Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vaikka Mesd keksittiin erikoistunut molekyyli endoplasmakalvoston chaperone, että Wnt koreseptorit LRP5: stä ja LRP6, rekombinantti Mesd proteiini pystyy sitoutumaan kypsä LRP5: stä ja LRP6 solun pinnalla ja toimii universaali antagonisti LRP5: stä /6 modulaattorit. Edellisessä tutkimuksessa havaittiin, että C-terminaalinen alue Mesd, joka puuttuu sekvenssit selkärangattomista, on välttämätön ja riittävä sitoutumisen kypsyä LRP6 solun pinnalla. Esillä olevissa tutkimuksissa, olemme edelleen tunnettu siitä, vuorovaikutusta C-pään alueen Mesd peptidi ja LRP5: stä /6. Olemme havainneet, että Mesd C-pään alueen peptidejä estää Mesd sitoutuminen LRP5: stä solun pinnalla liikaa. Osoitimme myös, että on olemassa kaksi LRP5: stä /6 sitoutumiskohtien Mesd C-terminaalinen alue, joka sisältää useita positiivisesti varautuneita tähteitä. Lisäksi olemme osoittaneet, että Mesd C-terminaalinen alue peptidin, kuten täyspitkä Mesd proteiini, estää Wnt 3A- ja Rspodin1 aiheuttama Wnt /β-kateniinin signalointi LRP5- ja LRP6- ilmentävien solujen, tukahdutetaan Wnt /β-kateniinin signalointia ihmisen rinta- Hs578T-soluja ja eturauhassyöpä PC-3-soluja, ja se esti syövän solujen proliferaatiota, vaikka täyspitkä Mesd proteiini on voimakkaampi kuin sen peptidin. Lopuksi todettiin, että hoito täyspitkän Mesd proteiini ja sen C-pään alueen peptidi lisäsi merkittävästi kemoterapia aine adriamysiini-indusoitu sytotoksisuus Hs578T ja PC-3-soluja. Yhdessä tulokset viittaavat siihen, että Mesd C-terminaalinen alue muodostaa suurimman LRP5: stä /6-sitova domeeni, ja että Mesd proteiini ja sen C-pään alueen peptidi on mahdollista terapeuttista arvoa syövän.

Citation: Lin C Lu W, Zhang W, Londoño-Joshi aI, Buchsbaum DJ, Bu G, et al. (2013) C-pään alueen Mesd peptidijäljittelijöiden Full-Length Mesd ja toimii estäjänä Wnt /β-kateniinin Signaling syöpäsoluissa. PLoS ONE 8 (2): e58102. doi: 10,1371 /journal.pone.0058102

Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 toukokuu 2012; Hyväksytty: 03 helmikuu 2013; Julkaistu: 28 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Lin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Institutes of Health RO1CA124531 (ja YL) ja National Cancer Institute myöntää CA 13148 (sen UAB Kattava Cancer Center). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Yonghe Li ja Guojun Bu on lueteltu keksijöiden patentin käytöstä Mesd luun sairaus ja syöpä, ja Guojun Bu toimii konsulttina Raptor Pharmaceutical, joka on lisensoitu tätä patenttia Washington University in St. Louis. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

LDL-reseptorin kaltainen proteiini-5 (LRP5: stä) ja LRP6 kaksi jäsenet laajeneva alhaisen lipoproteiinin reseptorin (LDLR) perhe. Frizzled (FZD) reseptorit voivat reagoida Wnt-proteiinien vain, kun läsnä on Wnt koreseptorin LRP5: stä tai LRP6 aktivoida kanoninen β-kateniinin kautta. Puuttuessa Wnts, β-kateniinin on erottautuvat monimutkainen, joka koostuu adenomatoottisen polypoosin coli (APC) tuumorisuppressorin, ak- siini, glykogeenisyntaasikinaasi-3β (GSK3p), ja kaseiinikinaasin 1 (CK1). Tämä kompleksin muodostuminen indusoi fosforylaation β-kateniinin by CK1 ja GSK3p, joka johtaa ubikitinaation ja myöhemmän hajoamisen β-kateniinin, että 26S-proteasomin. Toiminnan tämän monimutkaisen estyy sitoutumisessa Wnt sen solupintareseptoreita FZD ja LRP. LRP-Wnt-FZD sitovia tuloksia vakauttaminen sytosolin β-kateniinin, joka sitten siirtyy ytimen muodostaa kompleksin transkriptiotekijöiden T-solu-tekijän /lymfaattisen parantaa tekijä (TCF /LEF) perhe aktivoimaan transkription Wnt tavoitteen geenit, jotka säätelevät solusyklin, kasvua ja etenemistä [1] – [3].

LRP5: stä ja LRP6 suoritetaan modulointi useiden eritettyjen proteiinien, jotka sitoutuvat solunulkoiseen β-potkurin /EGF toista moduulien LRP5: stä /6 [3]. Wnt ja Rspondin (RSPO) proteiinit ovat kaksi ryhmää Wnt /β-kateniinin signalointi agonistit. Samanlaisia ​​Wnt ligandien toimintaa RSPO proteiinien Wnt /β-kateniinin signalointi vaatii Wnt reseptoreiden FZD ja LRP5: stä /6, vaikka suoran sitoutumisen välillä RSPO ja LRP5: stä /6 on kiistanalainen [4] – [8]. Lisäksi RSPO proteiinit voivat toimia synergisesti Wnt-ligandien aktivoida Wnt /β-kateniinin signalointi [5], [8], [9].

Vaikka Mesd keksittiin erikoistunut molekyyli- solulimakalvostoon (ER) kaperonin että Wnt koreseptorit LRP5: stä ja LRP6 [10], [11], yhdistelmä-DNA-Mesd proteiini pystyy sitoutumaan kypsä LRP5: stä ja LRP6 solun pinnalla, toimii universaalina inhibiittorina eri LRP5: stä /6 modulaattoreita, ja estää Wnt /β-kateniinin signalointi Wnt-riippuvaisten syöpäsolujen [8], [12] – [14]. Edellisessä tutkimuksessa havaittiin, että C-terminaalinen alue Mesd, joka puuttuu sekvenssit selkärangattomista, on välttämätön ja riittävä sitoutumisen kypsyä LRP6 solun pinnalla [12]. Esillä olevissa tutkimuksissa olemme tunnettu vuorovaikutus C-pään alueen Mesd peptidi ja LRP5: stä /6. Tutkimme myös rooli C-pään alueen Mesd peptidin Wnt /β-kateniinin signalointi syöpäsoluissa.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Plasmidi pcDNA3.1C Myc-hLRP5 sisälsi täyspitkän ihmisen LRP5: stä cDNA: n ja plasmidi-PCS-Myc-hLRP6 sisälsi täyspitkän ihmisen LRP6 cDNA oli tri Cindy Bartels (Case Western Reserve University, Cleveland) ja tri Christof Niehrs (Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg, Saksa), tässä järjestyksessä. Plasmidi pGST-E-kadheriinin saatiin tohtori Gail Johnson (University of Rochester, New York). Plasmidi pUSEamp-Wnt1-HA, joka sisältää hiiren täyspitkän Wnt1 cDNA ostettiin Upstate. Plasmidi BA-Wnt10b sisälsi täyspitkän hiiren Wnt10b olivat Addgene. TOPFlash lusiferaarikonstrukti oli Upstate Biotechnology, ja Super8XTOPFlash lusiferaarikonstrukti saatiin tri Randall T. Moon (University of Washington, Seattle). Β-galaktosidaasi-ilmentävällä vektorilla oli Promega. Valmistaminen rekombinantti hiiren Mesd proteiinin ja hiiren Mesd C-pään alueen peptidiä, mMesd (50-195), on kuvattu aiemmin [12]. Kaikki muut hiiri Mesd peptidejä, ihmisen Mesd C-terminaalinen alue peptidin hMesd (160-197) (KGGGSKEKNKTKQDKGKKKKEGDLKSRSSKEENRAGNK) ja sen valvontaan peptidi (KEGDRKPRASKEGDRKPRASKEGDRKPRASKEGDRKPR) valmisti EZBiolab. Rekombinantti ihmisen Rspo1 proteiini saatiin tri Kyung-Ah Kim (Nuvelo Inc., Kalifornia). Adriamysiini ostettiin Sigma. Anti-osteoprotegeriinin (OPG) vasta-aine saatiin R 0,01 verrattuna LRP6 tai LRP5: stä solujen puuttuessa Mesd ja sen peptidejä.

On kaksi LRP5: stä /6 sitoutumiskohtien Mesd C-terminaalinen alue

edelleen karakterisoimiseksi Mesd sitoutumista LRP5: stä /6, valmistimme 6 Mesd perustuvia peptidejä hiiren Mesd C-pään alueen sekvenssi (kuvio 1A), ja suoritettiin

125I-Mesd sitoutumisen määrityksessä LRP6- ja LRP5: stä-ilmentävien solujen läsnä ollessa tai ilman näitä peptidejä. Vaikka mMesd (155-164) ja mMesd (165-182) eivät kyenneet estämään Mesd proteiinin sitoutumista LRP5: stä tai LRP6 solun pinnalla, mMesd (160-169) osoitti samanlaista estämisen taso, kuten mMesd (155-173) ( Kuvio 1C). Lisäksi mMesd (183-191) näytetään myös samantasoiset eston mMesd (174-191) ja mMesd (160-169) (kuvio 1 C). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että on olemassa kaksi LRP5: stä /6 sitoutumiskohtien Mesd C-terminaalinen alue. Lisäksi on kiinnostavaa huomata, että mMesd (160-169) ja mMesd (183-191), joka näkyy niiden kyky inhiboida pitoisuudella 50 uM, joka on 100 kertaa niistä, joita tarvitaan mMesd (155-191), mikä viittaa siihen, että kaksi LRP5: stä /6 sitoutumiskohtien Mesd C-pään alueen yhteistyötä keskenään perustaa korkean affiniteetin sitoutuminen toimialueen LRP5: stä /6.

eristetty C-terminaaliset peptidit säilyttää rakenteelliset ominaisuudet täyspitkän Mesd

tulokset sitoutumismääritykset ovat yhdenmukaisia ​​viimeaikaisten NMR tutkimuksen täyspitkän Mesd [24], mikä osoittaa, että C-terminaalinen joustava kierteisen domeenin (156-195) on rakenteellisesti erillinen ydindomeeni (1- 155), ja vastaa escort toimintaa Mesd sitoutumalla LRP5: stä /6. Kuitenkin peptidit voivat olla merkittäviä rakennemuutoksia eristettynä proteiineista. Tutkimaan edelleen rakenteellinen oivalluksia, suoritimme molekyylidynamiikka simulaatioita kaikilla kolmella peptidit [mMesd (155-191), mMesd (160-169) ja mMesd (183-191)] ja niitä verrattiin NMR rakenteen täyspitkän Mesd proteiinia. Klusterointi analyysi simuloinnin tulokset osoittivat, että kaikki kolme peptidit antoi suhteellisen vakaa konformaation. Kaikkein asutuilla konformaatioita kolmesta peptidejä on esitetty kuviossa 2C-2E. Sen sijaan, että laajennettu silmukan kaltainen muoto C-terminaalisen domeenin täysipituisen Mesd (kuvio 2A), mMesd (155-191) voidaan taittaa enemmän kompakti rakenne sekä sen C- ja N-päiden taivutus kohti keskustaa ( Kuvio 2B). Huolimatta näennäinen rakenteellisia eroja, sekä rakenteet ylläpidetään positiivinen pinta koostui positiivisesti varautuneet tähteet ja niiden sivuketjut sijoittaa samalle puolelle ja täysin alttiina liuottimelle (kuvio 2A ja 2B). Tällainen positiivinen pinta on ratkaiseva Mesd n sitoutuvat kyky kypsyä LRP5: stä /6. Kiinnostavaa kyllä, tämä positiivinen pinta voidaan tilallisesti jaettu kahteen alueeseen, jotka muodostuvat pääasiassa positiivisesti varautunut tähteillä mMesd (160-169) ja mMesd (183-190), vastaavasti (kuvio 2A ja 2B). Tulokset osoittavat, että ~45% ja ~58% kaikista simulointi otoksia mMesd (160-169) ja Mesd (182-190), vastaavasti, antoi samanlaiset konformaatiot kuin niiden vastaavat olevista täyspitkän Mesd rakenne (kuvio 2D ja 2E). Samanlainen rakenteelliset ominaisuudet ja positiivinen pinta selittää, että kaksi lyhyempää peptidejä näyttää vastaavan toiminnon sitoutumiseen LRP5: stä /6.

(A) NMR-rakenne hiiren Mesd C-terminaalista domeenia (155-191), joka perustuu tutkimus Chen et al. (24). (B) Tyypillisimpiä tilannekuvan peptidin mMesd (155-191). Segmentit on 160-169 ja 183-191 korostettiin oranssi ja vihreä väri. Tähteet, jotka muodostavat positiivisen pinnan näytettiin kiinteässä tikkuja. Kaksi vaipan alueet, jotka koostuvat jäämiä 160-169 segmentin tai 183-191segment oli merkitty sinisellä ja punaisella katkoviivalla piireissä. Tähteet, jotka ovat ainutlaatuisia positiiviseen pintaan A) tai B) leimattiin punaisella värillä. (C-E) kaikkein asutuilla konformaatioita perustuu ryhmittely analyysi simulointi tilannekuvia kolme C-terminaaliset peptidit mMesd (155-191) (C), mMesd (160-169) (D) ja mMesd (183-191) ( E).

Euroopan Mesd C-pään alueen peptidi lohkoja Wnt /β-kateniinin signaloinnin aiheuttama Wnt3A ja Rspo1 in LRP5- tai LRP6 ilmentäviä HEK293

Wnt3A on yksi 19 selkärankaisten jäsenet Wnt perheen. On neljä jäsentä RSPO perheessä. Sekä Wnt3A ja Rspo1 pystyvät aktivoimaan Wnt /β-kateniinin signalointi LRP5: stä tai LRP6 [5], [8], [9]. Siksi teimme Wnt /β-kateniinin signaloinnin reportterimääritys testata, onko Mesd C-terminaalinen alue peptidi jäljittelee Mesd proteiinia toimimaan inhibiittorina Wnt /β-kateniinin signaloinnin aiheuttama Wnt3A ja Rspo1 in LRP5- tai LRP6 ilmentävien solujen . HEK293-solut transfektoitiin ohimenevästi LRP5: stä tai LRP6 yhdessä Wnt /β-kateniinin signaloinnin toimittaja TOPFLash, ja käsiteltiin Wnt3A CM tai Rspo1 proteiinin läsnä ollessa tai puuttuessa hiiren Mesd proteiinin tai sen C-terminaalinen alue peptidin mMesd (155-191) . Kuten odotettua, TOPFlash aktiivisuus lisääntyi suuresti sen jälkeen, kun HEK293-soluja transfektoitiin ohimenevästi LRP5: stä tai LRP6 ja käsiteltiin Wnt3A tai Rspo1 (kuvio 3). Tärkeää on, että lisääntynyt TOPFlash indusoimaa LRP5: stä, LRP6, LRP5: stä sekä Wnt3A, LRP6 plus Wnt3A, LRP5: stä sekä Rspo1 tai LRP6 plus Rspo1 on estetty ei ainoastaan ​​Mesd proteiinia, mutta myös sen peptidin mMesd (155-191) on annoksesta riippuvainen tavalla (kuvio 3).

HEK293-soluissa 24-kuoppalevyillä transfektoitiin väliaikaisesti LRP5: stä plasmidi (A), LRP6 plasmidi (B) tai vastaava ohjaus vektori, yhdessä TOPFlash lusiferaasin konstrukti ja β-galaktosidaasi-ilmentävällä vektorilla kuhunkin kuoppaan. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen soluja käsiteltiin Wnt3A CM (5%), Rspo1 (40 ng /ml), hiiren Mesd (mMesd) (2 uM), tai hiiren Mesd C-terminaalinen alue peptidin mMesd (155-191) on ilmoitettuina pitoisuuksina. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin sitten 24 tuntia myöhemmin normalisoinnin aktiivisuuden β-galaktosidaasi. Arvot ovat keskiarvoja kolmen määrityksen kanssa S.D. osoitetaan virhepalkeilla. * P 0,05, ** P 0,01 kontrolliin verrattuna soluihin ilman Mesd ja sen peptidin hoitoon.

Euroopan Mesd C-terminaalinen alue peptidi estää LRP6 fosforylaation ja OPG expressioninduced jonka Wnt3A ja Rspo1 in C2C12 solut

C2C12 solut ovat sitomattomia hiiren mesenkymaaliset progenitorisolujen jotka voidaan eriyttää osteoblasteiksi kun aktivoinnin Wnt /β-kateniinin signalointi [9], [25], [26]. Meillä työskentelee C2C12 soluja tutkia edelleen vaikutusta Mesd peptidin Wnt3A aiheuttamaa Wnt /β-kateniinin signalointi. LRP6 fosforylaatio on kriittinen Wnt /β-kateniinin signaloinnin aiheuttama Wnt-proteiinien [3], ja OPG on suora kohdegeenin Wnt /β-kateniinin signalointi osteoblastien [27], [28]. Olemme havainneet, että hiiren Mesd C-terminaalinen alue peptidin mMesd (155-191), kuten Mesd proteiini, kykeni vaimentamaan Wnt3A indusoima endogeeninen LRP6 fosforylaation ja OPG ilmentymisen C2C12-soluissa (kuvio 4A ja 4B).

(A) C2C12-solujen 6-kuoppaisilla levyillä käsiteltiin Wnt3A CM (5%) puuttuessa tai läsnä hiiren Mesd (mMesd) (0,5 uM) tai hiiren Mesd C-terminaalinen alue peptidin mMesd (155-191) on ilmoitettuina pitoisuuksina 6 tuntia. Fosforyloidun LRP6 analysoitiin. (B) C2C12-solujen 6-kuoppaisilla levyillä inkuboitiin Wnt3A CM (5%) läsnä ollessa tai puuttuessa mMesd (0,5 uM) tai mMesd (155-191) ilmoitettuina pitoisuuksina 48 tuntia. Tasot solun kokonais-OPG analysoitiin Western-blottauksella. (C) C2C12-solujen 6-kuoppaisilla levyillä inkuboitiin Rspo1 (20 ng /ml) ja /tai Wnt3A CM (2%) ilman tai läsnä mMesd (0,5 uM) tai mMesd (155-191) (2 uM ) 48 tuntia. Tasot solun kokonais-OPG analysoitiin Western-blottauksella. Kaikki näytteet koetettiin myös anti-aktiini-vasta-aine tarkistaa yhtä suuri kuormitus.

Rspo1 pystyy synergistisesti Wnt3A indusoimisessa OPG ilmentymisen C2C12-soluissa, vaikka Rspo1 itse on vähäisiä vaikutuksia [9] . Olemme havainneet, että hiiren Mesd C-terminaalinen alue peptidin mMesd (155-191), joka on samanlainen Mesd proteiinia, tukahdutettu OPG ilmentyminen indusoi Rspo1 plus Wnt3A on C2C12-soluissa (kuvio 4C).

Euroopan Mesd C-terminaalinen alue peptidi vaimentaa Wnt /β-kateniinin signalointi eturauhassyöpä PC-3-solujen ja rintasyövän Hs578T solujen

Kertyvät todisteet osoittavat, että Wnt koreseptorissa LRP6 on ratkaiseva rooli Wnt /β-kateniinin signalointi aktivoitumista ihmisen eturauhas- ja rintasyövän soluja ja on tärkeää kehittymistä ja etenemistä näiden kahden syöpää [8], [13], [14], [29] – [33]. Sen testaamiseksi, Mesd C-terminaalinen alue peptidi kykenee tukahduttamaan Wnt /β-kateniinin signalointi ihmisen eturauhas- ja rintasyövän soluja, valmistimme ihmisen Mesd C-terminaalinen alue peptidin hMesd (160-197), joka on vastaava hiiren Mesd C-terminaalinen alue peptidin mMesd (155-191). Olemme myös valmiita negatiivinen kontrolli peptidin sekvenssin perusteella on mMesd (155-164). Samanlainen mMesd (155-191), hMesd (160-197) näytetään estäviä vaikutuksia Wnt /β-kateniinin signaloinnin aiheuttama LRP6, Wnt3A, Rspo1, Wnt1 ja Wnt10b (kuvio S1 ja S2). Olemme havainneet, että hMesd (160-197), mutta ei kontrolli-peptidiä, matkia Mesd proteiinia ja merkittävästi tukahdutettu Wnt reportteri lusiferaasiaktiivisuuden eturauhassyövän PC3-soluissa ja rintasyövän Hs578T-soluja (kuvio 5A). Näin ollen, hMesd (160-197) suuresti vähentynyt tasot sytosolin vapaan β-kateniinin, LRP6 fosforylaatio ja Wnt /β-kateniinin signaloinnin tavoitteet Axin2 ja sykliini D1 ilmentyminen PC-3 ja Hs578T-soluja (kuvio 5B).

(A) PC-3 ja HT578T soluja 24-kuoppalevyillä transfektoitiin lyhytaikaisesti kanssa Super8XTOPFlash lusiferaasin konstrukti ja β-galaktosidaasi-ilmentävällä vektorilla kuhunkin kuoppaan. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen soluja käsiteltiin hiiren Mesd (mMesd), ihmisen Mesd peptidi hMesd (160-197) tai kontrollipeptidiä ilmoitettuina pitoisuuksina. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin sitten 24 tuntia myöhemmin normalisoinnin aktiivisuuden β-galaktosidaasi. Arvot ovat keskiarvoja kolmen määrityksen kanssa S.D. osoitetaan virhepalkeilla.

** P

0,01 kontrolliin verrattuna soluihin ilman Mesd tai Mesd peptidin hoitoon. (B) PC-3 ja Hs578T-soluja 6-kuoppaisilla levyillä käsiteltiin mMesd, hMesd (160-197) tai kontrollipeptidiä ilmoitettuina pitoisuuksina 24 tuntia. Tasot sytosolin vapaan β-kateniinin, ja solun kokonais-β-kateniinin, LRP6, Axin2, sykliini D1 ja fosforyloitu LRP6 analysoitiin sitten Western-blottauksella. Näytteet koetettiin myös anti-aktiini-vasta tarkistaa yhtä suuri kuormitus.

Wnt1 säätelee solujen erilaistumista ja lisääntymistä rintaepiteelin, ja Wnt1 ylössäätö maitorauhasen on osoitettu aiheuttavan maitorauhasen liikakasvu ja adenokarsinooma [34], [35]. Yliekspressio Wnt1 havaittiin useimmissa eturauhassyövän yksilöiden [36]. Edelleen karakterisoimiseksi inhiboiva vaikutus Mesd C-terminaalinen alue peptidin eturauhas- ja rintasyövän soluissa, me transfektoitiin ohimenevästi PC-3 ja Hs578T-soluja Wnt1 ja Wnt toimittaja plasmidit ja käsiteltiin Mesd proteiini tai ihmisen Mesd peptidi hMesd (160-197 ). Huomasimme, jälleen, että hMesd (160-197), mutta ei kontrolli-peptidiä, matkia Mesd proteiinin merkittävästi tukahduttaa Wnt toimittaja lusiferaasiaktiivisuutta indusoiman Wnt1 PC3 ja Hs578T-soluja (kuva 6A). Lisäksi hMesd (160-197) suuresti vähentynyt tasot sytosolin vapaan β-kateniinin, LRP6 fosforylaatio ja Wnt /β-kateniinin signaloinnin tavoitteet Axin2 ja sykliini D1 Wnt1-ilmentävät PC-3 ja Hs578T-soluja (kuvio 6B).

(A) PC-3 ja HT578T soluja 24-kuoppalevyillä transfektoitiin lyhytaikaisesti kanssa Wnt1 plasmidi yhdessä Super8XTOPFlash lusiferaasin konstrukti ja β-galaktosidaasi-ilmentävällä vektorilla kuhunkin kuoppaan. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen soluja käsiteltiin hiiren Mesd (mMesd), ihmisen Mesd peptidi hMesd (160-197) tai kontrollipeptidiä ilmoitettuina pitoisuuksina. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin sitten 24 tuntia myöhemmin normalisoinnin aktiivisuuden β-galaktosidaasi. Arvot ovat keskiarvoja kolmen määrityksen kanssa S.D. osoitetaan virhepalkeilla.

** P

0,01 kontrolliin verrattuna soluihin ilman Mesd tai Mesd peptidin hoitoon. (B) PC-3 ja Hs578T-soluja 6-kuoppalevyillä transfektoitiin lyhytaikaisesti Wnt1 plasmidi tai vastaava valvonta vektori. Sen jälkeen, kun on inkuboitu 24 tuntia, soluja käsiteltiin mMesd, hMesd (160-197) tai kontrollipeptidiä ilmoitettuina pitoisuuksina 24 tuntia. Tasot sytosolin vapaan β-kateniinin, ja solun kokonais-Wnt1, β-kateniinin, LRP6, Axin2, sykliini D1 ja fosforyloitu LRP6 analysoitiin sitten Western-blottauksella. Näytteet koetettiin myös anti-aktiini-vasta-aine tarkistaa yhtä suuri kuormitus.

Euroopan Mesd C-terminaalinen alue peptidi estää eturauhassyövän PC-3 ja rintasyövän Hs578T soluproliferaation

ottaa todettu, että Mesd C-terminaalinen alue peptidi estää Wnt /β-kateniinin signalointi PC-3 ja Hs578T-soluja, me tutki vaikutusta Mesd C-terminaalinen alue peptidin syövän solujen proliferaatiota. Kuten nähdään kuviossa 7, hMesd (160-197), mutta ei kontrolli-peptidiä, matkia Mesd proteiinia ja näytetään estävää vaikutusta PC-3 ja Hs578T-soluproliferaatiota ajan riippuvalla tavalla (kuvio 7A). Vahvistaa inhiboiva vaikutus Mesd peptidin syöpäsolujen lisääntymistä, teimme BrdU jälkeen, kun solut oli käsitelty peptideillä. Todettiin, että Mesd C-terminaalinen alue peptidin laski BrdU osaksi PC-3 ja Hs578T-soluja (kuvio 7B).

(A) Cancer solut 6-kuoppaisilla levyillä käsiteltiin hiiren Mesd (mMesd, 2 uM), ihmisen Mesd peptidi hMesd (160-197) (4 uM) tai kontrollipeptidiä (4 uM) RPMI-1640-väliaineessa, joka sisälsi 2% FBS: ää PC-3-solut tai DMEM, joka sisälsi 2% FBS: ää ja Hs578T ja 10 päivää . Media vaihdettiin joka toinen päivä, ja solut kerättiin ja laskettiin käyttäen trypaanisiniekskluusiolla määrityksessä. Arvot ovat keskiarvoja kolmen määrityksen kanssa keskihajonnat merkitty virhepalkeilla. **

P

0,01 verrattuna soluihin PBS: llä käsitellyt tai kontrollipeptidiä. (B) Cancer solujen T-25-pulloihin käsiteltiin ihmisen Mesd peptidin hMesd (160-197) (2 uM) tai kontrollipeptidiä (2 uM) viljelyalustassa, joka sisälsi 2% FBS: ää 7 päivää. Media vaihdettiin joka toinen päivä. Sitten solut kerättiin ja ympättiin 96-kuoppaisille kudosviljelylevyille tiheydellä 5000 solua /kuoppa hMesd (160-197) (2 uM) tai kontrollipeptidiä (2 uM) viljelyalustassa, joka sisälsi 10% FBS: ää 2 päivää. Solulisääntyminen mitattiin BrdU leviämisen ELISA. Kaikki arvot ovat keskimäärin kuusi määrityksen kanssa S.D. osoitetaan virhepalkeilla.

** P 0,01

verrattuna soluihin, käsiteltiin kontrollipeptidiä.

Mesd proteiini ja sen C-pään alueen peptidi voimistaa kemoterapia aine adriamysiini-indusoitu sytotoksisuus PC-3 ja Hs578T Chen et ai.