkittäviä P 0,01.

Veri exosomal-PTEN tarjoaa yksinkertaisen keino arvioida PTEN Status

PC kasvaimet ovat heterogeenisiä PTEN ilmaisu kuten nähdään (kuvio 7 A, B, C). PTEN asema kasvaimissa neljän PC potilaita määritettiin immunohistokemiallisesti. Luku osoittaa vaikeaa muodostaa johtopäätös PTEN ilmaisua käyttää tätä tekniikkaa. PTEN ilmaisu veressä eksosomeiksi saman potilaista arvioidaan kuviossa 7D, jotka osoittavat yksinkertainen ja suora tapa arvioida PTEN pitoisuus PC potilailla. Kuvio 7E on pyyhkäisyelektronimikroskooppikuva, joka esittää homogeenisen populaation veren eksosomeiksi.

Tämä kuvio antaa käyttöön vertailun tutkimus PTEN arvioinnin käyttäen exosomal PTEN, ja immunohistokemia PC potilaan kasvaimia. Immunohistokemia kasvainkudosnäytteet neljästä PC potilaista osoittaa heterogeenisyys PTEN ilmaisun eturauhastuumoreissa. A. Eosiini hematoksyliinillä värjäystä. B. Värjäys johdetun vasta-aineita. C. värjäys PTEN spesifisten vasta-aineiden, nuolet osoittavat PTEN positiivisia soluja. D. arviointi PTEN ilmaisun käyttäen plasmaa eksosomeiksi peräisin samoista potilaista. E) pyyhkäisyelektronimikroskoopilla mikrovalokuva, joka esittää homogeenisen populaation eksosomeiksi kerätään potilaan verestä. Eksosomit kiinnitettiin peitelasilla käyttämällä polylysiini, ja käsiteltävä pyyhkäisyelektronimikroskoopilla.

Expression PSA eksosomi valmistetuissa PC Potilaat ja Normaali aiheet

käyttäminen 30 PC potilaiden ja 8 normaalihenkilöihin havaitsimme PSA eksosomeiksi sekä PC potilaiden ja normaaleilla henkilöillä (kuvio 8A): absorbanssit PSA bändejä (kuviosta 8A) käytettiin tilastolliseen analyysiin. Erot exosomal PSA välillä PC potilaiden ja normaalihenkilöihin eivät olleet merkittäviä (kuvio 8B).