Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kasvaimet puutteellinen ilmaus kuljettimen liittyvän antigeenin prosessointia (TAP) yleensä ole aiheuttamatta T-soluvälitteistä immuniteettia ja ne kestävät T-solun tuhoutumisen. Kuitenkin olemme havainneet, että käyttöönotto B7.1-geenin TAP-negatiivisia (TAP

-) tai TAP1-transfektoitujen (TAP1-

+) hiiren keuhkosyöpä CMT.64-solut voivat lisätä kapasiteettia solujen indusoivat suojaavan immuunivasteen villityypin kasvainsoluja. Erot vahvuus suojaavan immuunivasteen havaittiin välillä TAP

– ja TAP1-

+ B7.1 ilmentävien CMT.64 soluja riippuen annokset γ-säteilytettyjä soluilla. Vaikka immunisoidut hiiret joko korkea tai matala annos B7.1 ilmentävien TAP1-

+ solut hylättiin TAP

– kasvaimia, vain suuren annoksen immunisaatio B7.1 ilmentävien TAP

– soluja johti kasvaimen hyljinnän. Indusoituneen suojaava immuniteetti oli T-solusta riippuvaisen osoituksena vähentynyt voimakkaasti kasvainten vastainen immuniteetin hiirillä CD8 tai CD4-solujen. Augmentation of T-soluvälitteisen immuunivasteen TAP

– kasvainsolujen havaittiin myös virusinfektoitua kasvainsolun järjestelmään. Kun hiiriä immunisoitiin suuren annoksen γ-säteilytettyjä CMT.64-solut infektoitu viruksilla, jotka B7.1 ja /tai TAP1 geenit, olemme havainneet, että solut, jotka koekspressoivat B7.1 ja TAP1, mutta ei niitä, jotka ilmentävät B7. 1 yksin, indusoi suojaavan immuniteetin CMT.64 soluja. Lisäksi rokotus elävällä kasvainsolujen transfektoitu useita eri geeni (t) paljasti, että vain B7.1- ja TAP1–ilmensi kasvainsoluja merkittävästi vähentynyt kasvainten muodostumiseen. Nämä tulokset osoittavat, että B7.1-provosoi antituumorivaikutuksen immuniteetin TAP

– syöpä helpotetaan TAP1–ilmaisua, jolloin molemmat geenit tulisi harkita syövän hoidossa tulevaisuudessa.

Citation: Li XL, Liu YY, Knight D, Odaka Y, Mathis JM, Shi R, et al. (2009) vaikutus B7.1 Kostimulaatio T-solujen Based immuniteetin TAP-Negative Cancer voidaan helpottaa TAP1- Expression. PLoS ONE 4 (7): e6385. doi: 10,1371 /journal.pone.0006385

Editor: Derya Unutmaz, New York University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 maaliskuu 2009; Hyväksytty: 18 Kesäkuu 2009; Julkaistu: 24 heinäkuu 2009

Copyright: © 2009 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Louisiana hallituksen Regents, Feist-WEILLER Cancer Center, Louisiana State Gene Therapy Program ja Department of Cellular Biology Anatomian LSU Health Sciences Center Shreveport. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Qian-Jin Zhang omistaa osakkeita TAPIMMUNE INC. Xiao-Lin Li oli osittain tuettu hänen palkka TAPImmune Inc kautta university of British Columbia, Kanada neljä vuotta sitten, kun hän työskenteli university of British Columbia, Kanada. Nykyinen työ ei ole tukea tämän yrityksen.

Johdanto

Yksi tehokas strategia syöpää vastaan ​​on CD8

+ T-solu immuniteetin [1]. Kuitenkin kasvainten puutteellisia major histocompatibility complex class I (MHC-I) antigeenin esittelyä usein välttää immuunivälitteisiä tuhoaminen [2], [3],. Puutos TAP ilmentymistä havaitaan usein ihmisen syöpään [2], [3]. TAP koostuu TAP1 ja TAP2-alayksiköt, joiden tehtävänä on kuljettaa sytosolin syntyvän peptidien onteloon endoplasmakalvostoon (ER) ja MHC-I sitovia, ja liikenne MHC-I /peptidi-komplekseja solun pintaan. Puute TAP ilmentymisen (toinen tai molemmat alayksiköt) tuumorisoluissa yleensä estää ilmentymisen TAP-riippuvainen peptidin antigeenejä solun pinnalla, mikä johtaa epäonnistumiseen CD8

+ T-solujen tunnistaminen.

Vaikka esittely TAP-riippuvainen peptidiantigeenejä on rajoitettu, TAP-puutteelliset solut kykenevät esittämään TAP-riippumattomia antigeenejä. Esimerkiksi hiiren T-lymfooma RMA-S-solut, jotka ilmentävät vain TAP1- [6] ja ihmisen T- ja B-hybridi-T2-solujen, joista puuttuu sekä TAP1 ja TAP2-geenit [7] voidaan esittää joitakin MHC-I rajoitettu TAP-riippumattomia antigeenejä, jotka ovat peräisin proteiineista sijaitsevat tai ulkopuolella ER ontelon [8], [9], [10], [11], [12], [13]. Erilaiset valmiudet antigeenin esittelyä myös havaittu TAP-negatiivisia ja TAP1–positiivisia kasvainsoluja. Gabathuler, R et al. raportoivat, että käyttöönotto TAP1- geenin TAP-negatiivisia kasvainsoluja muuttaa tilan antigeenin esittelyä muistuttamaan TAP1-positiivisia RMA-S-soluja, kuten on osoitettu, että viruksen-antigeeniä voidaan tehokkaasti esitetään pinnalla TAP1–possitive mutta ei TAP-negatiivisia kasvainsoluja [14]. Vaikka TAP-riippumattomia antigeeneja voidaan esittää TAP1–positiivisia tai TAP-negatiivisia kasvainsoluja, epäonnistuminen solujen tehokkaasti aiheuttaa suurelle joukolle kasvain-antigeenispesifisen CD8

+ T-solu effektorit voi olla merkittävä syy rajoittava tehoon antitumor immuniteetin. Sellaiset kasvainten vastainen immuniteetti voidaan täydentää ottamalla käyttöön B7.1 geeni TAP-puutteellisia tuumorisoluissa kuin raporteissa osoitettu [13], [15].

B7.1 on kostimulatorista molekyyliä, joka on vuorovaikutuksessa CD28 T-lymfosyyttien ja sillä on tärkeä rooli immuuni induktio. Kasvaimet transdusoitiin B7.1 voi saada CD8

+ T-solu riippuvainen antituumorivaikutuksen vasteita [16], [17], [18]. Erityisesti, B7.1 transfektoitu TAP1-ilmentävät RMA-S-solut voivat saada aikaan T-solukloonien, jotka reagoivat TAP1- tai TAP2 puutteellisia tuumorisoluja, mutta ei TAP kykenevän kasvainsoluja [13]. Yksi tällainen T-solukloonin tunnistaa ER-paikallinen-Lass5-proteiini-antigeeniä, joka on esitetty yksinomaan RMA-S: n ja muiden TAP1- tai TAP2 vajaiden solujen ja suojaa hiiriä RMA-S-kasvain haaste [13]. Nämä tutkimukset tarjoavat hyödyllistä tietoa pohjustuksen T-Solupohjaisten immuniteetin kasvain immuuni paeta variantit syövän immunoterapiassa. Kuitenkin monissa tapauksissa, ihmisen syövän ilmentää TAP-negatiivisia fenotyyppi, ja näin ollen on edelleen epäselvää, B7.1 ilmentymistä näissä kasvainsoluissa voi saada aikaan suojaavan T-solu-immuniteetin tai onko ilmentymisen sekä B7.1 ja TAP1 geenien tuottamiseksi vaaditaan tällaisen immuniteetin.

tässä tutkimuksessa käytimme hiiren keuhkosyöpä CMT.64 solulinjaa mallina solu järjestelmä käsitellä tätä kysymystä. CMT.64 solut ovat viallisia sekä TAP1- ja TAP2 klo transkription ja translaation tasoja ja ilmaista alhainen MHC-I-molekyylit [14], [19]. Me transfektoiduissa CMT.64 solut joko B7.1-geeni yksinään tai B7.1 yhdessä hiiren TAP1- geenejä, ja totesi, että transfektantit aiheuttama eri kasvainten vastainen immuunivaste. B7.1 ja TAP1- koekspressoimalla kasvainsoluissa merkittävästi vähentää niiden kasvainten muodostumiseen taas B7.1 ilmentyminen yksin soluissa ei ole muutoksia. Kuitenkin molemmat B7.1 ilmentäviä ja B7.1 ja TAP1- koekspressoivan solujen kasvanut dramaattisesti kapasiteetti sukupolven suoja- vapauksia suurilla annoksilla kasvaimen immunisointiin. Tällä pienellä annoksella kasvaimen immunisaation, ainoastaan ​​B7.1 ja TAP1- koekspressoivan solujen säädetty suojaavan immuniteetin. Nämä tulokset viittaavat siihen, että B7.1 ja TAP1- koekspressoimalla kasvainsoluissa on tärkeä T-solujen esikäsittely.

Tulokset

B7.1 ja TAP1- ilmentyminen vähenee tuumorigeenisyystesti TAP-puutteellisia CMT. 64-solut vain T-solujen hiirissä

vaikutusten arvioimiseksi B7.1 ilmaisun TAP1–positiivisia ja TAP-negatiivisia kasvainsoluja kasvainten vastaisten koskemattomuutta, ensin analysoidaan ilmentymistä käyttöön geenien CMT.64 transfektantit. CMT.64 /s, CMT.B7.1 /p, CMT.TAP1 /p, CMT.TAP1 /B7.1 ja CMT.TAP1,2 cl.21 solut transfektoitiin kaksi tyhjää vektoreita, B7.1 + tyhjällä vektorilla , TAP1- + tyhjän vektorin, TAP1- + B7.1 tai TAP1- + TAP2, vastaavasti (katso materiaalit ja menetelmät yksityiskohta). Kuluttua lääkkeen valinta, transfektanteista ilmaisi asiaa geeni (t), lukuun ottamatta CMT.64 /pp transfektanttiyhdistelmän joissa ei ole ilmennyt TAP1-, TAP2 tai B7.1 lauseke (1A ja 1B). Geenien ilmentyminen oli vakaa aikana tutkimus. K

b ja D

b ilmentymisen useimmissa transfektantit oli samanlainen kuin villityypin CMT.64-soluja, lukuun ottamatta CMT.TAP1,2 cl.21 soluja, jotka ilmensivät K

b ja D

b molekyylejä korkeammalle tasolle kuin ilmaistu muut (Fig. 1 C).

TAP, B7.1, K

b ja D

b ilmentyminen CMT.64 transfektanteissa määritettiin. A) TAP1- ja TAP2 proteiinit havaittiin CMT.64 transfektanteissa ja valvontaa RMA soluissa Western-blotit käyttäen anti-TAP1- ja TAP2 polyklonaalisia vasta-aineita vastaavasti (katso materiaalit ja menetelmät). Ekspressiotasot GAPDH-proteiinin kunkin näytteen, kun lastaus ohjaus. B) B7.1 ilmentyminen CMT.B7.1 /p ja CMT.TAP1 /B7.1-solujen havaittiin FACS määrityksiä käyttämällä FITC-konjugoitua B7.1-spesifinen mAb 16-10A1. Ohjaus on CMT.64 solut värjättiin mAb 16-10A1. C) K

b tai D

b ilmentymistä havaittiin FACS joissa käytetään ensisijaisena mAb: itä Y-3 vastaan ​​H-2K

b tai 28-14-8S vastaan ​​H-2D

b seurasi värjäys FITC-konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG toissijainen Ab. CMT.64-solut värjättiin primaarisen mAb 15-5-5S (vastaan ​​H-2D

k), mitä seurasi värjäys FITC-konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG toissijainen Ab käytettiin negatiivisena kontrollina. a: negatiivinen kontrolli; b: CMT.64; c: CMT.64 /s; d: CMT.B7.1 /p; e: CMT.TAP1 /p; f: CMT.TAP1 /B7.1; ja g: CMT.TAP1,2 cl.21.

Sen arvioimiseksi, B7.1 ilmentyminen kasvainsoluissa voisi vähentää tuumorigeenisyyteen, C57BL /6-hiiriin injektoitiin elävien CMT.64 solujen tai transfektantit ja eloonjäämisluvut ja /tai ajat kirjattiin. Tulokset on esitetty kuviossa. 2A. Kaikki hiiret injektoitiin i.p. kanssa CMT.64 tai CMT.64 /pp soluja (2 kontrolliryhmiin) kuolivat ennen päivää 27 kasvainsoluinokulaation jälkeen. Toisin kuin kaksi valvontaa, CMT.TAP1 /B7.1 kantavien hiiret osoittivat erittäin merkittävä eloonjäämisprosentti (P«0.05), myös verrattuna kaikkiin muihin hiiren ryhmät (P«0.05). Päivänä 100, 30% hiiristä oli edelleen elossa. Kuitenkin CMT.B7.1 /p-hiirille, ei osoittanut mitään merkittävää eroa, kun kaksi kontrolliryhmää (P 0,05). CMT.TAP1 /p-hiirille, osoittivat merkittävää elinaikaa verrattuna kahteen kontrolleihin (P 0,05), mutta ei eroa CMT.B7.1 /p-hiirille (P 0,05). Tämän kokeen tulokset osoittavat, että merkittävä lasku kasvainten muodostumiseen välittyy ilmaus B7.1 yhdessä TAP1- molekyylien CMT.64 kasvainsoluissa.

Aika sairastuvuus kirjattiin hiiriä (kussakin ryhmässä, n = 10) ympätty eläviä kasvainsoluja tai immunisoitu γ-säteilytettyjä soluja ja sen jälkeen haaste CMT.64 soluihin. Tilastot hiiren eloonjäämisen saatiin käyttämällä Kaplan-Meierin log rank selviytymistesti ja erot katsottiin merkitsevä P 0,05. A) tuumorigeenisyyden havaittiin injektoimalla C57BL /6-hiirten i.p. elävää CMT.64 solujen tai niiden transfektanteilla (5 x 10

4 solua per hiiri). B) Nude-hiiriä käytettiin määritykseen kasvaimien edellytyksiin kasvaimen injektion sama kuin on esitetty A), P 0,05 vertailut. C) C57BL /6-hiiret immunisoitiin i.p. eri γ-säteilytettyjä kasvainsoluja tai PBS: llä suuren annoksen (vasen, 5 x 10

6 solua per hiiri) tai pieniannoksinen (oikealla, 5 x 10

5 solua hiirtä kohti). Jälkeen 20 päivän immunisoinnin jälkeen hiiret altistettiin i.p. elävää CMT.64 kasvainsolujen (2,5 x 10

5 solua hiirtä kohti). Erilaiset eloonjäämisluvut ja /tai aikoina havaittu.

Sen määrittämiseksi, vähentynyt tuumorigeenisyyden CMT.TAP1 /B7.1-solujen T-solujen välittämä, nude-hiiriin inokuloitiin CMT.64-soluja tai transfektantit , ja eloonjääminen määritettiin. Kuvio 2B osoittaa, että kaikki hiiret kuolivat 25-27 päivää, mikä viittaa siihen, että T-solut oli olennainen rooli immuunivastetta CMT.TAP1 /B7.1 soluja, mikä laski aiheuttavan kasvaimia.

CMT. B7.1 /p-rokotukset annetaan suurina annoksina aiheuttaa immuunivasteen yhtä tehokas kuin CMTTAP1 /B7.1-immunisointi mutta on tehottomampi pienellä annoksella

Kasvaintenvastainen immuunivaste voidaan täydennetty B7.1- ilmentävä kasvain-soluilla [16], [17], [18]. Sen arvioimiseksi, onko suojaavan immuniteetin TAP-negatiivisia kasvainsoluja voidaan tuottaa immunisoimalla joko TAP1- ilmentävien CMT.TAP1 /B7.1-soluja tai TAP-negatiivisia CMT.B7.1 /p-soluissa, C57BL /6-hiiriä immunisoitiin eri määriä γ-säteilytettyjä soluja seurasi haasteen CMT.64 soluihin. Kontrollihiiret immunisoitiin γ-säteilytettyjä CMT.64 /s soluja. Tulokset osoittavat annoksesta riippuvaisen suojan. Kun suuri annos immunisoinnin (5 x 10

6 solua hiirtä kohti), molemmat CMT.TAP1 /B7.1-immunisoitujen ja CMT.B7.1 /p-Immunisoituihin hyvin suojattu live kasvain hyökkäys (Kuva. 2C vasen-paneeli). Kaksi hiirtä ryhmää osoitti erittäin merkitsevä eloonjäämisaste (100% eloonjääneitä), verrattuna CMT.TAP1 /p-immunisoitu hiiri ryhmässä (60% eloonjääneitä, p 0,05). Jälkimmäinen ryhmä osoitti eloonjäämisaste huomattavasti korkeampi kuin vertailuryhmällä immunisoitu TAP-negatiivisia CMT.64 /s soluja (P«0.05). Kuitenkin on pieni annos immunisoinnin (5 x 10

5 solua hiirtä kohti), CMT.TAP1 /B7.1-immunisoiduissa hiirissä oli eloonjäämisaste yli CMT.B7.1 /p-immunisoiduissa hiirissä (Fig. 2C oikea-paneeli, P 0,05). Eroa eloonjäämisaste välillä havaittiin CMT.B7.1 /p-immunisoitujen ja CMT.TAP1 /p-immunisoiduissa hiirissä (P 0,05). Tulokset viittaavat siihen, että suurilla annoksilla immunisaation, B7.1 ja TAP1- koekspressoimalla tai B7.1 ilmentyminen yksin tekee kasvainsolujen voimakas immunogeenejä, kun taas pienellä annoksella immunisointiin, voimakas immunogeenisuus edellyttää kasvainsolujen koekspressoivat sekä TAP1- ja B7.1 molekyylejä.

CD8

+ T-soluilla on tärkeä rooli hiiren suoja

Voit selvittää suojelun lisäämisessä jälkeen B7.1 ilmentävä kasvain immunisaatio välittämä T-solujen perustuva immuunivasteen, käytimme mAb: iden tyhjentämiseksi CD8

+ tai CD4

+ T-solut C57BL /6-hiirissä ennen immunisaatiota ja kasvainsolujen haastetta. Hiiret injektoitiin i.p. asiaa mAb joka toinen päivä ensimmäisen viikon analysoitiin FACS-määritykset CD8

+ tai CD4

+ T-solupopulaation veressä. Tulokset osoittivat, että hoito laski jyrkästi CD8

+ T-solujen tai CD4

+ T-solupopulaatio (Fig. 3A). Anti-CD8 erityisiä mAb pienensi CD8

+ T-solujen 17,66%: sta 0,65%, ja anti-CD4-spesifisellä mAbilla vähensi CD4

+ T-solujen 19,22%: sta 0,11%. T-solujen alaryhmän köyhdytettyä hiiriin injektoitiin γ-säteilytettyjä CMT.64 transfektanttien, minkä jälkeen haaste elävien CMT.64-soluja. Survival tulokset on esitetty kuviossa. 3B. Anti-CD8-spesifisellä mAbilla hoito vähensi selviytymisen kasvainta kantavien hiirten. Ei ollut biologisesti merkittävää eroa kutakin testattua-ryhmän ja kontrolliryhmän (CMT.64 /pp-immunisoiduissa hiirissä). Lisäksi, anti-CD4-spesifisellä mAbilla hoitoa osittain vähentynyt selviytymisen Kunkin testatun-ryhmässä, verrattuna kontrolliryhmään (P«0.05). Tulokset viittaavat siihen, että suojan hiirillä kasvaimen haaste täysin riippuvainen CD8

+ T-solujen ja osittain riippuvainen CD4

+ T-soluja.

Hiiret (kukin ryhmä, n = 10) injektoitiin i.p. mAbrllä GK1,5 CD4

+ T-solujen tai 2,43 CD8

+ T-soluja (0,1 ml per hiiri) joka toinen päivä ensimmäisen viikon ja kerran viikossa jälkeenpäin heikentävistä asiaan T-solu väestöryhmästä . A) ennen γ-säteilytettyjä kasvaimen soluilla, CD8

+ tai CD4

+ T-solujen osajoukkoja arvioitiin veressä FACS määrityksiä käyttäen FITC-konjugoitua anti-hiiri-CD8a (5H1-1) tai FITC-konjugoidun anti-hiiri-CD4 (RM4-4) yhdessä PE /Cy5-konjugoidulla anti-hiiri-CD3 (145-2C11). Taajuudet CD8

+ tai CD4

+ T-solut havaittiin ennen mAb hoitoa (merkitty normaali) ja sen jälkeen ensimmäisen viikon mAb hoitoa ja ennen γ-säteilytettyjä kasvaimen soluilla (merkitty mAb-hoito). B) jälkeen 20 päivän immunisoinnin γ-säteilytettyjä kasvainsoluja (5 x 10

6 solua per hiiri) hiiret altistettiin i.p. elävää CMT.64 kasvainsolujen (2,5 x 10

5 solua hiirtä kohti). Aika sairastuvuutta tallennettiin.

esittely TAP-riippumattoman Lass5 antigeenin TAP-puutteellisia tuumorisoluissa

Se, että TAP-puutteellisia B7.1 ilmentävä kasvain solut voivat tuottaa CD8

+ T-solu-välitteisen immuunivasteen TAP-negatiivisia kasvainsoluja viittaa siihen, että kasvainsolut esillä TAP-riippumaton antigeeni (t) T-solujen esikäsittely. Voit selvittää, jos tämä on totta, olemme keskittyneet D

b-rajoitettu Lass5 epitoopin MCLRMTAVM, antigeenin esittämä monet TAP-vajaiden solujen [13]. CMT.64 ja CMT.TAP1,2 cl.21 ilmentävät Lass5 geenin kuten reaaliaikaisella PCR: llä (Fig. 4A vasemmalla). Kuitenkin, TAP-negatiivisia ja TAP1-transfektoidut CMT.64-solut, mutta ei TAP kykenevän CMT.TAP1,2 cl.21 solut tapettiin T-solupopulaation immunisoimalla muodostetun Lass5 peptidillä pulssitetuilla RMA-S /B7.1-soluja joka määritetään pitkäaikainen (12-16 h)

51Cr-release assay (Fig. 4A oikealla). TAP kykenevän CMT.TAP1,2 cl.21 soluja kuoli vain silloin, kun ne oli pulssattu Lass5 peptidi (Fig. 4A oikealla), mikä viittaa siihen, että solut eivät tehokkaasti esittää tämän epitoopin.

A) Vasen : RT-PCR suoritettiin havaita kaksi saumattu (pitkä ja lyhyt) Lass5 geenitranskriptit [13] ja CMT.64, CMT.TAP1,2, cl.2 ja RMA-S-soluja. Vain pitkät transkripti koodaa Lass5 epitooppia [13]. A) Oikea: Lass5 epitoopin esittely TAP-puutteellisia ja TAP-asiantunteva CMT.64 soluissa havaittiin 12-16 h

51Cr-release määrityksissä. Lass5 spesifisiä T-soluja immunisoimalla muodostetun i.p kanssa γ-säteilytettyjä RMA-S /B7.1 soluja pulssitettiin 5 uM Lass5 peptidi. Immunisoiduista pernasoluja stimuloitiin uudelleen

in vitro

kanssa Lass5 peptidilisätyt γ-säteilytettyjä RMA-S /B7.1 soluja 5 päivää. Yksi kolmesta kokeesta. B) Vasen: 12-16 h

51Cr-release testit suoritettiin vahvistamaan, että NP

366-374 eptitope erityinen T-solupopulaation immunisoimalla muodostetun γ-säteilytettyjä RMA-S /B7.1 solujen pulssi 5 uM NP

366-374 peptidi ei sisällä T-solu osapopulaatiosta tunnustaa TAP-riippumaton epitooppien esittämä CMT.64 ja sen transfektanteissa. Tunniste

51Cr-leimattua tavoitteet kuvassa 4B. B) Oikea: Standard

51Cr-release testit suoritettiin sen vahvistamiseksi, että TAP-puutteellisia CMT.64 transfektantteja eivät esittäneet TAP-riippuvainen NP

366-374 epitooppi, kun solut infektoitiin yön yli VV kuljettavat NP

366-374 minigeeninä at infektiokertoimella (MOI) 3.

51Cr-leimattua tavoitteet kuvassa 4B. NP

366-374 epitooppispesifisiä T-soluja immunisoimalla muodostetun γ-säteilytettyjä RMA-S /B7.1 soluja pulssitettiin 5 uM NP

366-374 peptidi ja uudelleen stimuloidaan 5 uM NP

366-374 peptidi in vitro. C) ELISPOT-määritys suoritettiin havaitsemiseksi Lass5 erityisiä IFN-γ-erittävien esiasteita. Hiiret immunisoitiin γ-säteilytettyjä CMT.64 /s, CMT.TAP1,2, CMT.B7.1 /p ja CMT.TAP1 /B7.1 kasvainsoluja. Immunisoiduista pernasoluja stimuloitiin kanssa tai ilman Lass5 peptidiä. Määrä Lass5 antigeenispesifisen IFN-γ-erittävien esiasteiden määritettiin. Esiaste taajuus on raportoitu IFN-γ-erittävien solujen per 10

6 pernasolua (IFN-γ-SC /10

6 pernasolua).

Koska T-solupopulaatio oli tuotettu by RMA-S /B7.1 soluja pulssitettiin Lass5 peptidi, emme voi sulkea pois mahdollisuutta, että T-solupopulaatio sisältää osapopulaatiosta muiden epitoopin spesifisten T-solujen, jotka tappavat TAP-puutteellisia tuumorisoluissa. Tämä johtuu siitä, että RMA-S /B7.1 solut, joita käytetään immunisaatiossa on raportoitu pystyä tuottamaan monia erilaisia ​​K

b ja D

b rajoitettu T-solukloonien [13]. Poistaa tämän mahdollisuuden, meillä tuotti D

b-rajoitettu influenssa NP

366-374 (ASNENMDTM) epitooppispesifisiä T-solupopulaation immunisoimalla RMA-S /B7.1 soluja pulssitettiin NP

366 -374 peptidi käyttäen olosuhteita jotka ovat samanlaisia ​​kuin Lass5 spesifisten T-solujen kehittymistä. Kasvainsolut eivät ilmennä influenssan NP

366-374 epitoopin ja näin NP

366-374 epitooppi T-soluja ei pitäisi tunnistaa syöpäsoluja. Jos T-solupopulaatio sisältää NP

366-374 epitooppi merkityksetön T-soluja, niin T-solupopulaatio voidaan joko tappaa TAP-puutteellisia tuumorisoluja tai ei tappaa soluja. Jos T-solut tappavat kasvainsoluja tämä viittaa siihen, että TAP-riippumaton epitooppispesifisiä T-solut, muut kuin NP

366-374 epitooppi, voidaan käyttää samanaikaisesti immunisoimalla muodostetun RMA-S /B7.1 soluja pulssitettiin NP

366-374 peptidi. Jos T-solut eivät tapa kasvainsoluja tämä viittaa siihen, että peptidi-pulssi RMA-S /B7.1-solut tuottavat T-solupopulaatio, joka sisältää T-soluja, jotka ensisijaisesti tunnistavat peptidin epitoopin käytetty immunisointiin. Tulokset osoittavat, että syntyy T-solut eivät voi tappaa joko TAP-puutteellisia tai TAP-toimivaltaisen tuumorisoluja paitsi CMT.64 soluja pulssitettiin NP

366-374 peptidi (Fig. 4B vasemmalla). Näin ollen meidän tulokset vahvistavat, että TAP-puutteellisia tuumorisoluja läsnä Lass5 epitooppi T-solujen tunnistaminen. Toisin TAP-riippumaton Lass5 epitoopin esittely, TAP-puutteellisia kasvainsolut eivät pystyneet esittämään TAP-riippuvaisen ja D

b-rajoitettu NP

366-374 epitoopin kun solut infektoitiin VV kuljettavat NP

366-374 minigeeninä (kuva 4 B oikealla).

Voit selvittää CMT.TAP1 /B7.1, CMT.B7.1 /p, CMT.TAP1 /p ja CMT.64 /pp soluja pystyvät saamaan aikaan Lass5 spesifisten T-solujen, solut injektoitiin ip C57BL /6-hiiristä, ja IFN-γ erittävät pernasoluja kvantitoitiin käyttäen ELISPOT-määritystä. Kuten on esitetty kuviossa. 4C, suuri lisäys määrä Lass5 erityisiä IFN-γ erittävät pernasolujen havaittiin hiirissä, jotka oli immunisoitu joko CMT.TAP1 /B7.1 tai CMT.B7.1 /p-soluissa verrattuna immunisoitujen hiirten CMT.TAP1 /p tai CMT.64 /s soluja. Nämä tulokset osoittavat, että TAP-negatiivisia ja TAP1-ilmentäviä tuumorisoluja voidaan esittää TAP-riippumattomia antigeeneja, mukaan lukien Lass5 antigeenin ja että B7.1 ilmentyminen kasvainsoluissa tarjoaa paremman T-solun esikäsittely.

Immunisointi CMT. 64-solut infektoitiin sekä VV-B7.1 ja VV-TAP1- lisää suojelu hiiriä kasvaimen haaste

Mahdollinen menetelmä luotettavampi syöpä immunoterapian on käyttää viruksen perustuvan geenin kuljettavien vektori tartuttaa soluja immunisaatio. Koska immunisaation suuri annos B7.1 tai B7.1 + TAP1- transfektoitujen solujen dramaattisesti suojasi hiiriä kasvaimen haaste (Fig. 2C vasemmalla), määritimme jos hiirten immunisointi γ-säteilytettyjä CMT.64-solut infektoitiin VV-B7 0,1 + VV-CR19 (villin tyypin virus) tai VV-B7.1 + VV-TAP1- on vastaavaa suojaa hiiriä immunisoitiin geeni-transfektoitujen syöpäsoluja. Ensin analysoidaan B7.1 ja TAP1- ilmaisun CMT.64 soluissa tartunnan yön yli VV-B7.1 + VV-CR19 tai VV-B7.1 + VV-TAP1-. Havaitsimme, että B7.1 ja TAP1 olivat erittäin ilmaistaan ​​infektoiduissa soluissa asiaan Vvs (Fig. 5A).

CMT.64-soluja infektoitiin yön yli yhdistelmä kahdesta Vvs MOI 3 kullekin VV . A) B7.1: n ekspressio havaittiin FACS: lla määrityksessä, jossa käytettiin FITC-konjugoitua B7.1-spesifinen mAb 16-10A1. CMT.64-solut ilman virusinfektio käytettiin negatiivisena kontrollina. TAP1- ilmentymistä havaittiin Western blot käyttäen vuohen anti-hiiri TAP1- polyklonaalista Ab. RMA-S-soluja käytettiin kontrollina. B) Standard

51Cr-release testit suoritettiin havaita, jos viruksen tartunnan kasvainsoluja vaikuttaa esittäminen endogeenisen kasvaimen antigeenejä. CMT.64 kasvainsoluja infektoitiin yön yli VV-GFP + VV-GFP, VV-B7.1 + VV-GFP tai VV-B7.1 + VV-TAP1, ja käytettiin kohdesoluina. Ohjaus solulinjoja CMT.64, CMT.B7.1 /p ja CMT.TAP1 /B7.1. Kasvaimen antigeeni-spesifisiä T-soluja immunisoimalla muodostetun γ-säteilytettyjä CMT.B7.1 /s soluja. Target ja efektori suhdetta käytettiin 1:100. a: CMT.64; b: CMT.B7.1 /p; c: CMT.TAP1 /B7.1; d: CMT.64 + VV-GFP + VV-GFP; e: CMT.64 + VV-B7.1 + VV-GFP ja f: CMT.64 + VV-B7.1 + VV-TAP1-. ** Osoittaa tilastollista merkitsevyyttä (P«0.05) käyttämällä ANOVA.

Wild-type VV-infektio voi estää antigeenin esittelyä dendriittisolujen [20] ja vähentää tartunnan solujen elinkykyä. Välttää nämä vaikutukset, käytimme rekombinantti VV-GFP korvata villityypin VV-CR19 virus-pohjainen solujen infektion ja immunisaation jälkeen. -Hiiret immunisoitiin i.p. kanssa CMT.64 soluja (5 x 10

6 solua /hiiri) tartunnan VV-GFP + VV-GFP, VV-B7.1 + VV-GFP, tai VV-B7.1 + VV-TAP1-, jota seuraa haasteena live CMT.64 solujen ja eloonjäämisluvuissa määritettiin. Tulokset on esitetty taulukossa 1. Hiiret immunisoitiin VV-B7.1 + VV-TAP1 tartunnan CMT.64-solut osoittivat merkittävästi suurempi eloonjäämisaste, verrattuna immunisoitujen hiirten solut infektoitiin VV-GFP + VV-GFP (kontrollihiiriin ; P 0,05), kun taas mitään eroja ei havaittu kontrollihiirissä ja hiirissä, jotka on immunisoitu infektoiduissa soluissa VV-B7.1 + VV-GFP (P 0,05). Nämä tulokset osoittavat, että immunisaatio virusinfektoitua solujärjestelmä, koekspressio B7.1 ja TAP1 soluissa on välttämätöntä lisätä suojaavaa anti-kasvain immuniteetin.

Koska immunisaatio solut, jotka ilmentävät B7. 1 osoitti jo eri suojaava T-soluvälitteinen immuunivaste välillä virusinfektoitua solu järjestelmä ja geeni-transfektoitujen solujen järjestelmä annoksella 5 x 10

6 solua per hiiri immunisointi, me arveltu, että viruksen johdetut antigeenit vaikuttavat esittäminen TAP riippumattaman luontainen kasvaimen antigeenejä, mikä vähentää kapasiteettia kasvainsolujen T-solujen esikäsittely. Arvioida tämän mahdollisuuden, normaali

51Cr-release määritykset suoritettiin käyttäen T -solujen immunisoimalla muodostetun γ-säteilytettyjä CMT.B7.1 /p-soluja (5 x 10

6 solua /hiiri). CMT.64 infektoidut solut VV-B7.1 + VV-TAP1-, VV-B7.1 + VV-GFP tai VV-GFP + VV-GFP yössä käytettiin kohteina ja VV-infektoitumattomien CMT.64, CMT.B7. 1 /p ja CMT.TAP1 /B7.1-soluja käytettiin kontrolleina. Kuten on esitetty kuviossa. 5B, tunnustamista viruksen infektoimien solujen T-solut oli merkittävästi vähentynyt verrattuna asiaan valvontaa.

Yhdessä voimme päätellä, että tehokas rokotus viruksen infektoimien TAP-negatiivisia soluja edellyttää sekä B7.1 ja TAP1 yhteistyötä ilmentymistä kasvainsoluissa.

keskustelu

Tämä tutkimus osoittaa, että B7.1 ja TAP1 co-ilmentymisen TAP-negatiivisia CMT.64-solut tekee kasvainsolut voimakkaita immunogeenejä pystyy tehokkaasti indusoimaan CD8

+ T-solu-välitteisen immuunivasteen TAP-negatiivisia tuumoreita. Indusoi CD8

+ T-solut todennäköisesti tunnistavat TAP-riippumattomia antigeeneja esittämä TAP-puutteellisia tuumorisoluissa. Kolme tärkeää tekijää, TAP1-, B7.1 ja antigeenin määrä (t) näyttävät osaltaan CMT.64 kasvainsolun pohjustus T-soluja.

tulokset osoittavat, että matalan annoksen γ-säteilytettyjä cell immunisoinnin TAP1 ja B7.1 co-expressing CMT.TAP1 /B7.1-solujen tuottamat tuumorinvastaisen immuunivasteen suurempi kuin indusoitu TAP-negatiivisia ja B7.1 ilmentävien CMT.B7.1 /p-soluissa (kuvio. 2C oikea). Tämä osoittaa, että TAP1- ilmaisu on ratkaiseva rooli vahvistettaessa T-solujen esikäsittely, joka viittaa siihen, että TAP1- ilmaisu voi edistää tehokasta esittämistä TAP-riippumaton kasvain antigeenejä. Mahdollisuus tehokas esittäminen antigeeniä (t) on tuettu kuviossa. 5B (kaistat b ja c), jotka osoittavat, että CMT.B7.1 /p-indusoitua T-solujen tappoi CMT.TAP1 /B7.1 tavoitteiden paremmin kuin CMT.B7.1 /s tavoitteet. Eräs mahdollinen mekanismi on kasvanut antigeenin esittelystä TAP1- on, että sen ilmaisun ”tukee” esitellään joitakin antigeenejä (muut kuin ER-ontelon johdettuja antigeenejä, jotka voidaan esittää sekä TAP-negatiivisia ja TAP1-postive solut), jotka ilmentyvät solun pinta T-solujen tunnistaminen ja /tai T-solujen esikäsittely. Tätä mahdollisuutta tukee näyttö siitä, että rakkulasuutulehdusvirusta nukleokapsidiproteiini johdettu epitooppi VSV-Np

52-59 jota syntyy sytoplasmassa voidaan esittää TAP1- ilmentävien CMT.64 soluja tehokkaammin kuin TAP-negatiivisia CMT.64 soluissa [14]. Meidän havainnot korostavat moninaisuus immuunivasteiden kasvaimia vastaan, jotka ovat rakennettu osaksi solujen immuunijärjestelmän. Merkitys Näiden havaintojen tulisi tutkia edelleen, erityisesti tunnistamiseen TAP-riippumattomia epitooppeja, jotka ovat hyvin esitetty ja ominaisuuksien epitooppispesifisten T-soluja.

B7.1 ilmentymistä kasvainsoluissa voi olla rooli laskeva kynnys antigeenispesifisten T-solujen esikäsittely [21], [22], [23]. Tätä mahdollisuutta tukee havaintomme, että T-solun välittämä anti-CMT.64 kasvainimmuniteetin voidaan täydennetty B7.1 ilmentäviä tuumorisoluja verrattuna B7.1 negatiivisia kasvainsoluja (Fig. 2C vasemmalla). Mekanismeja pohjustus T-solujen vastaan ​​CMT.64 kasvaimia B7.1 ilmentävien TAP-puutteellisia soluja voidaan edullisesti kautta kasvain suoran pohjustus sijaan dendriittisolujen (DC) rajat esikäsittely. Tämä selittää, miksi immunisaatio B7.1 ilmentävien CMT.64-soluja indusoi korkean anti-CMT.64-kasvain immuniteetin, kun taas immunisointi B7.1-negatiivinen CMT.64-solut tarjotaan huomattavasti vähemmän vastustuskykyä. Rajat esikäsittely vaatii ammattilainen antigeenia tarjoavat DC kaapata antigeeniproteiineista apoptoottisia soluja ja käsitellä ja esittää luotu epitoopit T-solujen esikäsittely on TAP-riippuvaisella tavalla [24]. Siten TAP-riippumaton epitooppeja, joita ilmentyy CMT.64 soluissa ei voida esittää DC: n pinnalla T-solujen esikäsittely, koska nämä epitoopit samanlainen peptidien esitellään TAP-puutteellisia RMA-S-solut [25] ilmenevät yleensä alhainen kyky MHC-I sitova, ja siksi ei voi kilpailla TAP-riippuvainen epitooppien MHC-I sitova ja DC: n pinnalla ilmaisua.

antigeenin määrä (t) käytetään immunisaatiossa vaikuttaa suoraan vahvuus syntyy antitumor immuniteetin mikä on vahvistettu tuloksemme koskien annoksesta riippuva immunisaatio γ-säteilytettyjä soluja (Fig. 2C vasemmalle ja oikealle). Korkealla annoksella soluilla, erittäin suojaava vapaudet kertyi molemmat CMT.TAP1 /B7.1 ja CMT.B7.1 /p-soluissa. Tämä viittaa siihen, että sekä γ-säteilytettyjä solulinjat toimitetaan tehokas määrä TAP-riippumattomia antigeeneja ja T-solujen induktioon. Pienellä annoksella immunisaation TAP1–positiivinen CMT.TAP1 /B7.1 soluja stimuloi immuunijärjestelmälle suojaavan immuniteetin parempi kuin TAP-negatiivisia CMT.B7.1 /s soluja. Tämä viittaa siihen, että TAP1 ja B7.1 co-expressing CMT.TAP1 /B7.1-solut vastaavat TAP-riippumattomia antigeeneja ja T-solujen pohjustuksen enemmän kuin se, jonka tarjoaa B7.1 ilmentävien CMT.B7.1 /s soluja.

Tuoreessa raportissa kuvataan, että immunisaatio B7.1-transfektoitujen TAP1- ilmentävien RMA-S-solut herättivät T-solu- pohjainen suojaavan immuniteetin RMA-S-solut [13]. Tuloksemme osoittavat lisäksi, että immunisointi joko TAP1- ilmentävien tai TAP-negatiivisia kasvainsoluja, jotka ilmentävät B7.1 voivat saada aikaan tehokas T-solu-välitteisen immuunivasteen TAP-negatiivisia kasvaimen haaste. Tällaisissa suojaava immuniteetti, CD8

+ T-solut oli tärkeä rooli vastauksena TAP-negatiivisia kasvainsoluja, kun taas CD4

+ T-solut oli merkittävä rooli myös. Koska CMT.64-solut eivät ilmennä MHC-luokan II molekyylejä, joka on tärkeä tehtävä CD4

+ T-solut voivat olla tukea CD8

+ T-soluvasteita kasvainsoluihin [26], [27], [28