Krooninen sairaus

tiivistelmä

Äskettäin miR-182 on raportoitu olevan yli-ilmentynyt eturauhassyöpä (PC) kudokset, mutta yksityiskohtainen toiminnallinen analyysi miR-182-5p ei ole suoritettu. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli: 1. analysoida toimintaa miR-182-5p eturauhassyövässä, 2. arvioida sen käyttökelpoisuus tuumorimarkkeri 3. tunnistaa miR-182-5p kohdegeenien PC, 4. tutkia potentiaalia miR-182-5p inhibiittoria voidaan käyttää PC hoitoon. Aluksi havaittiin, että miR-182-5p ekspressio oli merkittävästi suurempi eturauhassyöpäkudoksille ja solulinjoissa verrattuna normaaliin eturauhasen kudosten ja solujen. Lisäksi korkea miR-182-5p ilmentyminen liittyi lyhyempi eloonjäämisaste PC potilailla. Tutkia toiminnallinen merkitys miR-182-5p, me pudotti miR-182-5p kanssa miR-182-5p estäjä. Sen jälkeen miR-182-5p knock-down, eturauhassyöpä solujen lisääntymistä, muuttoliike ja invaasio laskivat. Havaitsimme

FOXF2

,

RECK

ja

MTSS1

mahdollisina kohdegeenien miR-182-5p käyttämällä useita algoritmeja, jotka vahvistettiin 3’UTR lusiferaasianalyysissä ja Western-analyysi . Knock-down of miR-182-5p myös merkittävästi vähentynyt

in vivo

eturauhasen kasvaimen kasvua. Lopuksi tämä on ensimmäinen raportti dokumentointi että yli-ilmentyminen miR-182-5p liittyy eturauhasen syövän etenemisessä ja potentiaalisesti käyttökelpoinen ennusteen biomarkkereiden. Myös kaataa Mir-182-5p lisäämiseksi ilmentymistä tuumorisuppressorigeeneille

FOXF2

,

RECK

ja

MTSS1

voi olla terapeuttista hyötyä eturauhassyövän hoidossa .

Citation: Hirata H, Ueno K, Shahryari V, Deng G, Tanaka Y, Tabatabai ZL, et al. (2013) MicroRNA-182-5p edistää solujen invaasio ja Proliferation Down Regulating

FOXF2

,

RECK ja MTSS1

Geenit ihmisen eturauhassyöpä. PLoS ONE 8 (1): e55502. doi: 10,1371 /journal.pone.0055502

Editor: Soumitro Pal, lastensairaalassa Boston Harvard Medical School, Yhdysvallat

vastaanotettu: 09 lokakuu 2012; Hyväksytty: 23 joulukuu 2012; Julkaistu: 30 tammikuu 2013

Tämä on avoimen pääsyn artikkeli vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Center for Research Resources National Institutes of Health kautta Grant Number RO1CA138642, RO1CA130860, RO1CA160079, VA Merit Review avustukset, VA Program Project ja Yamada Science Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu, ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PC) on yksi yleisimmistä pahanlaatuisten kasvainten US miehillä [1]. Etiologia PC ei juuri tunneta, vaikka useita riskitekijöitä, kuten etnisyys, suvussa, ja ikään liittyvät tautiin [2]. Lisäksi useat ravinnon ainesosia on liitetty tietokoneeseen riskien ja ehkäisy [3], [4]. Eturauhasen-antigeenin (PSA) seulonta on levinnyt, määrä kovettuvan potilaita on taipumus kasvaa. Kuitenkin huomattava määrä potilaita, joilla imusolmuke etäpesäke havaituista eturauhasen, mikä hoito vaikeutuu [5].

Viime aikoina useat miRNA on tunnistettu ja raportoitu olevan tärkeätä monissa syövissä [6] . MikroRNA (miRNA) ovat pieniä ei-koodaavat RNA: t noin 22 nukleotidin pituisia, jotka kykenevät säätelemään geenin ilmentymistä sekä transkription ja translaation tasolla [7]. MiRNA sitoutua 3′-alue (UTR) ja kohde-mRNA: ta ja tukahduttaa käännös mRNA proteiinin tai indusoivat mRNA: n pilkkominen, jolloin ekspressiota säätelevät kohdegeenien, kuten kasvaimia estävä tai onkogeenien [8], [9]. Äskettäin miR-182 on raportoitu olevan yli-ilmentynyt eturauhassyövän [10]. Kuitenkin funktionaalinen analyysi miR-182-5p ei ole toteutettu eturauhassyöpää. Siksi oletamme että miR-182-5p voi toimia onkogeeni ja olla uusi molekyyli biomarkkereiden eturauhassyövässä. Tämän hypoteesin testaamiseksi olemme alun perin havaittiin, että miR-182-5p ekspressio oli merkittävästi suurempi eturauhassyöpäkudoksille verrattuna normaalin eturauhasen kudoksissa. Lisäksi ilmaus miR-182-5p oli merkittävästi korkeampi eturauhassyövän solulinjoissa (LNCaP, PC-3, DU145), verrattuna normaalin eturauhasen epiteelisolujen (RWPE-1). Toiminnallista analyysiä tutkimuksia, miR-182-5p pudotettiin käyttäen miR-182-5p estäjä. Käytimme myös useita algoritmeja etsiä mahdollisille tuumorisuppressorigeeneille kuin kohdistaminen miR-182-5p. 3’UTR lusiferaasianalyysissä ja Länsi analyysit tehtiin vahvistamaan suoraa vuorovaikutusta miR-182-5p ja näiden kohdegeenien. Lopulta loimme vakaa alhainen miR-182-5p ilmentämissolulinjat ja suoritetaan

in vivo

tutkimuksia, jotta tarkkailla mahdollisia tuumorisuppressiogeeneksi vaikutuksia vierassiirrännänmallissa nude-hiirimallissa.

Tulokset

miRNA-182 ilmentyminen lisääntyy merkittävästi eturauhassyöpäkudoksille ja korreloivat kokonaiselossaolo

MiR-182-5p ekspressiotasot kliinisissä näytteissä (52 näytettä) varmistettiin reaaliaikainen PCR. MiR-182-5p ilmentyminen on esitetty suhde kasvaimen (T) ja /normaali (N) ilmentyminen (T /N-suhde) kussakin pariksi näytteessä (kuvio 1). Näin ollen, jos T /N-suhde on yli 1,0, miR-182-5p ilmentyminen arvioitiin olevan korkeampi eturauhassyöpäkudoksille verrattuna, että täsmäsi viereiseen normaaliin kudokseen. Kuten on esitetty kuviossa 1-A, 5 potilaalla (9,7%), T /N-suhde oli pienempi kuin 1,0, kun taas muut 47 potilasta (90,3%), T /N-suhde oli suurempi kuin 1,0. Näin ollen miR-182-5p ekspressio oli merkittävästi suurempi eturauhassyöpäkudoksille verrattuna vastaaviin normaaleihin eturauhasen kudoksissa. Jaoimme 52 eturauhassyöpäpotilaalla kahteen ryhmään keskiarvon perusteella T /N-suhde (2,27) seuraavasti: 1) korkea miR-182-5p ilmentävien ryhmä (miR-182-5p T /N-suhde suurempi kuin 2,27), 2 ) alhainen miR-182-5p ilmentävien ryhmä (miR-182-5p T /N-suhde pienempi kuin 2,27). Sitten tutkittiin yhdistys miR-182-5p ja useita kliinisiä parametrejä kuten kuvassa 1-B. Kaplan Meier tonttien osoitti kokonaiselossaoloaika oli huomattavasti lyhyempi korkean miR-182-5p ilmentävät (p-arvo = 0,0117, log-rank test) (kuva 1-C).

. Suhteellinen miR-182-5p ilmaisun [kukin kasvainkudoksen (T) /normaalin eturauhasen kudosta (N)], joka perustuu reaaliaikainen PCR-tuloksiin, B. Association between miR-182-5p ilmaisun ja klinikan-patologinen parametrit (ikä diagnoosin, pT , Gleason pisteet, PSA epäonnistuminen ja kokonaiselossaolo) eturauhassyövässä kudoksiin perustuvat q-PCR-tuloksiin. C. Kaplan-Meier tontteja yli-kaikki selviytymisen jälkeen eturauhasen.

miRNA-182-5p ilmentyminen lisääntyy merkittävästi eturauhassyövän solulinjoissa

MiR-182-5p ilme oli merkittävästi korkeampi eturauhassyövän solulinjoissa (LNCaP, PC-3 ja DU145) verrattuna normaaliin eturauhasen solulinja (RWPE-1) (kuvio 2A).

. Ekspression miR-182-5p oli merkittävästi korkeampi kolme eturauhassyöpäsolulinjoissa verrattuna normaaliin eturauhasen solulinja (RWPE-1), B. Suhteellinen miR-182-5p ilmentymistä (miR-NC tai miR-182-5p esiaste transfektoiduissa RWPE-1-soluissa), B. solunelinkykyisyysmääritys (miR-NC tai miR-182-5p esiaste transfektoitiin RWPE-1-soluissa), C. Haavan paranemista määritys (miR-NC tai miR-182-5p esiaste transfektoitiin RWPE-1 solut). Virhe palkit kuvaavat ± S.D. (Keskihajonta).

vaikutus mikroRNA-182-5p over-ilmentyminen solun elinkelpoisuuden ja muuttoliike normaalissa eturauhasessa solulinja

Vahvista toiminto miR-182- 5p, transfektoimme miR-182-5p esiaste osaksi normaalin eturauhasen solulinja (RWPE-1). 48 tuntia transfektion jälkeen miR-NC tai miR-182-5p esiaste osaksi RWPE-1-soluissa, MIR-182-5p ekspressiotaso varmistettiin reaaliaikainen PCR (fold muutos, 526, Fig. 2-B). Sitten solujen elinkykyä (MTS-määritys) ja haavoja analyysit suoritettiin käyttäen RWPE-1-solut transfektoitiin väliaikaisesti miRNA-182-5p esiaste. Havaitsimme huomattavasti solujen lisääntymistä (Fig. 2-C) ja muuttoliike (Fig. 2-D) miRNA-182-5p transfektoiduissa soluissa verrattuna miR-NC transfektoiduissa soluissa.

vaikutus microRNA-182- 5p kaataa solujen elinkelpoisuuden invaasiota ja muuttoliikkeen PC solulinjoissa

Käytimme kaksi eturauhassyövän solulinjoissa (PC-3 ja DU145) korkea miR-182-5p lauseke lisäkokeita koska miR-182 -5p ilmentyminen oli huomattavasti korkeampi näissä solulinjoissa. 48 tuntia transfektion jälkeen inhibiittoria, NC tai miR-182-5p inhibiittori PC-3 ja DU145-soluissa miR-182-5p knock-down varmistettiin reaaliaikainen RT-PCR: llä (0,003, 0,034, vastaavasti) (kuvio . 3-A). Solujen elävyys (MTS-määritys), muuttoliikkeen ja invaasio testit suoritettiin (Fig. 3-B, 3-C, 3-D), ja havaitsimme merkittävän laskun solujen lisääntymisen (Fig. 3-B), invaasiota (Fig. 3 -C) ja muuttoliike (Fig. 3-D) miRNA-182-5p knockdown PC-3 ja DU-145-soluissa verrattuna -estäjä-NC transfektoiduissa soluissa.

Kaksi eturauhassyövän solulinjoissa (PC-3 ja DU145) transfektoitiin ohimenevästi joko miR-182-5p estäjän tai miR-negatiivinen kontrolli (miR-NC-estäjä). A. Suhteellinen miR-182-5p ilmentymistä (miR-NC estäjän tai miR-182-5p estäjä transfektoituja PC-soluja), B. Solujen elinkyvyn (miR-NC estäjän tai miR-182-5p estäjä transfektoituja PC-soluja), C. invaasiomääritys, D. Haavan paranemista määritystä (24 tuntia). Virhe palkit kuvaavat ± S.D. (Keskihajonta).

miR-182-5p suoraan säätelee FOXF2, RECK ja MTSS1

tunnistettu kolme tuumorisuppressorigeeneille (

FOXF2

,

RECK, MTSS1

) potentiaalisia kohde-geenit miR-182-5p perustuu kolmeen algoritmeja (miRDB, TargetScan, microRNA.org).

FOXF2 mRNA on kaksi mahdollista sitoutumiskohtia miR-182-5p sen 3 ’UTR (Fig. 4-A). Suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus on esitetty suhde tulikärpäsen ja Renillan lusiferaasiaktiivisuus jokaisesta näytteestä. Niistä kaksi sivustoja, suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus merkittävästi vähentynyt asemassa 670 miR-182-5p esiaste transfektoiduissa soluissa (kuvio. 4-B). RECK mRNA on yksi mahdollinen sitoutumiskohta (asento 812) ja miR-182-5p sen 3 ’UTR (Fig. 4-A). Suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus merkittävästi vähentynyt, kun asema 812 konstruktia käytettiin miR-182-5p esiaste transfektoiduissa soluissa (kuvio. 4-B). MTSS1 mRNA on neljä mahdollista sitoutumiskohtia miR-182-5p sen 3’UTR ja suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus merkittävästi vähentynyt asemassa 1909 miR-182-5p esiaste transfektoiduissa soluissa (kuvio. 4-B). Mutatoitujen plasmidien (esitetty ”M”), ei ollut merkitsevää eroa lusiferaasiaktiivisuuden välillä valvonta ja miR-182-5p esiaste transfektanttien (Fig. 4-B). Koska kohdegeenin proteiinin ilmentyminen on alhainen PC-3 ja DU145, suoritimme Western-analyysi tarkkailla muutoksia proteiiniekspressiossa kanssa miR-182-5p estäjä. Kuten kuviossa 4-C, proteiinin ilmentymistä kohdegeenien kasvoi merkittävästi, kun miR-182-5p estäjä transfektiolla (Fig. 4-C). Tämä tulos viittaa siihen, että FOXF2, RECK ja MTSS1 mRNA: t ovat kohdistu suoraa miR-182-5p.

. FOXF2, RECK ja MTSS1 3’UTR aseman ja täydentävää miR-182-5p sekvenssin. B. 3’UTR lusiferaasianalyysissä (miR-NC ja miR-182-5p esiaste), Virhepalkit edustavat ± S.D. (Keskihajonta). C. Proteiini ilmentyminen FOXF2, RECK, MTSS1, MMP-2 ja beeta-tubuliinin miR-NC estäjän tai miR-182-5p estäjä transfektoitujen syöpäsolujen (PC-3, DU145).

myös vahvistettu aktiivinen MMP-2-proteiinin ekspressio, koska se on alavirran efektori RECK. Kuten kuviossa 4-C, pilkotaan MMP-2 (aktiivinen tyyppi) proteiinin ilmentyminen väheni merkitsevästi miR-182-5p estäjä transfektoiduissa soluissa.

miR-182-5p inhibiittorin vaikutusta kasvaimen kasvuun in vivo nude-hiirimallissa

jotta tarkkailla miR-182-5p estäjä vaikutukset kasvaimen kasvuun nude-hiirissä, käytimme lentiviraalinen perustuva järjestelmä ja vakaa alhainen miR-182-5p ilmentävät PC-3-solujen ja valvonta (Fig. 5-A). Käytimme 8 hiiriä (4 hiirtä; vakaa alhainen miR-182-5p, 4 hiiret, kontrolli) ja totesi, että vakaa alhainen miR-182-5p ilmentämissolulinjat oli alentanut merkittävästi kasvaimen tilavuuden nude-hiirissä verrattuna kontrolleihin (Kuva. 5- B). Koska emme voineet havaita kasvaimen yksi alhaisen miR-182-5p ilmentymisen ryhmiä, se suljettiin pois kokeen. Mittasimme microRNA tasoilla ksenograftikasvaimissa (miR-182-5p-estäjä ja estäjä-NC), ja totesi, että miR-182-5p ilmentyminen oli merkitsevästi vähemmän miR-182 estäjä ksenografteissa verrattuna estäjä-NC ksenografteissa (Fig. 5-B). Tyypillisiä brutto ulkonäkö kuvaa kasvainten on esitetty kuviossa. 5-C. Kuten kuviossa 5-D, proteiinin ilmentymisen kolmen kohdegeenien (FOXF2, RECK, MTSS1) oli merkitsevästi korkeampi vakaa matala miR-182-5p ilmentävät ksenograftin kasvaimen kudokset.

. Aika kirjaa kasvaimen kokoon miR-NC ja miR-182-5p estäjä ksenografteissa. B. Suhteellinen miR-182-5p ilmentymistä injektion solujen ja sato ksenograftien. Virhe palkit kuvaavat ± S.D. (Keskihajonta). MiR-182-5p ilmentyminen oli merkitsevästi pienempi miR-182-5p estäjä ryhmä. C. Tyypillinen brutto ulkonäkö paljaan hiiren kasvaimia ohjaus ja miR-182-5p estäjä ryhmiä. D. Expression of FOXF2, RECK ja MTSS1 proteiinin kasvainksenografteja.

vaikutus yli-ilmentymisen RECK ja MTSS1 eturauhasen syöpäsolujen (PC-3 ja DU 145) toiminto

tutkimiseksi funktio RECK ja MTSS1, me yliekspressoituu RECK ja MTSS1 eturauhassyövän soluissa, jotka on vahvistettu mittaamalla mRNA: ta (Fig. 6-A), ja proteiinin ilmentymisen tasot (Fig. 6-B). Sitten suoritimme useita toiminnallisia analyysejä. Kuten kuviossa 6 on esitetty, solujen elinkykyä (Fig. 6-C), invaasiota (Fig. 6-D) ja kulkeutuminen (Fig. 6-E) oli merkittävästi inhiboitu RECK ja MTSS1 transfektoitiin syöpäsolujen.

24 tunnin kuluttua transfektiosta joko pCMV6-tyhjä, pCMV6-RECK tai pCMV6-MTSS1 osaksi syöpäsolujen (PC-3 ja DU 145), RECK ja MTSS1 ekspressiotasoja tarkasti reaaliaikainen RT-PCR: llä (A) ja Western analyysi (B) C. solunelinkykyisyysmääritys, D. invaasiomääritys, E. Haavan paranemista määrityksessä Virhepalkit edustavat ± SD (Keskihajonta).

vaikutus FOXF2 siRNA Knockdown soluproliferaatioon, invaasiota ja muuttoliike eturauhassyöpäsoluissa

Kun FOXF2 siRNA kaataa (Fig. 7-A), siellä ei ollut eroa solujen lisääntymisen välillä si-NC ja si-FOXF2 transfektoituja PC-soluissa (kuvio. 7-B). Kuitenkin soluinvaasiota ja haavojen paranemiseen olivat lisääntyneet huomattavasti si-FOXF2 transfektoituja PC-solut (Fig. 7-C, Fig. 7-D).

. FOXF2 proteiinin ekspressio (si-NC tai si-FOXF2 transfektoituja PC-soluja). B. solunelinkykyisyysmääritys (si-NC tai si-FOXF2 transfektoituja PC-solut). C. invaasiomääritys, D. Haavan paranemista määritystä (8 tuntia), Virhepalkit edustavat ± S.D. (Keskihajonta).

Keskustelu

Useita MikroRNA on tunnistettu onkogeeninen eturauhassyövässä perustuen heidän lisääntynyt ilmentyminen eturauhassyövässä kudoksissa tai eturauhassyövän solulinjoissa [10], [ ,,,0],11] – [14]. Toiminnalliset analyysit on suoritettu joitakin näistä onkogeenisten MikroRNA. Esimerkiksi, miR-21 on raportoitu invaasiota ja apoptoosin resistenssin eturauhassyövän soluissa [15], [16] ja miR-125b edistänyt kasvua eturauhassyövän ksenograftikasvaimissa kohdistamalla pro-apoptoottiset geenit [14]. MiR-373 ja miR-520c on myös raportoitu edistää kasvaimen invaasion ja etäpesäkkeiden eturauhassyövässä [12].

Yksi raportti on osoittanut, että miR-182 on tuumorisuppressorina on keuhkosyövän solulinjassa [17 ], kun taas miR-182-5p on raportoitu olevan onkogeenin useita syöpiä [18] – [23]. Segura et ai raportoi, että poikkeava miR-182-5p ilmentyminen edistää -melanoomaetäpesäkemallilla [18]. Liu et al havaitsivat, että miR-182-5p yliekspressio lisäsi kasvaimen muutoksen ja kasvaimen invasiivisuus

in vitro

ja parannettu etäpesäke

in vivo

in munasarjasyöpäsoluja [21]. Siksi vain kaksi selvitykset ovat osoittaneet, että miR-182-5p on onkogeeni perustuu funktionaalista analyysia melanooman ja munasarjasyövän [18], [21].

Samanlaisia ​​tuloksemme, kaksi muuta tutkimuksissa havaittiin miR-182 -5p ilme on huomattavasti korkeampi eturauhassyöpäkudoksille verrattuna normaaliin eturauhasen kudosten [10], [22], mutta ne tehneet toiminnallista analyysiä. Tutkimuksessamme havaitsimme, että miR-182-5p ekspressio oli merkittävästi suurempi eturauhassyöpäkudoksille ja eturauhassyövän solulinjoissa verrattuna normaaliin eturauhasen kudoksia ja solulinjoja. Mielenkiintoista huomasimme, että korkea miR-182-5p ilmentyminen korreloi lyhyempi eloonjäämiseen jälkeen eturauhasen eturauhassyöpäpotilailla. Niinpä seuraava tavoite oli valaista onko miR-182-5p toimii onkogeenin eturauhassyöpää. Käsitellä tätä kysymystä, me aluksi transfektoitu miR-182-5p normaaliksi eturauhasen solulinja (RWPE-1) ja totesi, että miR-182 lisääntynyt solujen lisääntymistä ja haavan paranemista kyky. Olemme myös suorittaa

in vitro

toiminta-analyysejä käyttäen miR-182-5p estäjä eturauhasen syöpäsoluja. Koska miR-182-5p ekspressio oli suurempi kaikissa kolmessa eturauhassyövän solulinjoissa (LNCaP, PC-3, DU145) verrattuna normaalin eturauhasen epiteelisolut, käytimme kahta korkeinta miR-182-5p ilmentäviä solulinjoja (PC-3 ja DU145) toiminnallinen knockdown analyysejä. Kuten odotettua, miR-182-5p Knockdown vähentynyt solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion näissä solulinjoissa. Kuten aiemmin on raportoitu, että miR-182-5p yliekspressio edistää -melanoomaetäpesäkemallilla ja oli onkogeeninen luonteeltaan, tuloksemme osoittavat myös, että miR-182-5p voi olla onkogeeni eturauhassyövän solulinjoissa.

Seuraavaksi tavoitteena oli löytää kohdegeenien miR-182-5p koska MikroRNA niiden vaikutukset säätelemällä ilmentymisen muiden kohdegeenien. Käytimme useita algoritmeja (miRDB, microRNA.org, TargetScan) ja tunnistettiin kolme mahdollista kohdegeenien (FOXF2, RECK, MTSS1). Kuten näytetään 3’UTR lusiferaasianalyysissä ja Länsi analysoi Kolmen potentiaalisen kohdegeeneissä (FOXF2, RECK, MTSS1) ilmentyminen säätelee miR-182-5p.

Kolmesta kohdegeeneissä (RECK, MTSS1, FOXF2), RECK yliekspressio oli raportoitu vähenevän soluinvaasiota estämällä MMP kuten MMP-2 [24]. RECK ilme on raportoitu alas säädellä monella syöpiä kuten eturauhassyöpää [24]. Tutkimuksessamme havaitsimme, että miR-182 estäjä laski aktiivinen-MMP-2: n ilmentymisen eturauhassyövässä solulinjoissa sekä ylös-säätely RECK proteiinia. Lisäksi tutkimme RECK toiminto yli ilmaisemalla se eturauhassyövän solulinjoissa (PC-3 ja DU 145). Kuten on esitetty, RECK esti solujen vaeltamiseen ja invaasiota eturauhasen syöpäsoluja. Rąbień ym osoitti RECK yli-ilmentyminen väheni invasiivista potentiaalia DU 145 soluja [25] ja niiden tulokset ovat samanlaisia ​​kuin meidän. Olemme kuitenkin havaittu, että RECK inhiboi soluproliferaatiota kaksi eturauhassyöpäsolulinjoissa (PC-3 ja DU 145), kun taas Rąbień et ai löytynyt mitään vaikutusta RECK soluproliferaatioon DU 145 soluja. Kuitenkin RECK on raportoitu vähentävän solujen lisääntymistä muissa syövissä [26], [27]. Näin ylimääräisiä kokeita tarvitaan selvittämään näitä eroja. Toistaiseksi miR-21 ja miR-222 on todettu kohdistaa RECK eturauhassyövässä ja mahasyövän [28], [29], mutta ei ole ollut raportteja miR-182-5p ja RECK. Kuitenkin myös tulokset osoittavat, että miR-182-5p suoraan säätelee RECK ilmentymisen eturauhassyöpäsolulinjoissa.

MTSS1 (metastaasi tuumorisuppressorigeenin-1) tunnistettiin alunperin kasvainsuppressorigeenin virtsarakon syöpään [30]. Äskettäin toiminta MTSS1 tutkittiin eturauhassyövän solulinjoissa ja todettu merkittävästi tukahduttaa solujen vaeltamiseen ja lisääntymistä [31]. Lisäksi miR-182 on raportoitu alas-säädellä MTSS1 ja edistää etäpesäkkeiden maksasolusyövän [32], Tämän seurauksena hyvin samankaltainen kuin meidän.

FOXF2 on raportoitu alas MMP-1 ja säätää ylös TIMP-3, joka on tunnettu estäjä MMP [33]. Lisäksi FOXF2 pienenee Wnt5a [34], joka toimii kautta kaanoniin Wnt signalointireittien edistää angiogeneesiä ja solujen eloonjäämistä. Wnt5a ilmentyminen eturauhassyövässä kudoksiin on korreloinut korkea Gleason tulokset ja biokemialliset eturauhassyövän uusiutumisen [35]. Knockdown ja yli-ilmentyminen Wnt5a ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa vähennettävä ja kannustanut vastaavasti hyökkäys toimintaa [35]. Lisäksi Wnt5a indusoi ilmentymistä metalloproteinaasi-1: n (MMP-1) eturauhassyövässä [34], [35]. Tutkimuksessamme FOXF2 kaataa lisääntynyt solujen invaasiota ja muuttoliike eturauhassyövän solulinjoissa. Siten tulokset viittaavat siihen, että onkopsykologista miR-182-5p voi olla osallisena säätelyssä nämä hyökkäyksen ja metastaattisen synnyssä. Äskettäin miR-301 määriteltiin onkogeenin ja kerrottiin välittävän leviämisen kautta säädellään FOXF2 rintasyövässä [36]. Paitsi miR-301, ei tutkimukset ovat osoittaneet suoraa sääntelyä FOXF2 jonka miRNA.

Tutkimme myös mahdollisuutta käyttää miR-182-5p estäjä mahdollisena PC hoitoa. Tämän saavuttamiseksi käytimme

in vivo

nude mouse ksenograftimallissa vakaat alhaisen miR-182-5p ilmentävien syöpäsolujen tätä tutkimusta varten. Tuumorin tilavuus nude-hiirissä oli merkittävästi vähentynyt alhaisen miR-182-5p ilmentäviä soluja verrattuna kontrollisoluihin. Lisäksi tasot FOXF2, RECK ja MTSS1 olivat merkittävästi korkeammat Ksenograftikudoksista matalan miR-182-5p ilmentävien syöpäsolujen. Nämä tulokset osoittavat, että knockdovvn miR-182-5p lisääntynyt ilmentyminen näiden kasvainten suppressorigeenien kohdegeenien

in vitro

ja

in vivo

. Koska olemme keskittyneet kolmeen kohdegeenien (

RECK

,

MTSS1

ja

FOXF2

) ja tutkitaan vain 52 kliinistä näytettä, lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään roolin miR -182-5p eturauhassyövässä ja sen käyttö kliinisissä sovelluksissa.

Yhteenvetona tämä on ensimmäinen raportti dokumentointi että yli-ilmentyminen miR-182-5p liittyy eturauhasen syövän etenemisessä ja mahdollisesti käyttökelpoisia ennustetyövälineenä biomarkkereiden. Lisäksi kaatamalla Mir-182-5p kanssa estäjä voi olla terapeuttista hyötyä tehostaen tuumorisuppressorigeeneille FOXF2, RECK ja MTSS1 eturauhasen syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

Formaliinifiksoidusta, parafinoidut (FFPE) eturauhassyöpänäytteissä saatiin San Francisco Veterans Affairs (VA) Medical Center. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta ja tutkimuksen hyväksyi UCSF komitean Human Research (Hyväksyntänumero: H9058-35751-01).

Eläimet

Kaikki eläinten hoito oli sopusoinnussa suuntaviivojen kanssa San Francisco Veterans Affairs Medical Center ja tutkimuksen hyväksyi San Francisco VA IACUC (Protocol numero: 08-003-01). Eläinten käyttäjät ovat suorittaneet koulutusohjelmia käsitellä ja työskennellä hiirillä kautta AALAS (American Association for Laboratory Animal Science) ennen eläinkokeita. Yhteensä 8 nude-hiirten (kanta BALB /c nu /nu; Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA) käytettiin ja aluksi eturauhassyövän solut injektoitiin ihonalaisesti ja kasvaimen kokoa seurattiin kuten edellä sivulla 7. Kun kasvaimen kasvua , hiiret lopetettiin yliannoksella isofluraanin hengitettynä. Sitten ksenograftikudoksesta poistettiin.

Kliiniset näytteet

Kaikkiaan 52 potilaalla on patologisesti vahvistettu eturauhassyövän otettiin tässä tutkimuksessa (Veterans Affairs Medical Center at San Francisco). Näytteet saatiin potilailta, kun kirjallinen suostumus. Yksityiskohtaiset potilastiedot on esitetty taulukossa 1.

Soluviljely

Normaalit eturauhasen epiteelisolujen (RWPE-1, ATCC-CRL-11609) ja eturauhassyövän solulinjoissa (LNCaP; ATCC-CRL-1740, PC-3, ATCC-CRL-1435, DU145, ATCC-HTB-81) hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). Eturauhassyövän solulinjaa viljeltiin RPMI 1640 -elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia. RWPE-1-soluja viljeltiin keratinosyyttien-SFM (GIBCO /Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Kun ostetaan, pysyvien varastojen soluja valmistettiin ja kaikki solut säilytettiin -80 asteen käyttöön saakka. Solut käytettiin kokeisiin kuluessa 6 kuukautta.

Kokonais-RNA ja proteiini uuttamalla

RNA (microRNA ja kokonais-RNA) uutettiin formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut (FFPE) ihmisen eturauhassyövän ( n = 52) ja sovitettu viereisen ei-syöpä normaalissa eturauhasessa kudoksissa (n = 43) tai eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun (BPH) (n = 9), käyttäen miRNeasy FFPE (Qiagen) sen jälkeen, kun laser talteenotto mikro-leikkelyn perustuu patologi arvostelua. RNA (microRNA ja kokonais-RNA) oli myös uutettiin ihmisen solulinjoja käyttämällä miRNeasy mini kit (QIAGEN), ja uutetaan Ksenograftikudoksista homogenisoitiin 1 ml: ssa TRIzol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA), sitten puhdistettiin RNeasy pylväät (QIAGEN). Sulattaa DNA, Qiagen RNase-Free DNaasia kit käytettiin. Solut lyysattiin RIPA-puskurilla (Pierce, Brebieres, Ranska), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita (Sigma, St. Louis, MO). Proteiini uutettiin Ksenograftikudoksista käyttäen Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER) (Thermo Scientific, Rockford, IL). Proteiini kvantifiointi suoritettiin käyttämällä BCA-proteiinimäärityksellä (Pierce, Brebieres, Ranska).

MicroRNA ja microRNA estäjä transfektio

Anti-miR ™ miRNA-inhibiittori [negatiivinen kontrolli (miR-NC-estäjä) tai miR-182-5p estäjä (miR-182-5p estäjä), Ambion] transfektoitiin transientisti syöpäsolut SIPORT NeoFX transfektio Agent (Ambion) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Pre-miR ™ miRNA lähtöaineiden [negatiivinen kontrolli (miR-NC) tai HSA-miR-182-5p (miR-182-5p), Ambion] transfektoitiin soluihin Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

solujen elinkelpoisuus, solujen invaasion ja haavoja määritys

solujen elinkelpoisuus mitattiin 3 päivää transfektion jälkeen (miR-NC-inhibiittori /miR-182-5p estäjä transfektantin) MTS (CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell proliferaatiotesti, Promega). Tiedot ovat keskiarvo ± S.D. 3 riippumattoman kokeen. Soluinvaasion määritykset suoritettiin CytoSelect 24-kuoppaisen solu- invaasiomääritys kit (Cell Biolab, San Diego, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Transfektoidut solut (miR-NC-inhibiittori /miR-182-5p estäjä transfektantin-48 tuntia) suspensoitiin uudelleen elatusaineeseen ilman FBS: ää ja laitettiin ylemmän kammion kolmena kappaleena. 48 tunnin kuluttua inkubaation 37 ° C: ssa (5% CO2), solut vaeltavat kalvon läpi värjättiin. Tulokset ilmaistiin tunkeutuneet soluissa määrällisesti OD 560 nm: ssä. Haavan paranemista määritys suoritettiin CytoSelect 24 ja haavoja iinianalyysikitissä mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Voit luoda haava kenttä, transfektoidut solut (miR-NC estäjän tai miR-182-5p estäjä transfektantin-48 tuntia transfektion) viljeltiin, kunnes ne muodostivat yksikerroksista ympärille insertin. Poistamisen jälkeen insertti, joka on 0,9 mm: n avoin haava kenttä on luotu ja solujen annettiin siirtyä molemmin puolin kuilua. Haavan seurattiin ja prosentuaalinen sulkemista mitattiin. [Prosenttia sulkeminen korko (%) = siirtynyt solun pinta-ala /kokonaispinta-ala x100)].

Quantitative reaaliaikaisen RT-PCR

Quantitative reaaliaikaisen RT-PCR suoritettiin kolmena kappaleena Applied Biosystems Prism 7500 Fast Sequence Detection System käyttäen TaqMan Universal PCR master mix mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA). TaqMan-koettimet ja alukkeet toimitti Applied Biosystems. RNU48 käytettiin endogeeninen kontrolli. Tasot RNA-ilmentymisen määritettiin käyttämällä 7500 Fast System SDS-ohjelmiston versio 1.3.1 (Applied Biosystems).

Western-analyysi

Yhteensä solun proteiini (15-20 ug) käytettiin Western blotting . Näytteet ratkaistiin 4-20% Tarkka proteiinigeeleissä (Pierce, Brebieres, Ranska) ja siirrettiin PVDF-kalvoille (Amersham Biosciences, Fairfield, CT). Membraanit upotettiin 0,3% rasvatonta maitoa TBS: ssä, joka sisälsi 0,1% Tween 20: ssa 1 tunnin ajan ja tutkittiin ensisijaisen polyklonaalista ja monoklonaalista vasta-ainetta vastaan ​​FOXF2 (# ab23306, Abcam, Cambridge, MA), RECK (# 3433, Cell Signaling Technology), MTSS1 (# 4385, Cell signaling Technology), MMP-2 (# 4022, Cell signaling Technology) ja beeta-tubuliinia (# 2128, Cell signalointi Technology) yön yli 4 ° C: ssa. Blotit pestiin TBS: ssä, joka sisälsi 0,1% Tween 20: tä ja leimattu piparjuuren peroksidaasilla (HRP) konjugoidun sekundaarisen anti-hiiri- tai anti-kani-vasta-ainetta (Cell Signaling Technology, Beverly, MA). Proteiinit parantaa kemiluminesenssin (Amersham ECL plus Western blotting tunnistusjärjestelmä, Fairfield, CT) visualisointiin. Proteiinin ilmentymistasot ilmaistu suhteessa beta-tubuliinin tasoilla.

Plasmidi rakentaminen ja 3’UTR-lusiferaasianalyysissä

rakennettu yksittäisten plasmidien kunkin sitoutumiskohdan 3’UTR mRNA: n potentiaali kohdegeenien perustuu microRNA.org tietoa. Sitten vahvisti miR-182-5p sitoutumisen 3’UTR kohdegeenin mRNA lusiferaasianalyysissä kanssa miR-182-5p esiaste. PmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target ekspressiovektoria käytetään suorittamaan 3’UTR lusiferaasi määritystä (Promega, Madison, WI, USA). Aluke sekvenssejä käytettiin plasmidin inserttien on esitetty taulukossa 2. kokonaistilavuudessa 20 ui, 5 ui kutakin 100 uM forward-aluketta ja reverse-aluketta, 2 ui 10x hybridisointipuskuriliuosta (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 M NaCl, 10 mM EDTA) ja 8 ui vettä lisättiin 200 ui PCR-putkeen, ja niitä inkuboitiin 95 ° C: ssa 5 minuuttia ja sitten sijoitetaan huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan. Oligonukleotidit ligatoitiin

Pme

I

Xba

I -kohtaan pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector. Colony suora PCR suoritettiin insert tunnustamista käyttämällä REDTaq (Sigma, St. Louis, MO, USA). Käytetyt alukkeet PCR olivat seuraavat: eteenpäin aluke, 5′-cgtgctggaacacggtaaaa-3 ’; reverse-aluke, 5’-gcagccaactcagcttcctt-3 ’. PCR-parametrit pyöräily olivat seuraavat: 94 ° C 3 minuuttia, 30 PCR-sykliä 94 ° C 30 sekuntia, 55 ° C 30 sekuntia ja 72 ° C 30 sekuntia, 72 ° C: ssa 10 minuuttia ja 4 ° C 10 minuutin ajan. PCR-tuote hajotettiin NotI (Takara /Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA). Koot vektoreita, jotka sisältävät inserttejä oli noin 200 bp ja 100 bp: n elektroforeesilla koska Notl-tunnistussekvenssi liitettiin alukkeita.

miR-182-5p esiaste transfektio, eturauhassyövän solut yhteistyötä transfektoitu miR-NC ja pmirGLO tai miR-182-5p ja pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target ekspressiovektorit käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Lusiferaasiaktiivisuus arvioitiin käyttäen Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega) (48 tuntia transfektion jälkeen).

vakaiden matalan miR-182-5p ilmentävien syöpäsolujen ja vaikutukset

in vivo

kasvaimen kasvua

jotta tarkkailla

in vivo

vaikutus miR-182-5p estäjä eturauhassyövän soluissa, olemme laatineet vakaa alhainen miR-182-5p ilmentävien eturauhasen syöpäsolun linjat, jotka perustuvat lenti-virus-järjestelmä. Sitten käyttäneet

in vivo

nude mouse ksenograftimallissa. Lentivirus transfektio suoritettiin käyttäen Lenti-Pac HIV Expression Packaging Kit (luettelo #, HPK-LvTR-20, GeneCopoeia, Rockville, MD, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Nimittäin HSA-miR-182-5p estäjä vektori (luettelo #; HMIR-AN0239-AM03, GeneCopoeia, Rockville, MD) tai miRNA estäjä sekoitetun ohjaus klooni pEZX-AM03 (luettelo #; CmiR-AN0001-AM03, GeneCopoeia, Rockville, MD), jossa Lenti-Pac HIV sekoitus transfektoitiin 293 Ta-soluja (GeneCopoeia) ja inkuboitiin 14 tuntia 37 °. Sitten väliaine korvattiin tuoreella alustalla, joka sisälsi 1/500 tilavuus TiterBoost reagenssia. Sen jälkeen kun oli inkuboitu 48 tuntia 37 °, n sisältävä supernatantti lentiviruksen hiukkaset sentrifugoitiin 500 x g 10 minuuttia, suodatettiin 0,45 um: n PES suodattimen (Whatman /Fisher Scientific), ja kerättiin steriileihin putkiin. PC-3-solut infektoitiin lentivirus- partikkeleita käyttämällä Polybrene (8 ug /ml) (Sigma-Aldrich).