Krooninen sairaus

tiivistelmä

STC1 on glykoproteiinihormoni mukana kalsium /fosfaatti (Pi) homeostaasiin. On yhä enemmän todisteita siitä, että STC1 on tiukasti liittyy syövän kehittymiseen. Mutta toiminta STC1 syövän ei täysin ymmärretä. Täällä, huomasimme, että STC1 säätyy alas in Clinical kudoksissa kohdunkaulan syövän verrattuna viereiseen normaaliin kohdunkaulan kudoksissa (15 tapausta). Tämän jälkeen ilmaus STC1 pudotettiin RNA puuttuminen kohdunkaulan syövän CaSki- soluja ja heikkoa ilmentymistä edistää solujen kasvua, muuttoliikkeen ja hyökkäystä. Olemme myös havainneet, että STC1 yliekspressio inhiboi soluproliferaatiota ja invaasion kohdunkaulan syöpäsoluja. Lisäksi STC1 yliekspressio herkistyneet CaSki- solujen huumeita. Lisäksi osoitimme, että NF-KB p65-proteiinin suoraan sidottu STC1 promoottori ja aktivoitu ilmentymistä STC1 kohdunkaulan syöpäsoluja. Nämä tulokset siis esittänyt todisteita siitä STC1 esti solujen lisääntymistä ja hyökkäyksen kautta NF-KB p65 aktivaation kohdunkaulan syövän.

Citation: Guo F, Li Y, Wang J, Li Y, Li Y, Li G (2013 ) Stanniocalcin1 (STC1) Estää Cell Proliferation ja invaasiota kohdunkaulan syövän solut. PLoS ONE 8 (1): e53989. doi: 10,1371 /journal.pone.0053989

Editor: Soumitro Pal, lastensairaalassa Boston Harvard Medical School, Yhdysvallat

vastaanotettu: 18 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 05 joulukuu 2012; Julkaistu: 29 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Guo et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Natural Science Foundation of China (nro 30672352) ja Innovaatiohankkeiden jatkokoulutuksen Keski Etelä yliopisto (nro 2340-74334000006). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Stanniocalcin1 (STC1) on glykoproteiinihormoni mukana kalsium /fosfaatti (Pi) homeostaasin, joka alun perin löydettiin erittävä hormoni verisoluja ja Stannius, hormonitoimintaa rauhanen luukaloja [1]. Nisäkkään STC1 ilmentyy laajasti erilaisissa kudoksissa, mukaan lukien sydän, keuhkot, maksa, lisämunuainen, munuais-, munasarja-, eturauhas-, koolon- ja perna [2] – [5]. STC1 soittaa monipuolista roolia fysiologisten ja patologisten prosessien, kuten raskaus, imetys, angiogeneesi, organogeneesin, oksidatiivisen stressin, aivoiskemian, ja apoptoosin [6] – [10]. Ihmisen ortologi kalojen STC1 havaittiin mRNA differential display syöpään liittyvien geenien [11]. STC1 alun perin kloonattiin näyttö syöpään liittyvien geenien. Lukuisat riviä tutkimukset osoittivat, että muuttunut ilmentyminen STC1 voi olla rooli syövän synnyssä ja kehityksessä. Lisääntynyt STC1 geenin ilmentymisen on havaittu hepatosellulaarinen, peräsuolen, akuutti leukemia, ja medullaarinen kilpirauhasen karsinoomat, kuitenkin vähentynyt ilmentyminen STC1 ekspressio havaittiin rinta- ja munasarjasyövän solulinjoissa [12] – [19]. Mutta suhde differentiaalisesti ilmentyminen STC1 tuumoriin verrattuna normaaliin kudokseen, ja sen biologisen funktion on lisätutkimuksia. Jotkut tutkimus osoitti, että STC1 ilmentyminen mukana muodostumista kasvaimen verisuoniston ja STC1 voi aiheuttaa mukautuva reagoivat hypoksia HIF sääntelyn ihmisen syöpäsoluja [20], [21]. On todettu, että histonideasetylaasi estäjän aiheuttama solujen apoptoosin liittyy STC1 aktivointi [22].

Huolimatta parempaa tuntemusta STC1, siellä on vähän tunnettu funktio STC1 syövän etenemiseen. Tässä tutkimuksessa selvitimme roolia STC1 geenin ilmentymisen ihmisen kohdunkaulan syövän. Huomasimme, että STC1 oli alassäädetty Kliinisen kudoksissa kohdunkaulan syövän. Myöhemmin huomasimme, että STC1 alhainen ilmentyminen edistää solujen kasvua, muuttoliikkeen ja hyökkäystä. Olemme myös havainneet, että STC1 yliekspressio inhiboi soluproliferaatiota ja invaasion kohdunkaulan syöpäsoluja. Lisäksi STC1 yliekspressio herkistyneet CaSki- solujen huumeita. Nämä tiedot tukevat pro-apoptoottisen funktion STC1. Lisäksi osoitimme, että NF-KB p65-proteiinin suoraan sidottu STC1 promoottori ja aktivoitu ilmentymistä STC1 kohdunkaulan syöpäsoluja.

Tulokset

STC1 oli Down-säännelty Clinical kudosten Kohdunkaulan syöpä

tutkia roolia STC1 kohdunkaulan syövän, ensin tutkinut mRNA ekspressiotaso 15 pareina kohdunkaulan kudosten RT-PCR. Ilmentymisen taso STC1 mRNA kohdunkaulan syövän kudoksissa väheni verrattuna viereisen terveisiin (kuvio 1A ja B). Sitten, immunohistokemia-analyysi paljasti, että proteiini taso STC1 oli alhainen kasvainkudoksissa, ja samalla lisäsi viereisissä normaaleissa kudoksissa, mikä osoittaa sen mahdollisen roolin etenemistä kohdunkaulan syövän (kuvio 1 C ja D).

(A ) ekspressiotaso STC1 mRNA: syöpä (T) ja viereisen normaalin (N) täsmäsi kohdunkaulan kudoksissa tutkittiin RT-PCR: llä. GAPDH toimi latauskontrollina. (B) Laatikko juoni kaavio osoitti määrällisten tulosten STC1 mRNA ilmaisun kaikki parit näytteiden (

p

0,05). (C) Proteiinin taso STC1 kasvaimen ja normaaleissa kudoksissa tutkittiin immunohistokemiallisesti analyysi. Bar koko: 100 pm. (D) määrä analyysi proteiinin tason STC1 ilmaisua. Intensiteetti reaktiivisuus oli pisteytetty kolmitasoinen järjestelmä (

p

0,05). Data ilmaistiin keskiarvona ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta. Arvo P 0,05 katsottiin tilastollista merkittävyyttä.

Down-regulation of STC1 korostettujen CaSki- solun kasvu ja Invasion

Tutkia biologisen toiminnan STC1, me syntyy RNAi vektori sisältäviä siRNA erityisesti suunnattu STC1 vakaasti kaataa endogeeninen ilmentyminen STC1 in CaSki soluissa. Kuten kuviossa 2A on esitetty, verrataan kontrolliin (CaSki /NC), jotka on transfektoitu siRNA -STC1 oli merkittävästi alentuneet STC1 mRNA: n tai proteiinin.

(A) Knock alas STC1 on CaSki-soluissa. CaSki-solut transfektoitiin STC1 kohdentamalla siRNA, ja pudotus tehokkuus osoitettiin RT-PCR: llä ja western-blottauksella. (B) MTT määritykset osoittivat, että vaikutus laski STC1 on CaSki solujen kasvuun. Sen jälkeen 7 päivän jakso, kasvu CaSki /siRNA soluissa oli paljon nopeampaa kuin CaSki- /NC-solut (*

p

0,05). (C) Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä osoitti suuri määrä solujen pesäkkeitä CaSki /siRNA soluja verrattuna CaSki /NC-solut (

p

0,05). (D) Haavan paranemista määritykset osoittivat vaikutusta STC1 siirtyvien CaSki soluja. CaSki- /siRNA solut vaelsivat nopeammin kuin CaSki- /NC-solut (vasen paneeli). Suhteellinen vaellusetäisyydet CaSki solujen laskettiin (oikea paneeli) (

p

0,05). Bar koko: 100 pm. (E) matrigeelin invaasio määritykset osoittivat vaikutusta STC1 on hyökkäyksen CaSki soluja. Määrä CaSki /siRNA soluja suodattimen pinnalla oli suurempi kuin CaSki /NC-solut (vasen paneeli) (

p

0,05). Keskiarvo hyökkäsi solujen osoitettiin oikeassa paneelissa. Bar koko: 100 pm. (F) kasvukäyrät on -ksenografteja määritettiin kasvaimen tilavuus (vasen paneeli) (*

p

0,05). Kasvunopeudet on -ksenografteja arvostamisessa kasvaimen tilavuus /vrk (oikea paneeli) (*

p

0,05). CaSki /siRNA tai CaSki /NC solua injektoitiin ihon alle nude-hiiriin. (G) Lopussa koejakson, lopullinen ksenograftikasvaimissa näytettiin. (H) RT-PCR analysoi ilmentymisen STC1 edustavissa ksenograftikasvaimissa. (I) edustavia kuvia histologista tarkastus ksenograftikasvaimissa. Osien ksenograftikasvaimissa värjättiin H 0,05 katsottiin tilastollista merkittävyyttä.

Seuraavaksi tutkimme vaikutus laski STC1 on CaSki- solujen kasvuun MTT määrityksissä. Sen jälkeen 7 päivän jakso, kasvu CaSki /siRNA soluissa oli paljon nopeampaa kuin CaSki- /NC soluja, ja merkittävästi suuri määrä CaSki /siRNA soluja havaittiin päivänä 4 (kuvio 2B). Samanlainen edistää vaikutus vähentää STC1 ilmentyminen CaSki-soluissa saavutettiin pesäkemuodostusta (kuvio 2C). Siksi suuri aktiivisuus ja suuri määrä solun pesäkkeitä CaSki- /siRNA soluista osoitti, että alas-säätely STC1 ilmaisun edistää solujen kasvua in vitro.

Solun muuttoliike ja invaasio on tärkeä prosessi kasvaimen kehitystä ja etäpesäke. Seuraavaksi tutkittiin, mikä vaikutus STC1 siirtyvien CaSki solujen haavan paranemista määritys kuvassa 2D. Inkuboinnin fyysisesti haavoittunut solujen 48 tuntia, CaSki- /siRNA solut vaelsivat nopeammin kuin CaSki- /NC-soluissa. Tarkempi analyysi vaikutuksesta STC1 on CaSki solujen invaasio paljasti, että alas-säätely STC1 tehosti hyökkäyksen soluja in vitro, määräytyy Matrigel invaasiomääritys (kuvio 2E). Huomattavasti pitemmän matkan maahanmuutto- ja lukuisten CaSki /siRNA soluja suodattimen pinnalla osoitti, että alas-säätely STC1 tehostetun migraation ja invaasion kyky CaSki soluissa in vitro.

edelleen merkityksen määrittämiseksi STC1 aiheuttavan kasvaimia ja kehittämiseen kohdunkaulan syövän, CaSki- /siRNA tai CaSki- /NC solua injektoitiin ihon alle nude-hiiriin. Kehittäminen kasvaimen seurattiin 40 päivää. Kuten kuviossa 2F, STC1 pudotus kasvaimia syntynyt aiemmin ja kasvoi nopeasti kontrolliin verrattuna kasvaimia. Lopussa koeajaksi, lopullinen painot STC1 pudotus kasvaimet (1,417 ± 0,169 g) todettiin olevan selvästi korkeampi kuin valvonta (0,478 ± 0,115 g) (kuvio 2G). RT-PCR STC1 edustavissa ksenograftikasvaimissa osoitti, että vähentynyt STC1 ilme oli säilyy koko kokeellinen ajan funktiona (kuvio 2 H). H 0,05). (C) Pesäkkeenmuodostusta testi osoitti, että pieni määrä solujen pesäkkeitä CaSki /STC1 solut osoittivat alhaista aktiivisuutta (

p

0,05). (D) Matrigel invaasiomääritys paljasti, että säätely ylöspäin STC1 lieventää hyökkäystä solujen in vitro. Bar koko: 100 pm. (E) STC1 yli-ilmentyy kasvaimet syntyi myöhemmin ja kasvoi hitaasti verrattuna hallita kasvaimia (*

p

0,05). (F) Vuoden lopussa koeajaksi, lopullinen painot STC1 yli-ilmentynyt kasvainten havaittiin olevan pienempi kuin kontrolleilla. (G) RT-PCR STC1 ksenograftikasvaimissa osoitti, että lisääntynyt STC1 ilmentyminen oli säilyy koko kokeellisen ajan myötä. (H) H 0,05 katsottiin tilastollista merkittävyyttä.

Seuraavaksi CaSki- /STC1 tai CaSki- /NC solua injektoitiin ihon alle nude-hiiriin. STC1 yliekspressoitu kasvaimet syntyi myöhemmin ja kasvoi hitaasti kontrolliin verrattuna kasvaimiin (kuvio 3E). Lopussa koejakson, lopullinen painoja STC1 yli-ilmentynyt kasvaimia (0,285 ± 0,057 g) oli pienempi kuin kontrolleilla (0,523 ± 0,154 g) (kuvio 3F). RT-PCR STC1 ksenograftikasvaimissa osoitti, että lisääntynyt STC1 ilmentyminen oli säilyy koko kokeellisen ajan myötä (kuvio 3G). H 0,05). (E) STC1 säteilyherkälle CaSki- solujen thapsigargin. CaSki /STC1 tai CaSki /NC-soluja käsiteltiin thapsigargin (3 uM) 72 tuntia. MTT määrityksissä havaittiin solujen kasvua CaSki /STC1 tai CaSki- /NC solujen edessä thapsigargin (*

p

0,05). (F) STC1 herkistyneet CaSki-solujen rapamysiiniä. CaSki /STC1 tai CaSki /NC-soluja käsiteltiin rapamysiiniä (0,5 mg /l) 72 tuntia. MTT määrityksissä havaittiin solujen kasvua CaSki /STC1 tai CaSki- /NC solujen edessä rapamysiinin (*

p

0,05). Data ilmaistiin keskiarvona ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta. Arvo P 0,05 katsottiin tilastollista merkittävyyttä.

suora Sitova NF-KB: n p65 proteiini ja STC1 promoottorialue kohdunkaulan syövän solut ja säännelty ilmentymisen STC1

tumatekijä-kappa B (NF-KB) perheen transkriptiotekijöiden säätelee ilmentymistä paljon geenejä, mukaan lukien proliferaatiota ja invaasio geenejä. NF-KB-reitin on keskeinen rooli syöpien ja sydän- ja verisuonisairauksia. Promoottori STC1 sisältää useita NF-KB: n p65: n sitoutumiskohdat [27]. Aluksi tutkimalla edelleen mekanismeja välinen korrelaatio STC1 ja p65, sitoutumiskohdat testattiin CaSki- soluissa chromatin coimmunoprecipitation. Sivuston (-GGGACAAACC-) havaittiin sitoutuvan NF-KB: n p65 (Fig. 5A). Sen määrittämiseksi, onko STC1 ilmentyminen CaSki-soluissa korreloi NF-KB: n aktiivisuus NF-KB: n havaittiin. Mukana parannetun PARP- ja kaspaasi-3 aktiivisuutta NF-KB: n p65: n ja STC1 myös lisääntynyt, kun CaSki-soluja käsiteltiin thapsigargin (Fig. 5B). TNFa aktivoi apoptoottisia reittejä samanaikaisen NF-KB. Sen määrittämiseksi, onko ilmentymisen STC1 vastaavasti lisääntynyt TNFa-indusoitua apoptoosia, CaSki-soluja käsiteltiin yhä aikaan TNFa. Ilmaisu NF-KB: n p65 lisääntynyt ja aktiivisuus STC1 ja kaspaasi-3 parannettu vastauksena TNFa (Fig. 5C). Pyrrolidiiniditiokarbamaatin (PDTC) on tehokas estäjä NF-KB: n aktivaation ja estää NF-KB riippuvainen transkriptio pro-in fl ammatory sytokiinien ja kemokiinien [28]. Kun CaSki- soluja käsiteltiin PDTC, aktiivisuutta NF-KB: n p65 väheni ja ilmentymistä STC1 alassäädetty yhä aikaan PDTC (Fig. 5D). Lisäksi sen jälkeen kun pudotus p65 suoritettiin transfektoimalla siRNA kohdentamalla NF-KB: n p65: n, solunsisäisen ilmentymisen p65 ja STC1 in CaSki-soluissa analysoitiin (kuvio 5E). Ilmentymistä p65 sytoplasmassa ja tumassa sekä vähentynyt, ja kun yksi ydin huomattavasti. Alas säätelevä STC1 ilmentyminen tumassa havaittiin myös seuraavan knockdovvn p65. Pudotus p65 aiheutti ilmentymistä p65 ja STC1 sekä vähentämällä mRNA tasolla (Kuva 5F).

(A) sitoutumiskohtien STC1 testattiin CaSki-soluissa kromatiinin coimmunoprecipitation. Sivusto havaittiin sitoutuvan NFKB p65. (B) Western-blottauksella havaittu aktiivisuutta PARP, kaspaasi-3, STC1, ja NF-KB: n p65: n in CaSki-soluissa. CaSki-soluja käsiteltiin thapsigargin (3 uM) 12 tuntia. (C) Western blottauksella havaittu aktiivisuutta p65, STC1 ja kaspaasi-3 CaSki soluissa. CaSki-soluja käsiteltiin yhä aikaan TNFa: n (10 mg /l) 2,5 tuntia. (D) Western blottauksella havaittu aktiivisuutta p65 ja STC1 in CaSki soluissa. CaSki-soluja käsiteltiin PDTC (10 uM) 60 minuutin ajan. (E) Subsellulaariset p65 ja STC1 in CaSki-soluissa analysoitiin Western-blottauksella. CaSki-soluja käsiteltiin siRNA pudotus p65: ssa 72 tuntia. (F): n ekspressio p65 ja STC1 in CaSki havaittiin RT-PCR mRNA-tasolla. CaSki-soluja käsiteltiin siRNA pudotus p65: ssa 48 tuntia. (G) Kaaviokuva joitakin havaintoja tässä työssä.

Keskustelu

On yhä enemmän todisteita siitä, että STC1 on tiukasti liittyy syövän kehittymiseen. Mutta ilmentymistä STC1 vaihteli eri kudoksissa ja jopa saman kudoksen eri tasolla (mRNA tai proteiini), ja siksi toiminta STC1 voi näyttää eron [29]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että STC1 esti solujen lisääntymistä ja invaasion kohdunkaulan syöpäsoluja. STC1 säätyy alas in Clinical kudoksissa kohdunkaulan syöpä, joka osoitti STC1 osallistuu etenemistä kohdunkaulan syövän. Kohdunkaulan syövän, alhainen ilmentyminen STC1 saattaa aiheuttaa kasvainten kehittymiseen. Myöhemmin huomasimme, että STC1 alhainen ilmentyminen edistää solujen kasvua, muuttoliikkeen ja invaasion jälkeen alas-säätely STC1 RNA puuttuminen kohdunkaulan syöpäsoluja. Lisäksi olemme myös havainneet, että STC1 yliekspressio inhiboi soluproliferaatiota ja invaasion kohdunkaulan syöpäsoluja. Lisäksi STC1 yliekspressio herkistyneet CaSki- solujen huumeita. Nämä tulokset tukevat vaihtoehdon STC1 voi estää kasvaimen etenemistä kohdunkaulan syövän. Menetys toiminta STC1, joka estää kasvun ja invaasion kasvainsolujen, saattaa johtaa syövän etenemisen kohdunkaulan syövän.

promoottori STC1 geenin sisältää HIF ja NF-KB: n sitoutumiskohtaa. On todettu, että HIF-1α sitoutuneen STC1 geenin promoottorin ja p300 vaadittiin tuottava vuorovaikutus HIF-1 ja säätelyä STC1 mRNA ja proteiinin ilmentyminen [30]. Chen et ai ajateltu, että STC1 osittain tukossa NF-KB: n aktivaatio TNF-α-käsitellyn ihmisen sepelvaltimon endoteelisolujen [31]. Lain et ai raportoi, että histoni hyper-asetylointi ja rekrytointi aktivoitujen NFKB kannustanut STC1 geeniekspressiota HT29 [22]. Suhde STC1 ja NF-KB on erilainen eri kudoksissa tyyppi. Osoitimme, että NF-KB p65-proteiinin suoraan sidottu STC1 promoottori ja säädellä ilmentymistä STC1 kohdunkaulan syöpäsoluja. Nämä tulokset on mahdollista kliinistä merkitystä. Tuloksemme viittaavat siihen, että parannetaan ilmaus STC1 pitäisi olla hyvä strategia estää kasvaimen leviämisen ja invaasion ja saattaa myös olla toteuttamiskelpoinen yhdistetyn kemoterapeuttisen lääkeaineiden kohdunkaulan syövän.

Ylhäältä Näiden tulosten esitämme malli STC1 välittämää inhiboivaa syövän etenemisen (kuva 5): Kun aktivointi NF-KB p65, STC1 ilme lisääntynyt. Kohonnut STC1 ilmentyminen väheni kasvaimen etenemiseen, ja siten herkkyys kohdunkaulan syövän solujen kohonnut STC1 ilmentää kemoterapiaa lääkeaineen lisääntynyt. Siten lisätutkimukset ovat selvittämiseksi syvästi mekanismeja STC1 välittämää inhiboivaa syövän etenemisen ja edelleen tutkia, mitä muita molekyylejä osallistumaan etenemistä.

Materiaalit ja menetelmät

Näytteet ja immunohistokemia

kohdunkaulan syövän ja viereisten normaaleissa kudoksissa saatiin protokollia hyväksymä Toissijainen Xiangya sairaala Keski Etelä yliopisto. Ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia 15 potilaalla, joilla kohdunkaulan syöpä oli osoitti taulukossa S1. Parafiinisektioista poistettiin parafiini ksyleenillä ja niihin lisätään arvostellaan alkoholia. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin inkuboimalla 3% vetyperoksidia huoneenlämpötilassa 10 min. Ei-spesifinen sitoutuminen blokattiin PBST: llä, joka sisälsi 10% vuohen seerumia 2 h RT: ssa. STC1 vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology), lisättiin kuhunkin dia ja inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli. Seuraavat kolme pesua, kalvot inkuboitiin Envision (DAKO) 40 minuuttia huoneenlämpötilassa. Diaminobentsidiiniä käytettiin kromogeenina. Osiot vastavärjättiin hematoksyliinillä, kuivattu ja kiinnitetty. Arviointi Immunohistokemiallisen dioja tehtiin Nikon Eclipse E800 mikroskoopilla 200-kertaisella suurennuksella. Intensiteetti reaktiivisuus oli pisteytetty kolmitasoinen järjestelmä: 0-3 (0 = ei värjäystä, 3 = 100% värjäytyminen). Immunoreaktiivisia pisteet näytteen määritettiin positiivisten solujen prosenttiosuuden. Tutkimuksen protokolla hyväksyi eettinen komitea Xiangya School of Medicine, Keski Etelä yliopisto.

käänteistranskriptio-PCR (RT-PCR) B

RNA eristettiin kudoksista ja soluista käänteisesti puhtaaksi ja monistettiin käyttäen ONE-STEP käänteistranskriptio-PCR System (Fermentas). Alukesekvenssit käytetään esitetty taulukossa S2. Kun oli kuumennettu 95 ° C: ssa 1 minuutin ajan, PCR: t altistettiin 30 sykliä (GAPDH, 25 sykliä) 95 ° C: ssa 30 s, 60 ° C: ssa 30 s, ja 68 ° C 1 min 30 s ja lopullinen laajennus 68 ° C: ssa 10 min. Integroidun tiheyden arvo (IDV) kunkin nauhan arvioitiin käyttäen Gel-Pro Image Analyzer (Bio-Rad, Hercules, Kalifornia), ja suhteet IDV-arvot laskettiin arvioida suhteellisten ekspressiotasojen mRNA: n.

Cell Culture

CaSki ihmisen kohdunkaulan syövän soluja pidettiin meidän lab ja viljeltiin Dulbeccon modifioitua Eaglen väliaineessa (DMEM; Gibco), jota oli täydennetty 10% naudan vasikan seerumia (BCS) (Gibco). Soluja pidettiin 37 ° C: ssa ilmakehässä, jossa kostutettua ilmaa 5% CO2.

vector Rakentaminen ja Cell transfektio

kaataa STC1 ilmaisua, käytimme pRNAT-U6.1 /Neo vektori, joka koodaa pientä hiusneula-RNA kohdistuu kohdegeenin CaSki-soluissa. Tavoitteena sekvenssit STC1 olivat 5’TTAGTCCAGGAAGCAATAGTA -3 ’(CaSki- /siRNA). Käytimme negatiivinen yleinen ohjaus negatiivisena kontrollina (CaSki /NC).

transfektoimalla plasmidin ekspressiovektorin, joka koodaa ihmisen STC1 DNA-sekvensointi, joka sisältää STC1 avoimen lukukehyksen reunustavat Hindlll-Xhol-restriktiokohtien monistettiin PCR alkaen CaSki soluista. Alukesekvensseissä käytettiin sense 5’GAAAGCTTATGCTCCAAAACTCAG -3 ’ja antisense 5’TTCTCGAGTTATGCACTCTC ATGG -3 ”. Saatu fragmentti insertoitiin HindIII /XhoI -precut pcDNA3.1 (+) (Invitrogen) tuottaa pcDNA3.1- STC1. Haluttu sekvenssi varmistettiin suoralla DNA-sekvensoinnilla.

transfektiota, kohdunkaulan syövän soluja kasvatettiin 70% konfluenssiin ja transfektoitiin seerumivapaassa väliaineessa 6 tunnin ajan lipofektamiinin 2000 (Invitrogen) ja vektori. 48 tunnin kuluttua solut otettiin talteen, minkä jälkeen rajoitettu laimennoksella 96-kuoppalevyillä sukupolven yksittäisen solun klooneja. Kolme viikkoa myöhemmin, tasot STC1 ilmentymisen solun klooneja, jotka oli infektoitu vektoreilla, jotka tunnettu siitä, että STC1 proteiinin ja mRNA.

MTT ja Colony Formation

MTT-määritys suoritettiin, kuten on raportoitu aiemmin [32]. Pesäkkeiden muodostumista määrityksessä, solut 100 solua kuoppaa kohti 60 mm: n maljoille viljeltiin 10% FBS: DMEM, 37 ° C: ssa 5% CO2: ssa 3 viikon ajan. Solun pesäkkeet pestiin kahdesti PBS: llä, kiinteä 4% paraformaldehydillä 15 min ja värjätään Gimsa 30 min. Yksittäiset kloonit, joissa on enemmän kuin 50 solusta, laskettiin. Clone muodostavat tehokkuus yksittäisten solutyypistä laskettiin mukaan pesäkkeiden lukumäärä /määrä ympätty solujen x 100%.

Yksikerroksinen haavan paraneminen ja Invasion Analyysit

yksikerroksista haavoja määritys, -soluja kasvatettiin 10% FBS: ää DMEM 60 mm: n maljoille. Sen jälkeen, kun solut saavuttivat subkonfluenssin, yksikerroksista solut haavoittui raaputtamalla pois soluista ja sitten kasvatettiin väliaineessa 48 tunnin ajan. Siirrettyjä etäisyys CaSki-solujen seurattiin ja kuvattiin mikroskoopilla. Etäisyydet solumigraation laskettiin vähentämällä välinen etäisyys leesion reunat 48 h etäisyys mitattuna 0 h. Suhteellinen vaeltavat etäisyys solujen mitataan etäisyys solumigraation /etäisyys mitattuna 0 h. Sillä invaasiomääritys, solut 10

4 /kuoppa siirrostettiin ylemmässä kammiot 200 ui FBS-DMEM ja alempiin kuoppiin täytettiin 500 ui 10% FBS DMEM indusoimiseksi solujen vaeltamiseen. Inkuboinnin jälkeen 24 tuntia, solut suodattimen pinnalla kiinnitettiin 4% formaldehydiä, värjättiin 0,5% kristallivioletilla, ja tutkitaan mikroskoopilla. Solut vähintään kuusi sattumanvaraisesti mikroskooppikentäs- (200 x) laskettiin.

Western blot -analyysi

Solut pestiin kylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja hajotettiin Laemmli-puskurissa (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS: ää, 10% glyserolia, 50 mM ditiotreitolia ja 0,01% bromifenolisinistä) 5 minuutin ajan 95 ° C: ssa. Solulysaatit analysoitiin SDS /PAGE: lla ja siirrettiin elektroforeettisesti polyvinylideenidifluoridi kalvo. Blotit tutkittiin spesifisten vasta-aineiden sekundäärinen detektiovaihe. Immunoreaktiivinen Proteiinit paljasti ECL kit. Western blot suoritettiin käyttäen seuraavia vasta-aineita: Kanin anti-STC1-vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology), kanin anti-Phospho-NF-KB: n p65-vasta-ainetta (Cell Signaling Technology), kanin anti-PARP-vasta-ainetta (Cell Signaling Technology), kanin anti- -Caspase-3-vasta-ainetta (Cell Signaling Technology).

in vivo kasvaimen kasvun määritys

vaikutus STC1 kasvaimen kohdunkaulan karsinooman kehittymisen in vivo tutkittiin. Soluja 5 x 10

6 per hiiri injektoitiin ihonalaisesti 4 viikon ikäisiä Balb /c nude-hiiriin (n = 4 ryhmää kohti, Shanghai Laboratory Animal Center, Shanghai, Kiina). Kokeelliset paria tehtiin eri hiirillä. Kehitystä ja kasvua kiinteitä kasvaimia seurattiin mittaamalla kasvaimen koko käyttäen työntömitalla sokkona joka viides päivää 40 päivän ajan. Kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen kaavaa: tuumorin tilavuus (mm

3) = leveys (mm)

2 x pituus (mm) x 0,5 [33]. Lopussa kokeen, kaikki hiiret lopetettiin ja yksittäisten kasvainten painot mitattiin käyttämällä keventimeen.

Kromatiini immunosaostusmäärityksissä

ChIP määritys suoritettiin käyttäen ChIP iinianalyysikitissä mukaisesti valmistajan ohjeiden (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) ja vasta-aine NF-KB p65 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). Kromatiinin immunosaostus alukkeet suunniteltiin monistamaan fragmentti, joka sisälsi STC1 promoottorin. Alukesekvenssit käytetään esitetty taulukossa S2.

Tilastollinen analyysi

Data ilmaistiin keskiarvona ± SEM. Ero ryhmien välillä määritettiin ANOVA ja vertailuun kahden analysoitiin Studentin t-testiä käyttäen GraphPad Prism-ohjelmiston versio 4.0 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Arvo P 0,05 katsottiin tilastollista merkittävyyttä.

tukeminen Information

Taulukko S1.

ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia 15 potilaalla, joilla kohdunkaulan syöpä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0053989.s001

(DOC) B Taulukko S2.

Primer RT-PCR.

doi: 10,1371 /journal.pone.0053989.s002

(DOC) B