Krooninen sairaus

tiivistelmä

muuttumiset Ef reseptorityrosiinikinaaseja ovat yleisiä tapahtumia ihmisen syövissä. Geneettiset variaatiot EPHB6 on kuvattu, mutta toiminnallinen tulos näistä muutoksista ei tunneta. Nykyinen tutkimus tehtiin seulomiseksi esiintymisen ja tunnistaa toiminnallisia seurauksia EPHB6 mutaatioita ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. Täällä sekvensoitiin koko koodaavan alueen EPHB6 80 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä potilaiden ja 3 kasvainsolulinjoissa. Kolme mahdollisesti merkitystä mutaatioita tunnistettiin ensisijaisesti potilaan näytteitä NSCLC potilaiden (3,8%). Kaksi pistemutaatioita johti instable proteiineja. In runko deleetiomutaatio (del915-917) osoitti lisätä maastamuuttoa ja nopeutettu haavan paranemista

in vitro

. Lisäksi del915-917 mutaatio lisäsi metastasoitunut kyky NSCLC soluista

in vivo

hiirimallissa. Tuloksemme viittaavat siihen, että EPHB6 mutaatiot edistävät etäispesäkkeiden potilasryhmässä, jossa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä.

Citation: Bulk E, Yu J, Hascher A, Koschmieder S, Wiewrodt R, Krug U, et ai. (2012) mutaatiot EPHB6 reseptorityrosiinikinaasin Pakotettava Pro-Metastaattinen fenotyyppi in Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 7 (12): e44591. doi: 10,1371 /journal.pone.0044591

Editor: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hong Kong

vastaanotettu: 08 toukokuu 2012; Hyväksytty: 03 elokuu 2012; Julkaistu: 04 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Bulk et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: NSCLC tutkimus laboratoriossamme rahoittaa Deutsche Krebshilfe ja Wilhelm-Sander Stiftung. A.S. rahoittivat DFG Schw 407 /9-3. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

keuhkosyöpä on johtava syy syövän liittyvän kuoleman kanssa useimmissa tapauksissa ryhmään kuuluvan ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) [1], [2]. Kehittäminen kaukainen etäpesäke on merkittävä syy NSCLC liittyvä kuolema. Reseptorityrosiinikinaasit (RTK) tärkeä rooli etäpesäkkeisessä prosessissa [3], [4]. Yksi tunnetuimmista RTK liittyy etäpesäkkeitä fenotyyppi, on epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) ja sen perheenjäsenten erbB2 /Her2, ErbB3 ja erbB4. RTK kuten EGFR perhe ovat siis houkuttelevia kohteita parantaa molekyylien hoidon lähestymistapojen syövissä [3], [5]. Tähän mennessä Efriini (EPH) -reseptorin subfamily on suurin alaryhmän RTK koostuu 16 jäsentä selkärankaisissa, nimittäin EPHA reseptorit 1-10 (EPHA1-A10) ja EphB reseptorit 1-6 (EPHB1-B6) [6], [ ,,,0],7]. EphB reseptorit vuorovaikutuksessa efriiniperheellä ligandien. Kun vuorovaikutus niiden Efriini ligandien, EPH reseptorit moduloivat erilaisia ​​biologisia vaikutuksia, kuten solu-solu vuorovaikutus ja solumigraatio [8], [9]. Menetys kinaasi-dead EPHB6 liittyy kehittynyt kasvain vaiheessa ja syövän etenemistä [10] – [16]. Useat julkaisut raportoimaan korkea EPHB6 ilmentymisen ollessa suotuisa prognostinen markkeri neuroblastoomakasvaimissa [10] – [12]. Lisäksi mRNA: n ilmentyminen EPHB6 vähennettiin metastaattinen melanooma ja invasiivisen rintasyövän solulinjat, joilla on metastaattinen potentiaali [14] – [16]. Toiminnallisesti EPHB6 tukahduttaa invasiivisuus, kasvunopeus ja pesäkkeitä muodostavat tehokkuus viljeltyjen rintasyövän solujen [17] – [18], säätelee soluadheesiota ja vaikuttaa muuttoliike [19].

Aiemmin olemme tunnistaneet useita ihmisen RTK joiden ilmentymistaso korreloi kehittämisen etäpesäkkeiden varhaisen vaiheen NSCLC [20]. Kun taas korkea mRNA ilmentyminen useiden RTK liittyi useammin etäpesäkkeiden kehityksen korkean mRNA ekspressiotasot kahden RTK EPHB6 ja DKFZ1 osoitti pienempi riski etäpesäke [20]. Viime aikoina olemme tunnistettu EPHB6 kuin epigeneettiseltä vaiennettu etäpesäke vaimentimen NSCLC, ja ilmaus EPHB6 esti etäpesäkkeiden muodostumista vierassiirrännänmallissa etäpesäke malli [21].

Täällä tutkinut EPHB6 vaihtelu DNA- sekvensoinnilla, ja ominaista toiminnallinen seuraukset EPHB6 mutaatioiden

in vivo

ja

in vitro

osalta niiden mahdollinen rooli NSCLC etäpesäkkeitä.

A) toiminnallinen domeenit EPHB6 geenin esitetään suhteessa niiden eksonit ja tunnistettu mutaatioita varten EPHB6. Kuvauksen mutaatiot vastaavat niiden lokalisointi proteiinisekvenssi. Mutaatiot R52C, Q498H, ja DPG915-917del havaittiin NSCLC potilaiden näytteistä nykyisessä tutkimuksessa. B) Elektroferogrammin EPHB6-villityyppisen sekvenssin ja deleetiomutantin varten EPHB6. C) Expression tasot EPHB6-mutanttien transfektoiduissa soluissa. Bulk transfektoituja soluja oli GFP lajitellaan ja laajennettu selektioalustoihin. Ekspressiotasot näkyvät irtotavarana viljelmiä 90% GFP: n ilmentymisen. Erot ilmaisun analyysin välillä proteiinin tasot ja mRNA-tasot näkyvät. Kvantitatiivista tosiaikaista PCR: keskiarvo ja keskihajonta kolmesta itsenäisestä kokeesta on esitetty. Western blot esitetään edustava esimerkki.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

NSCLC solulinjoja mukana olevassa tutkimuksessa on kuvattu aiemmin [21]. Lyhyesti, A549 keuhkoadenokarsinooma soluja viljeltiin 37 ° C: ssa, korkea kosteus ja 5% CO

2 DMEM: ssä (Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine, Invitrogen, Carlsbad, CA). Elatusaine, johon oli lisätty 10% vasikan sikiön seerumia (FCS) ja 1% streptomysiiniä ja penisilliiniä. HTB56 ja HTB58 keuhkoadenokarsinooma soluja viljeltiin 37 ° C: ssa, korkea kosteus ja 5% CO

2 MEM (Modified Eagle-kasvualustalla, Invitrogen, Carlsbad. CA). Elatusaine, johon oli lisätty 10% FCS: ää, 1% streptomysiiniä ja penisilliiniä, 1% glutamiinia, 1% natriumpyruvaattia, 1% ei-välttämättömiä ami- acid.Cell line identiteetti varmistettiin STR-genotyypin.

potilaan näytteet

Ensisijainen kasvain näytteet ja kasvaimettomina keuhkokudokset saatiin aikaan alkuperäisen leikkauksen 80 potilaalla on histologisesti todettu NSCLC yliopistossa sairaalassa Saksassa. Näytteet otettiin heti sokki pakastettiin ja varastoitiin nestemäisessä typessä. Kasvain Näytteet tarkastettiin prosenttiosuus kasvainsolujen histologia, ja vain tuumoribiopsioissa, joista vähintään 70% syöpäsoluja käytettiin myöhemmin analyyseihin. Samoin, syöpä-free kontrollinäytteiden vahvistettiin myös histologinen tutkimus. Kaikki potilaat toimitti kirjallisen suostumuksensa ja tutkimuksen hyväksyi eettinen komitea yliopiston Münster.

A) Proteiinin ilmentymistä stabiilisti transfektoitujen A549 jotka ilmentävät villityyppistä EPHB6 tai EPHB6 häviämämutantti. Solut kotransfektoitiin käyttäen EGFP -pcDNA3.1

+ vektori tunnistamiseen valittujen kloonien. Useita klooneja yhdistettiin ja edelleen valittu bulk kulttuureissa. B) TranswellTM muuttoliike määritykset suoritettiin tyhjän vektorin ohjaus soluja, EPHB6 mutantti ja EPHB6 villityypin soluja. Viisi eri kokeissa kolmena rinnakkaisena analysoitiin. *: Merkitsevä (p 0,05) erot (JOKO ANOVA OR t-testi) Annettu p-arvo välillä kolmella eri solulinjoissa analysoitiin tilastollisesti kaikilta siirtynyt soluista käyttämällä OneWay ANOVA-testiä. Analyysi pareittain t-testi johtaa merkittävään p-arvo ohjaus soluja vs. EPHB6-wt-soluja (p 0,015), ja välillä EPHB6-wt-soluja ja EPHB6-mut-soluja (p 0,005) . C)

In vitro

haavan paranemista tyhjästä määrityksessä. Solut naarmuttaa 10 ui pipetin kärki. Scratch alueet kirjattiin yli periode 17 tuntia. Näkyy ovat keskiarvoja kolmesta eri kokeita, laskettuna prosenttiosuutena yhdestä alkupisteestä kaikkien kolmen solulinjoissa. ANOVA-testiä (p 0,002) osoitti tilastollisesti merkitseviä eroja kolmen solulinjoista. D) edustaja kuvia tyhjästä määritykset alussa ja lopussa kokeita.

A) määrä keuhkojen etäpesäkkeiden arvioitavissa NOD /SCID neljän viikon kuluttua transplantaation, joissa jokaisessa on 3 x 10

5 transfektoitu stabiilisti A549 soluja, jotka ilmentävät EPHB6-p- (n = 9), EPHB6-del915-917 (n = 9) tai tyhjällä vektorilla kontrollisolut (n = 2). Pisteet tarkoittavat yksittäisten hiirien ja vaakaviivat mediaani etäpesäkkeitä. B) Kuvat edustavan koko keuhkoista NOD /SCID-hiiriin, transplantoitu A549-solut ilmentävät EPHB6-wt, EPHB6-del915-917 tai tyhjän vektorin ohjaus. Keuhkoetäpesäkkeet on merkitty mustalla nuolilla. C) Kuvat keuhkoleikkeissä NOD /SCID-hiiriin, värjättiin hematoksyliinillä. Etäpesäkkeitä on merkitty mustalla nuolilla. Kolme edustavia esimerkkejä on esitetty kukin hiirissä, A549 soluja, jotka ilmentävät EPHB6-wt tai EPHB6-del915-917.

A) proliferatiivisen aktiivisuuden tyhjän vektorin ohjaus, EPHB6 villityypin ja mutantti-solut analysoitiin käyttämällä kolorimetristä MTT-analyysi 72 tunnin jälkeen. Tiedot esitetään keskiarvoina +/- standardipoikkeama kolmesta itsenäisestä kokeesta. Erot olivat tilastollisesti ei merkitsevä (ANOVA). B) Solun koko yksittäisten solujen (n = 20) kasvaa muoviastiat analysoitiin live video mikroskoopilla ja kirjataan. EPHB6 mutantti solut osoittivat merkittävästi vähentynyt solun koko verrattuna EPHB6 villityypin ja ohjata solujen (p 0,05, t-testi).

EPHB6 Sequencing

Genominen DNA uutettiin käyttämällä DNAzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Alukkeet suunniteltiin Primer3 ohjelmisto (jakelijalle) täydentää polymeraasi-ketjun (PCR) fragmentteja mitoitettu välillä 400 ja 800 bps ja katettava koko koodaavan alueen EPHB6 geenin (yksityiskohdat PCR annetaan Täydentävä materiaali). Kaikki kaikki fragmentit monistetaan PCR: llä Taq-DNA-polymeraasia (reaktion kokonaistilavuus 20 ui), johon on kotona valmistettu PCR tehostajana, kuten on kuvattu [22]. Molemmat juosteet sekvensoitiin käyttäen PCR-alukkeita. Lisää sisäisiä alukkeita käytettiin PCR-tuotteiden kauemmin kuin 600 bp varmistaa kaksijuosteiseen sekvenssi-informaatiota koko PCR-fragmentti. Sekvensointi suoritettiin ABI3730xl automaattisella DNA-sekvensseri kanssa BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). Sekvensoiduista koodaava alue

EPHB6

verrattiin viitesekvenssin kanssa (GenBank nro NM_004445).

kohdennettu mutageneesi

koodaava alue ihmisen EPHB6 cDNA (base 833-3853 NCBI-hakunumero NM_004445) kloonattiin pcDNA4 To /myc /Hisa ekspressiovektoriin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Mutaatiot koodaavan sekvenssin EPHB6 otettiin kanssa QuickChange XL kohdennetun mutageneesin kittiä (Stratagene, La Jolla, CA, USA) käyttäen alukkeita, joilla on sekvenssit: eteenpäin (5′-AGGCTGGCGGGGAAAGGCCTTCCCAGG), reverse (5′-CCTGGGAAGGCCTTTCCCCGCCAGCCT) ja käyttämällä pcDNA4-EPHB6 vektorin malliin. Jälkeenpäin oikea sekvenssi varmistettiin sekvensoimalla. Alukkeet edelleen mutaatioita annetaan pyynnöstä.

Ekspressiorakenteet ja transfektio

Ihmisen A549-solut ko-transfektoitiin käyttäen transfektioreagenssia Nanofectin (PAA, Itävalta) mukaan valmistajan protokollaa. Co-transfektio suoritettiin joko pcDNA4 (tyhjän vektorin kontrolli), villityypin EPHB6 ekspressiokonstruktin (pcDNA4-EPHB6-wt) tai EPHB6 mutantti ekspressiorakenteet, joissa jokaisessa on EGFP ilmentävät vektorikonstruktiosta (pcDNA3.1-GFP, jotka ilmentävät parannettua vihreää fluoresoiva proteiini EGFP) valintaa ja tunnistaminen transfektoitujen solujen. Transfektoidut solut valittiin 700 pg /ml G418: aa (Sigma, St. Louis, MO, USA) ja 400 ug /ml tseosiinia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Bulk viljelmät FACS lajiteltu GFP-ilmentyminen ja laajennettu. Lisäksi pääosa kulttuureissa, myös yhdistetty useita korkeita GFP ilmentävien kloonien saada riittävästi ekspressiotasoja. Ekspressio varmistettiin Western-blottauksella ja reaaliaikainen RT-PCR: llä.

RNA: n eristäminen ja Käänteinen transkriptio

Kokonais-RNA eristettiin käyttäen TRIzol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Yhteensä määrä 1 ug RNA: ta kustakin näytteestä käänteiskopiointiin käyttäen satunnaisia ​​alukkeita ja MMLV käänteistranskriptaasia mukaan valmistajan protokollan (Promega, Madison, Wisconsin, USA).

Gene Expression analyysit by Quantitative Real- aika RT-PCR

kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR: llä, cDNA: ta monistettiin ABI Prism 7700-sekvenssin ilmaisinta (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). EPHB6 havaittiin seuraavilla alukkeilla ja koetin: eteenpäin (5′- TGGACTATCAGCTCCGCTACTATG), reverse (5’GTGGCAGTGTTGGTCTCGC) ja koetin (5′-per- CCAGGCAGAAGACGAATCCCACTCCTT-TAMRA). Suhteelliset määrät geeniekspression laskettiin käyttäen ilmaus GAPDH sisäisenä standardina.

Western blot -analyysi

Proteiinit havaittiin käyttäen seuraavia vasta-aineita: anti-ihmisen EPHB6 (1 ug /ml, Abnova Corporation, Neihu, Taipei, Taiwan, tai ABGENT, San Diego, CA, USA) ja β-aktiini (40 ng /ml, Sigma, USA), kuten ensisijainen vasta-aineet, vuohen anti-hiiren ja vuohen anti-kani-(molemmat Dianova, Hampuri, Saksa) sekundaarisena vasta-aineita. Western blot -analyysi suoritettiin, kuten on kuvattu [23].

Katso Blue Plus2

proteiinimarkkeri (Invitrogen) käytettiin koon osoitusta.

Boyden jaosto Pitoisuus

Yhteensä 5 x 10

5 A549-soluja ( 100 ul: ssa DMEM, jossa 5% FCS) ympättiin ylempi osa TRANSWELL® kammion (transwell suodatin teriä 6,5 mm, jonka huokoskoko on 5 pm, Corning Inc., Corning, NY), joka oli 30 min esipäällystetty 50 ug fibronektiinin. Alaosassa kammion 600 ui DMEM, jossa on 20% FCS: ää (seerumin gradienttia käytettiin kemoattraktantti) lisättiin, ja määritys suoritettiin 16 tunnin ajan 37 ° C: ssa ja 5% CO

2, ennen kuin siirtää soluja analysoitiin virtaussytometrialla. Kaikki määritykset toistettiin neljä kertaa ja itsenäisesti suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

In vitro Wound Healing – Scratch Assay

A549-soluja ympättiin 25 ml: n kudosviljelypullossa tiheydellä 350000 solua -pulloon ja viljeltiin yli kolmen päivän. Yhtyviä kerroksena olevat solut sitten naarmuuntunut käyttäen 10 ul-pipetin kärki. Väliaine vaihdettiin ja haavan paranemista rekisteröitiin live video mikroskoopilla. Kuvat otettiin 10 x min välein 17 tunnin ajan käyttäen Zeiss (valo) mikroskoopilla Axiovert 40C, liittyy CCD-videokameran (Hamamatsu). Kuvan hankinta kontrolloitiin Hipic 32 (High Performance Image Control System) tai Wasabi (Hamamatsu kuvankäsittelyohjelma). Analyysi haavan paranemista suoritettiin käyttäen Java-pohjainen kuvankäsittelyohjelmalla ImageJ. Määritykset suoritettiin erikseen kolme kertaa.

analyysi Cell Size

A549 soluja, jotka ilmentävät EPHB6-villi tyypistä, EPHB6-mutantti tai matala EPHB6 (ohjaus /tyhjän vektorin transdusoidut) ympättiin soluviljelmässä säiliöissä, jotka esipäällystettiin kollageenimatriisin kanssa. Solujen annettiin kiinnittyä viisi tuntia ja sitten seurataan käyttäen Zeiss (valo) mikroskoopilla Axiovert 40C, liittyy CCD-videokameran (Hamamatsu). Kuvan hankinta kontrolloitiin Hipic 32 (High Performance Image Control System) tai Wasabi (Hamamatsu kuvankäsittelyohjelma). Analyysi solun koon yksittäisten solujen suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [24], käyttämällä visualisoinnin Amira ja Java-pohjainen kuvankäsittelyohjelmalla ImageJ. Ohjelmisto analysoi parametrit solutoiminnoille yksittäisistä soluista, mukaan lukien solun määrityksen ala (im

2).

Etäpesäke Kokeet in vivo

kaikille hiiren kokeissa käytettiin 8-10 viikkoa vanhoja NOD.CB17-Prkdc scid /J (NOD /SCID) hiiriä saatiin Charles River. Analysoimaan etäpesäke kehitys upon suonensisäisen tuumorisoluinjektion 22 NOD /SCID-hiiriä säteilytettiin yhden annoksen 3,5 Gy peräisin koboltti-60-yksikön 1 vrk ennen transplantaatiota. Yhteensä 3 x 10

5 stabiilisti transfektoidut solut (liuotettu 200 ul: aan PBS: ää) injektoitiin laskimonsisäisesti häntälaskimoon. Neljä viikkoa transplantaation jälkeen, hiiret tapettiin, ja kehitys keuhkojen etäpesäkkeiden analysoitiin. Kahdessa tapauksessa hiiret kuolivat yhden viikon sisällä transplantaation jälkeen: yhdellä hiiren, joihin on siirretty EPHB6-wt ilmentäviä A549-soluja, ja yksi hiiri, joihin on siirretty EPHB6-mutantti ilmentäviä A549-soluja. Etäpesäke kehitys arvioitiin laskemalla yksittäisten etäpesäkenystyröiden. Histologista analyysejä, keuhkot fiksoitiin 4% paraformaldehydillä. Kaikissa kokeissa hoitoryhmissä satunnaistettiin estää häkkiin vaikutuksia.

Tilastollinen analyysi

Kaikki kokeelliset tiedot näytetään keskimääräisenä plus keskihajonta ellei toisin. Keskiarvot kolmeen ryhmään verrattiin OneWay ANOVA raakadatasta tai jos kahteen ryhmään opiskelijoiden t-testiä. Kaksipuolinen p 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

EPHB6 vaihtoehdot NSCLC

Kaikki eksonit koko koodaavan alueen EPHB6 sekvensoitiin Sanger perustuva sekvensointi kohortin NSCLC potilaiden. Niistä 80 pienisoluista keuhkosyöpää, kolme (3,8%) tapauksessa havaittiin ei-synonyymi mutaatioita EPHB6 (R52C, n = 1, Q498H, n = 1, ja DPG915-917del, n = 1). Ei EPHB6 mutaatioita tunnistettiin solulinjoissa A549, HTB56 tai HTB58. Bioinformatiikan analyysi SIFT ja Polyphen osoitti pistemutaatiot R52C ja Q498H kuin todennäköisesti vahingoittavat (taulukko 1). Tietokantahaku viimeaikaisten laajamittaisten sekvensointi ponnisteluja paljasti muita mutaatioita, jotka tähän mennessä ei ole vielä tutkittu (Fig. 1A).

EPHB6 mutaatioita tunnistettiin eri eksonit ja toimintakykyyn geenin. Kiehtovan, poisto del915-917 (Fig. 1 B) sijaitsi lähellä kaksi mutaatiota (D915G ja G914V) äskettäin tunnistettu potilailla, joilla peräsuolen syöpä [25], [26]. Klusterin mutaatioiden tällä alueella välillä tyrosiinikinaasin katalyyttinen (Tyrkc) domain ja steriiliä alfa-motiivi (SAM) ehdottaa lisäksi toiminnallinen merkitys. Tämä mutaatio tunnistettiin potilaan keuhkojen adenokarsinooma. Mutaatio oli heterotsygoottinen ja havaittiin myös vastaavassa normaalissa keuhkokudoksessa osoittaa ituradan mutaation. Toinen Mutaatiot yksinomaan havaittu kasvain eikä Hyväksytty tervettä kudosta inficating somaattinen mutaatio.

funktionaalisia määrityksiä EPHB6-villityypin ja useiden mutantteja (R52C, Q498H, del915-917 ja P728S mutaation aiemmin kuvattu munasarjasyövän [LIT]) oli stabiilisti kotransfektoitiin kanssa EGFP ilmentävien plasmidien NSCLC-A549, joka ilmentää hyvin alhainen EPHB6. EGFP positiivista kloonia poimittiin ja ilmentymisen analyysi suoritettiin Western-blottauksella käyttämällä EPHB6-vasta-aineen yhden klooneja ja bulk viljelmät (Fig. 2A). Huolimatta onnistuneen transfektion lisääntynyt mRNA-tasot, proteiinin ilmentymisen useimmissa EPHB6 mutanttien ei kasvanut suuremmaksi kuin havaittiin tyhjällä vektorilla transfektoiduissa soluissa (kuvio. 1C). Vain del915-917 mutaatio, proteiinin ilmentymistä tasoisena EPHB6 villityyppisen saavutettiin (Fig. 2A). Riittämättömyyden vuoksi riittävästi proteiinia ilmentymisen R52C ja G498H mutantit sekä aiemmin kuvattu P728S mutantti, me toiminnallisesti keskittyi del915-917 mutaatio NSCLC myöhemmissä kokeissa.

Effects of EPHB6 mutaatioiden on Migration and Metastasis NSCLC solut

Kuten raportoitu, EPHB6 villityypin esti muuttoa pysyvästi transfektoitu A549 soluja transwell kammio (Boyden chamber) määritys. Sitä vastoin solut, jotka oli transfektoitu del915-917 mutantti EPHB6 siirtynyt huomattavasti nopeammin tässä määrityksessä (kuvio. 2B). Lisäksi suoritimme tyhjästä määritykset toistuvan video mikroskopia seurata tyhjästä sulkemisen ajan. Villityypin EPHB6 esti

in vitro

haavan paranemista verrattuna tyhjän vektorin, kun taas EPHB6 mutanttien solujen kuroneet umpeen paljon nopeammin kuin villityypin (kolmen erillisen kokeen, p 0,002, ANOVA; p 0,0004, t-testi ) (Fig. 2C, D). Kävi ilmi, että EPHB6 mutantti ei vain estämään EPHB6 villityypin aktiivisuus, mutta kiihtyi sulkeminen haavan verrattuna tyhjän vektorin ja villityypin. Kahdeksan tunnin pysyvyyttä, avoin alue EPHB6 mutanttien solujen alkaa laskea kaksi kertaa (3%) nopeammin kuin se voidaan kirjata EPHB6 villityypin soluja (1,6%). Jopa ohjaus solut osoittivat vähemmän kiihtyvyys haavan (2%) tänä ajankohtana.

analysoimiseksi

in vivo

vaikutuksia EPHB6 mutaatioiden metastaattista kapasiteettia NSCLC-solujen, suoritimme

in vivo

etäpesäkkeitä määrityksiä. NOD /SCID-hiiriin injisoitiin laskimonsisäisesti EPHB6-wt-soluja (n = 10), EPHB6-del915-917 soluja (n = 10) ja tyhjän vektorin kontrollisolut (n = 2). Neljä viikkoa transplantaation jälkeen hiiret tapettiin ja analysoitiin. Yksi hiiri kunkin ryhmän hiirten, joihin on siirretty EPHB6-wt ja EPHB6-mut ilmentävät solut kuolivat viikon kuluessa transplantaation. Hiiret injektoitiin EPHB6 villityypin yli-ilmentävät solut osoittivat matalampia keuhkometastaasien verrattuna hiiriin injektoitiin joko tyhjiä vektorisäädön soluja tai EPHB6-mutanttisoluista (Fig. 3): yksi hiiri havaittiin ilman etäpesäkkeitä, 2 hiirtä jokaisen 1 tai 3 etäpesäke ja yksi hiiri kussakin 4, 5 tai 8 etäpesäke. Yksi hiiri oli siirretty EPHB6 villityypin soluja löydettiin suuri määrä keuhkometastaasitestissä. Mielenkiintoista on, että kaikki hiiret injektoitiin EPHB6 mutanttisoluista keuhkometastaasitestissä oli havaittavissa (Fig. 3; p = 0,011, t-testi tietojen hiiristä, joihin on siirretty EPHB6-wt verrattuna EPHB6-mut solut).

in vitro

proliferaatiomäärityksessä 72 tunnin kuluttua (Fig. 4A) osoitti, että EPHB6 mutantti solut eivät poikkea EPHB6 villityypin ilmentävien solujen suhteen lisääntymisaktiivisuus. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin lisääntymismäärityksissä analysoitiin 48 tunnin kuluttua (tuloksia ei ole esitetty). Kokeet pikemminkin ehdotti, että lisääntynyt metastaattinen aktiivisuus

in vivo

liittyi muuttaminen luontaisten muuttavien ominaisuuksia. EPHB6 Villityypin reseptorin ilmentymisen ei merkittävästi muuttunut solujen muoto (vaikkakin erot muodon koko kasvoi), kun taas koko EPHB6 mutanttisoluista jotka kasvoivat säännöllisesti muoviastiat oli merkittävästi pienentynyt (Fig. 4B; p 0,05, t-testi tiedot 20 soluista EPHB6-wt ja EPHB6-mut ilmentäviä soluja). Mukaisesti Näiden havaintojen kemotaksista EPHB6 solujen muoviastiat näytti vähennetään, todennäköisesti johtuu alentunut pito ominaisuuksia. Mutta erot olivat tilastollisesti merkitseviä (tuloksia ei ole esitetty).

Keskustelu

Efriini – Ef reseptorivuorovaikutuksissa usein vapautettiin syöpä (viite). Nykyisissä tutkimuksessa tunnistettu mutaatioita EPHB6 pro-metastaattinen ominaisuus ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. Yksi mutaatio, del915-917, oli läsnä myös sovitettu normaalia kudosta, mikä viittaa vahvasti siihen ituradan muutos. Ituradan muutoksia on aikaisemmin kuvattu EPHB6 familiaalisen peräsuolen syövän Toistaiseksi toiminnalliset seuraukset näiden geneettisiä muutoksia solutasolla ei tunneta [25].

muuttumiset Ef reseptorien esiintyy usein keuhkosyöpään. Yksi laajamittainen sekvensointi tutkimuksessa todettiin mutaatioita 10 ulos 13 Ef reseptorin geenien keuhkoadenokarsinooma [27]. Johtuen useista Ef reseptorin signaloinnin tapahtumia ja kompleksinen verkottaminen reseptorien, toiminnallinen tulos Ef reseptorin poikkeavuuksien edelleen epäselviä [28]. Useimpien Ef reseptorin muutokset Tähän mennessä tunnistetut toiminnallisia seurauksia ei ole tutkittu.

Useat somaattiset mutaatiot EPHB6 geeni on aikaisemmin tunnistettu keuhkosyövän [27], peräsuolen syöpä [25], [26 ], munasarjasyöpä [29] ja gliooman [26].

tässä tutkimuksessa seulonta 80 NSCLC potilaiden näytteitä ja 3 NSCLC solulinjoista tunnistettiin 3 aiemmin tuntemattomia mutaatioita varten EPHB6 geeniä. Yksi tämän mutaatioita, del915-917, asuu toimialueen välillä tyrosiinikinaasin ja steriili alfa motiivi (SAM) domain, jossa 2 somaattiset mutaatiot äskettäin tunnistettu kolorektaalisyövässä [25], [26]. Toiminta tällä alalla on ehdotettu liittyvän syöpään, ja meidän havainnot tässä työssä tehdä tukevat tätä ehdotusta.

in vivo

kokeet osoittavat selvästi, että ilmaisua mutatoidun EPHB6 parannettu etäpesäke. Lisäksi EPHB6-mutantti ilmentävät solut osoittivat kolmiosaiseen parannettu siirtokuoppaan siirtymistä seerumin gradientti (kemotaksista). Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​meidän

in vivo

tuloksia. Hiiret, joihin on siirretty EPHB6-mut solujen kehittynyt merkittävästi (p = 0,011) enemmän keuhkoetäpesäkkeet kuten hiiriä, joihin on siirretty EPHB6-p- soluissa. Lisäksi muuttuneen toimintoja EPHB6 del (915-917) mutantti, muutamia näkökohtia voi myös ehdottaa voitto funktion. Esimerkiksi, kuviot haavan paranemista vaihteli EPHB6 wildytpe ja mutantti. On mahdollista, että signalointi eroja villityypin ja mutantti-reseptorin. Toisaalta, se voi olla mielenkiintoista spekuloida, että mutantti-reseptori voisi toimia hallitseva negatiivinen kohti muita estävä EPH reseptoreihin. Tämä hallitseva negatiivinen aktiivisuus voi johtaa havainto mahdollisten voitto funktion teho. On selvää, tulevissa tutkimuksissa saattaa paljastaa taustalla eroja signalointi ja Muutkin jäsenen EPH ja EPH-reseptorin verkoissa. Jatkotutkimuksissa voisi myös paljastaa toiminnalliset vaikutukset kuin del915-917 mutaatioita. On todennäköistä, että nämä myös inaktivoivat EPHB6 mutta tämä tulee varmistaa myös tulevaisuudessa.

Äskettäin voisimme osoittaa, että EPHB6 usein vaiennetaan epigeneettiset mekanismit keuhkosyövän [21], ja muut voisivat näyttää samassa inaktivointi mekanismi rintasyövän [14]. Tutkimuksemme osoitti myös, että menetys EPHB6 indusoi erittäin metastaattinen fenotyyppi. Linjassa, EPHB6 on reseptorityrosiinikinaasin, jolle heikkoa ilmentymistä oli läheisintä sukua huonon ennusteen varhaisessa vaiheessa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [20]. EPHB6 voisi olla tärkeä rooli keuhkosyövän etäpesäke koska se on usein epigeneettiseltä vaiennetaan ja /tai mutatoitunut merkittävä osa potilaista. Tämä mahdollistaa sen, että EPHB6 on merkityksellinen muokkaaja metastaattisen kapasiteetin keuhkosyöpään.

Yhteenvetona mutaatiot EPHB6 esiintyvät ei-pienisoluinen keuhkosyöpä voi johtaa kohti pro-metastaattinen fenotyyppi. Menetys EPHB6 toimintoa vähentynyt ilmentyminen tai mutaatiokaavojen inaktivaatio voisi siten osaltaan keuhkosyöpään etäpesäkkeiden.

Kiitokset

Olemme kiitollisia Dr. Jianping Wu (University of Montreal, Quebec, Kanada) tarjoamiseksi EPHB6 cDNA.