Krooninen sairaus

tiivistelmä

Pinus massoniana

kuori proanthocyanidins (PMBPs), joka on aktiivinen komponentti eristetään

Pinus massoniana

kuori, on raportoitu omaavan erilaisia ​​biokemiallisia ominaisuuksia. Tässä, tutkimme kasvaimen vastainen vaikutus PMBPs on munasarjasyöpä. Tulokset osoittivat, että PMBPs vähensi kasvua munasarjasyöpäsoluja ja indusoi annoksesta riippuvaista apoptoosia. Taustalla olevien mekanismien mukana oli selvitetty sisällyttää mitokondrion kalvon potentiaalia, down-regulation of anti-apoptoottisen proteiinin Bcl-2 ja kaspaasi 3/9, viittaa siihen, että PMBPs laukaista apoptoosin aktivoitumisen kautta mitokondrioiden liittyvien apoptoottisen reitin. Lisäksi haavan paranemista ja siirtokuoppaan kammion määritykset paljastivat, että PMBPs voivat tukahduttaa muuttoliike ja invaasion munasarjasyöpäsoluja. PMBPs dramaattisesti esti MMP-9 toimintaa ja ilmaisua, esti aktiivisuus NFKB ja aktivoinnista ERK1 /2 ja p38 MAPK. Tulosten perusteella näyttää, että PMBPs on mahdollista kehittää anti-kasvain lääke munasarjasyövän hoitoon ja /tai tautien hallinta.

Citation: Liu J, Bai J, Jiang G, Li X, Wang J, Wu D, et al. (2015) Anti-kasvain vaikutus

Pinus massoniana

Bark Proanthocyanidins on munasarjasyöpä kautta induktio solukuoleman ja esto Cell Migration. PLoS ONE 10 (11): e0142157. doi: 10,1371 /journal.pone.0142157

Editor: Yi-Hsien Hsieh, Institute of Biochemistry and Biotechnology, Taiwan

vastaanotettu: May 1, 2015 Hyväksytty: 19 lokakuu 2015; Julkaistu: 5. marraskuuta 2015

Copyright: © 2015 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tämä työ rahoittaneet National Natural Science Foundation of China (No.81302282) (URL: https://www.nsfc.gov.cn/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

munasarjasyöpä jää viidenneksi yleisin syöpätyyppi naisilla ja johtava kuolinsyy gynecologic pahanlaatuisia kasvaimia [1] kantavassa ensilinjan munasarjasyövän hoitoon on yleensä perinteinen leikkaus yhdistettynä platina-paklitakselin kemoterapian [2]. Huolimatta hyvistä ensimmäisen vastauksen useimmilla munasarjasyöpää sairastavilla potilailla, 5 vuoden pysyvyys on edelleen alhainen johtuen relapses- tavallista jälkeen ensilinjan hoitona [3]. On ollut muutamia kehitystä munasarjasyövän hoidossa, koska standardointi sisplatiinin ja paklitakselin huumeita viimeisten 20 vuoden aikana [4]. On kiireesti kehittää uusia tehokkaita lääkkeitä munasarjasyövän hoitoon.

Tällä hetkellä noin luonnollisia bioaktiivisia phytochemical käytetään estämään leviämisen tai etäpesäke syöpäsolujen [5]. Tällaiset phytochemical ovat myrkyttömiä ja vailla sivuvaikutuksia, joten ne ovat hyviä vaihtoehtoja ja /tai täydentävät tavanomaisen solunsalpaajahoidosta [5]. Mänty kuori uute on aiemmin pidetty hankala jäte tuote puuteollisuudessa, mutta nyt tunnustettu runsaasti luonnollisia proanthocyanidins mahdollisten lääkinnällisiä ominaisuuksia [6]. On osoitettu, että proantosyanidiinit voidaan käyttää estämään kasvaimen johtuen niiden kyvystä moduloida aktiivisuutta useiden kohde-karsinogeneesissä [7]. Siksi antituumorivaikutuksen Männynkuoren uute on saanut eniten huomiota viime aikoina.

Pinus massoniana

Lamb on Pinaceae perhe on kotoisin etelään ja lounaaseen Kiinassa. Sen kuori on käytetty perinteisen kiinalaisen lääketieteen hoitoon tulehduksen, nivel- reumaa ja syöpä [8]. Pääasiallinen komponentti

Pinus massoniana

kuori on myös proantosyanidipitoisuuksilla. Sen anti-kasvain aktiivisuus, on osoitettu ihmisen hepatoomalinja Hep G2-soluja, kohdunkaulan syöpä HeLa-soluissa ja hiiren sarkooman S180-soluja [9,10,11]. Kuitenkin vaikutukset

Pinus massoniana

kuori proanthocyanidins (PMBPs) on munasarjasyöpä ja mekanismeista prosessin vielä rajattu.

Tässä tutkimuksessa arvioimme onko proantosyanidiineja alkaen

Pinus massoniana

kuori voisi käyttää anti-kasvain vaikutuksia munasarjasyöpäsoluja ja tutki tarkemmin yksityiskohtaisen mekanismeista tätä prosessia. Meidän data voi tarjota perustan tulevan kehityksen PMBPs tehokkaana lääkkeenä munasarjasyövän hoitoon.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit, reagenssit ja kemikaalit

Vasta-aineita kaspaasi -3, kaspaasi-9, Bcl-2 hankittiin Cell Signaling Technology (Denver, MA). Vasta-aineet MMP-9, NFKB, IκBα ja β-aktiini saatiin Protein Tech Group, Inc. (Chicago, USA). Vasta-aineita fosforyloidun IκBα, ERK1 /2, p38 ja JNK saatiin Sangon Biotech, Kiina. Tehostetun kemiluminesenssin (ECL) pakki hankittiin Amersham Life Science, Inc. (Yhdysvallat). Anneksiini V-konjugoidulla FITC apoptoosin havaitseminen pakki ja JC-1 mitokondrion kalvon potentiaalia havaitseminen pakki ostettiin NanJing KeyGen Biotech Co., Ltd (Nanjing, Kiina). Siirtoaltaat hankittiin BD Biosciences (San Jose, USA). MTT (3- (4,5-dimetyyli-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi) ja DAPI (2- (4-amidinofenyyli) -6-indolecarbamidine dihydrokloridi) saatiin Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). PMBPs jauhe ostettiin Shaanxi Sciphar Hi-tech Industry Co., Ltd (Shanxi, Kiina). Se sisälsi noin 95% proanthocyanidins, ja stabiili vähintään kaksi vuotta 4 ° C: ssa.

Solulinjat ja soluviljelmä

Munasarjasyöpä A2780 saatiin American Type Culture Collection (ATCC ) ja kasvatettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää (molemmat ostettu Gibco BRL, Grand Island, NY, USA). OV2008 oli ystävällisesti professori Shiying Cui (Dalian Medical University, Kiina) ja kasvatettiin RPMI-1640-alustassa (Invitrogen, Burlington, ON, Kanada) täydennettynä 10% FBS: ää. Normaali munasarjojen epiteelin solulinja IOSE80 saatiin Canadian munasarjojen Tissue Bank ja kasvatettiin elatusaineessa, 199 (Invitrogen) ja MCDB 105 (Sigma), jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Kun solut olivat 80% konfluentteja, ne kerättiin 0,25% trypsinaation. Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla PMBPs kanssa sopivassa valvontaa.

solunelinkykyisyysmääritys

vaikutus PMBPs elinkelpoisuudesta solujen havaittiin MTT-määrityksellä. Solut (1 x 10

4 /kuoppa) ympättiin 96-kuoppalevylle ja inkuboitiin 24 tuntia. Sitten 200 ui alustaa, joka sisälsi 0, 10, 25, 50, 75, 100 ja 120 ug /ml PMBPs, lisättiin kuhunkin kuoppaan. Jokainen pitoisuus PMBPs oli kuusinkertaistui. Sen jälkeen, kun 24 tunnin ja 48 tunnin PMBPs hoito, 20 ui MTT: tä (5 mg /ml PBS: ssä) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 4 tuntia. MTT-liuos poistettiin ja formatsaanikiteet liuotettiin 150 ui DMSO: ta. Liuoksen absorbanssi mitattiin käyttäen Multiskan Ascent levylukijalla 540 nm: n aallonpituudella.

DAPI-värjäyksellä määrityksessä

Noin 4 x 10

4 solua /kuoppa munasarjasyövän solut maljattiin 6-kuoppalevylle ja sen jälkeen käsiteltiin PMBE 0, 25, 50 ja 100 ug /ml 24 tuntia. Solut jokaiseen kuopat värjättiin DAPI ennen vahvistamista 3,7% formaldehydiä. Sitten solut pestiin PBS: llä ja analysoitiin fluoresenssimikroskopialla.

Cell apoptoosin virtaussytometrialla

hoidon jälkeen 0, 10, 25, 35 ja 50 ug /ml PMBPs 24 tuntia, munasarjasyöpä solut kerättiin ja pestiin PBS: llä kolme kertaa, inkuboitiin sitten anneksiini V-FITC: llä ja PI: 10 min pimeässä. Solut havaitaan FACS /Calibur virtaussytometrillä (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA).

määritys mitokondrion kalvon potentiaalia

muutokset mitokondrion kalvon potentiaalia munasarjasyöpäsoluja havaittiin virtaussytometrillä käyttäen JC-1 havaitseminen kit. Hoidon jälkeen 0, 25, 35, 50 ug /ml PMBPs 24 tuntia, solut kerättiin ja niitä inkuboitiin JC-1 väriaineen 15 min 37 ° C: ssa mukaan valmistajan protokollaa. Solut havaitaan FACS /Calibur virtaussytometrillä.

Haavan paranemista määrityksessä

A2780 ja OV2008-soluja ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja kasvatettiin luoda yksisolukerros. Yksisolukerros oli naarmuuntunut suoraviivaisesti kanssa P200 ul pipetin kärki. Levyt pestiin PBS: llä poistamiseksi irrottaa soluja ja inkuboitiin sitten täydellistä kasvualustaa, joka sisälsi 0, 5, 10 ja 25 ug /ml PMBPs liuosta 24 tuntia. Solumigraation havaittiin alle faasikontrastimikroskoopissa 100 x suurennus 0 ja 24 tuntia induktion jälkeen vahingon. Siirtynyt soluista Hiertyneelle alueelle kunkin kuuden satunnainen kenttien mitattiin ja kvantitoitiin käyttäen tietokoneavusteista mikroskoopilla.

TranswellTM kammion määritys

Solun muuttoliikettä ja invaasiota kvantitoitiin Transvvell- kammio määrityksessä. Munasarjasyöpä soluja käsiteltiin 0, 5, 10 ja 25 ug /ml PMBPs 24 tuntia ja kerättiin. 1 x 10

5 solua seerumivapaassa DMEM lisättiin jokaiseen ylempään kammioon ja DMEM 10% FBS lisättiin alempaan kammioon kuin kemoattraktantti. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen 37 ° C: ssa, solut jäljellä yläpinnalla kalvon poistettiin ja solut, jotka vaelsivat alapuolelle kalvon värjättiin 0,1% kristallivioletilla 10 minuutin ajan. Siirrettyjä soluja alapuolella kalvon laskettiin mikroskoopilla 100-kertaisella suurennuksella. Kuusi satunnainen kentät kunkin transwell kalvo laskettiin ja keskiarvo.

gelatiinitsymografialla

MMP-9 havaittiin gelatiinitsymografialla. Kasvainsoluja käsiteltiin 0, 5, 10, 25 ug /ml PMBPs 24 tuntia. Sitten solujen väliaine kerättiin ja sentrifugoitiin solujätteen poistamiseksi. Yhtä suuri tilavuus kirkastettu väliaine ajettiin elektroforeesilla 10% SDS-PAGE-geeliä, joka sisälsi 0,1% (w /v) gelatiinia 4 ° C: ssa. Geeli pestiin pesupuskurilla (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl ja 2,5% Triton X-100), ja sen jälkeen inkuboitiin aktivointi puskurissa (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl

2, 0,02% NaN

3 ja 1 uM ZnCl

2) 37 ° C: ssa yön yli. Sitten geeli värjättiin 0,25% (w /v) Coomassie brilliant blue 45% (v /v) metanolia ja 1% (v /v) etikkahappoa ja väri poistettiin 10%: isella isopropanolilla /10% etikkahappo (v /v ) ratkaisu. MMP-9 bändejä havaittiin 92 kDa: n.

valmistaminen kokosolulysaattia ja ydin- osa

kokosolulysaattia, solut homogenisoitiin RIPA-puskurissa (Beyotime, Jiangsu, Kiina). Solulysaatit sentrifugoitiin 12000 rpm 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja supernatantti otettiin talteen. Tumafraktiota uutettiin modifioidulla menetelmällä (Yeh, 2012). Lyhyesti, soluja käsiteltiin puskurilla A (10 mM HEPES, 10 mM KC1, 0,1 mM EDTA, 1,5 mM MgCI2, 0,2% NP-40, 1 mM DTT: tä, ja 0,5 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia) ja tumapelletit kerättiin sentrifugoimalla 3000 rpm 30 s ajan 4 ° C: ssa. Tumafraktios- uutettiin sitten puskuri B (20 mM HEPES, 25% glyserolia, 1,5 mM MgCl

2, 0,1 mM EDTA, 420 mM NaCl, 1 mM DTT ja 0,5 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia).

Western blot -määritys

kokosoluliuotteista tai tumauutteita erotettiin 10% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin sitten nitroselluloosakalvolle puolikuivalla laite 1 tunti. Membraani blokattiin 5% rasvatonta maitoa 1 h ja sitten inkuboitiin tiettyjä primaarisen vasta-aineen liuosta yön yli 4 ° C: ssa. Inkuboinnin jälkeen sopivalla anti-lajien sekundaarisen vasta-aineen kanssa 1 h, proteiininauhat visualisoitiin ECL kit.

Tilastollinen analyysi

Data analysoitiin tilastollisesti käyttämällä Studentin t-testiä ja esitetään keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. SPSS 15.0 ohjelmistoa käytettiin analyyseihin. Arvo P 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Vaikutukset PMBPs elinkelpoisuudesta munasarjasyöpäsoluja

Vaikutukset PMBPs elinkelpoisuudesta munasarjojen syöpäsoluja ja normaaleja munasarjan soluja ensinnäkin havaittiin MTT: llä. Munasarjasyöpäsoluja A2780 ja OV2008, sekä normaali munasarjojen solut IOSE80 käsiteltiin eri pitoisuuksilla PMBPs (0, 10, 25, 50, 75, 100, 120 ug /ml), 24 h tai 48 h. Munasarjasyöpäsoluja seuraavat PMBPs hoito osoitti dramaattinen väheneminen solujen elinkelpoisuuden 25 ug /ml annosriippuvaisesti (

P

0,01), kun taas sama pitoisuudet eivät merkittävästi vaikuttaneet elinkelpoisuutta normaalin munasarjan soluissa IOSE80 (kuvio 1A). IC50-arvo PMBPs oli 48 ± 2,4 ug /ml A2780 ja 67 ± 2,7 ug /ml OV2008 48 h (kuvio 1A).

(A) Munasarjojen syöpäsolujen A2780 ja OV2008, ja normaalin munasarjan solut IOSE80 käsiteltiin PMBPs (0, 10, 25, 50, 75, 100, 120 ug /ml), 24 h tai 48 h. Solujen elinkelpoisuutta eri pitoisuuksia PMBPs havaittiin MTT-määrityksellä ja ilmaistiin suhteessa, että ei-käsiteltyjen solujen. Kokeet toistettiin kolme kertaa. (B) Munasarjojen syöpäsolujen A2780 ja OV2008, ja normaalin munasarjan solut IOSE80 käsiteltiin PMBPs (0, 25, 75, 100 ug /ml) 24 h, ja solut valokuvattiin käänteisen kontrastin mikroskoopilla (suurennus, 40 x).

lisäksi morfologisia muutoksia munasarjasyöpä soluja tutkittiin faasikontrastimikroskoopilla. A2780 ja OV2008 soluja viljeltiin ilman PMBPs näkyy ominainen tavanomainen muoto, jossa 70% konfluenssiin 24 tunnin kuluttua. Kuitenkin solujen konfluenssiin väheni dramaattisesti selviä morfologisia muutoksia upon PMBPs hoitoa. Solut alkoi kutistua, menettäneet normaali muoto, tuli pyöreä ja lopulta irrottaa viljelymaljasta (kuvio 1 B). Sitä vastoin emme tarkkailla tällaisia ​​morfologisia muutoksia normaalin munasarjan soluissa, IOSE80, seuraavat PMBPs jälkeen (kuvio 1 B). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että PMBPs selektiivisesti estävät elinkelpoisuutta munasarjasyöpäsoluja vähemmän vaikutusta pahanlaatuisten solujen.

PMBPs aiheuttaa munasarjasyöpäsoluja ”apoptoosin

Kun arvioidaan antituumorivaikutuksia ja PMBPs on A2780 ja OV2008-soluja, jotka liittyvät apoptoosin, munasarjasyöpä solut värjättiin DAPI ja tarkasteltiin fluoresenssimikroskoopilla (Kuva 2A). Hoidon jälkeen eri pitoisuuksia PMBPs 24 tuntia, ydin- kromatiinin kondensaatio ja hajanaista pistemäinen sininen ydin- fluoresenssia havaittiin munasarjasyövän solujen annoksesta riippuvalla tavalla, joka on samanlainen kuin morfologisia muutoksia apoptoottisten solujen, mutta ohjaus soluilla normaaleissa ja ehjä ytimiä. Se viittaa siihen, että PMBPs voi aiheuttaa apoptoosia munasarjasyöpäsoluja.

(A) A2780 ja OV2008-soluja käsiteltiin PMBPs (0, 25, 50, 100 ug /ml) 24 tuntia. Morfologiset muutokset ydinten tutkittiin fluoresenssimikroskopialla käyttämällä DAPI värjäystä. Nuolet osoittavat ydin- tiivistyminen ja apoptoottisia kappaleita (suurennus, 100 x). (B) A2780 ja OV2008-soluja käsiteltiin PMBPs (0, 10, 25, 35, 50 ug /ml) 24 tuntia. Virtaussytometria levitettiin analysoida anneksiini V-FITC /PI kaksinkertainen värjättyä A2780 soluissa. Alhainen oikealle (LR) neljänneksessä histogrammien osoittaa alussa apoptoottisia soluja, ja oikeassa yläkulmassa (UR) neljänneksessä osoittaa myöhään apoptoottisten ja nekroottisten solujen. (C) hoito A2780 ja OV2008 solut PMBPs johti dramaattiseen kasvuun prosenttiosuuden apoptoottisten ja nekroottisten solujen (mukaan lukien varhainen apoptoosin, myöhään apoptoosin ja nekroosin). Kokeet toistettiin kolme kertaa.

** P 0

.

01

verrattuna kontrolliryhmään.

edelleen määrällisesti apoptoosin aiheuttaman PMBPs, A2780 ja OV2008 solut leimattiin anneksiini V-FITC /PI: n ja analysoitiin virtaussytometrialla. Oikeanpuoleiseen alanurkkaan (LR) osoittaa prosenttiosuuden varhaisen apoptoottisten solujen (anneksiini V

+ ja PI

-) ja oikeassa yläkulmassa neljänneksessä (UR), prosenttiosuus myöhään apoptoottisten ja nekroottisten solujen (anneksiini V

+ ja PI

+). Tulokset osoittivat, että PMBPs laukaista apoptoosin munasarjasyöpäsoluja, aloittaen 25 ug /ml, annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 2B). Prosenttiosuus koko apoptoottisten ja nekroottisten solujen A2780-soluissa oli 1,17% kontrollisoluissa (LR: 0,2% ja UR: 0,97%), 2,46% soluissa käsitelty 10 ug /ml PMBPs (LR: 2,42% ja UR: 0,04% ), 17,63% soluissa käsiteltiin 25 ug /ml PMBPs (LR: 16,12% ja UR: 1,51%), 49.24% soluissa käsitelty 35 ug /ml PMBPs (LR: 41,87% ja UR: 7.37%) ja 77,23% käsitellyissä soluissa 50 ug /ml PMBPs (LR: 71,44% ja UR: 5,79%) (kuvio 2B). Samoin kuin OV2008 solut olivat 5,78% kontrollisoluissa (LR: 0,83% ja UR: 4,95%), 6,46% soluissa käsitelty 10 ug /ml PMBPs (LR: 1,38% ja UR: 5,08%), 21.45% vuonna soluja käsiteltiin 25 ug /ml PMBPs (LR: 13,88% ja UR: 7,57%), 59.94% soluissa käsitelty 35 ug /ml PMBPs (LR: 24.79% ja UR: 35.15%) ja 55,31% käsitellyissä soluissa 50 ug /ml PMBPs (LR: 10,21% ja UR: 45,1%) (kuvio 2B). Tuloksemme osoittavat, että PMBPs voisi merkittävästi aiheuttaa sekä varhaisen ja myöhäisen apoptoosin munasarjasyöpäsoluja (

p

0,01) (kuvio 2C).

PMBPs indusoi mitokondrion kalvon mahdollisen tappion

on tunnettua, että mitokondrioiden vauriot apoptoosin aikana muuttaa mitokondrion kalvon potentiaalia [12]. Tutkia vaikutuksia PMBPs mitokondrion kalvon potentiaalia, soluja käsiteltiin PMBPs havaittiin JC-1 väriaine. Kuten kuviossa 3, keskimääräinen prosenttiosuus vihreän fluoresenssin-positiivisten A2780-soluissa oli 2,41% ilman hoitoa, 20,63% 25 mikrog /ml, 43.77% 35 mikrog /ml ja 66,6%: 50 ug /ml PMBPs hoitoa. Samoin kuin OV2008-soluissa oli 0% ilman hoitoa, 36,28% 25 ug /ml, 43,81% 35 ug /ml ja 78,79%: 50 ug /ml (kuvio 3A). Oli merkittävää annoksesta riippuvaa vihreän fluoresenssin lisäys-positiivisia soluja (kuvio 3B) (

p 0

.

01

), mikä viittaa mitokondrion kalvon mahdollisia korreloi yhä annoksen PMBPs hoitoon. Näin ollen apoptoosin munasarjasyövän solujen PMBPs liittyy vahinkoa mitokondrion kalvon.

(A) A2780 ja OV2008-soluja käsiteltiin PMBPs (0, 25, 35, 50 ug /ml) 24 tuntia ja sitten talteen, värjättiin JC-1 väriaine, ja lopuksi analysoitiin virtaussytometrialla. (B) PMBPs hoito johti merkittävään kasvuun vihreän fluoresenssin positiivinen (GFP) soluja, jotka osoitti mitokondrion kalvon potentiaalia. Kokeet toistettiin kolme kertaa.

** P 0

.

01

verrattuna kontrolliryhmään.

PMBPs upregulate apoptoosiin liittyviä proteiineja ja tukahduttaa Bcl-2

Koska PMBPs voisi aiheuttaa apoptoosin munasarjasyöpäsoluja, me tutkittava tarkemmin joitakin apoptoosin liittyvät proteiinien Western blot. Taso β-Actin toimi sisäisen valvonnan. Olemme havainneet, että ilmentymisen anti-apoptoottisen proteiinin Bcl-2: munasarjasyöpäsoluja käsiteltiin PMBPs merkittävästi vähentynyt annoksesta riippuvalla tavalla (

p 0

.

01

) (kuvio 4A , 4B ja 4C). Kaspaasi jäsenet ovat ratkaisevia välittäjiä apoptoosin [13]. Ilmaisut kaspaasin 3 ja kaspaasi-9 arvioitiin. Lohkaista-kaspaasi-3 ja pilkottiin kaspaasi-9 ekspressiotasoja dramaattisesti ylösajettu seuraavat PMBPs hoidon munasarjasyöpäsoluja (

p 0

.

01

) (kuvio 4A, 4B, 4D ja 4E). Nämä tulokset viittaavat siihen, että PMBPs aktivoida kaspaasiriippuvaisen apoptoosireittiä.

(A, B) toinen A2780 ja OV2008-soluja käsiteltiin PMBPs (0, 15, 25, 35, 50 ug /ml) 24 tuntia ja sitten korjattu. Solulysaatit valmistettiin ja alistettiin Western blot-analyysi. Proteiinin tasot Bcl-2, pilkottiin kaspaasi-3 ja pilkottiin kaspaasi-9 mitattiin Western blot. (C, D, E) histogrammit esittävät tarkoittaa ekspressiotasot Bcl-2, pilkottiin kaspaasi-3 ja pilkottiin kaspaasi-9 (± SD), vastaavasti, kolmesta itsenäisestä kokeesta. Bcl-2, halkaistut-kaspaasi-3 ja halkaistut-kaspaasi-9 tasoa ilmaistiin suhteessa latauskontrollina, β-Actin. Kaikki kokeet toistettiin kolmesti.

** P 0

.

01

verrattuna kontrolliryhmään.

PMBPs estävät siirtymisen ja hyökkäys munasarjasyövän solut

Solun maahanmuutto- ja hyökkäys ovat tunnusmerkkejä syöpäsoluja. Sen tutkimiseksi, onko PMBPs alentunut muuttoliike ja invaasion munasarjasyöpäsoluja, me suoritetaan haavan paranemiseen määritys eri, ei apoptoottiset (5 ug /ml ja 10 ug /ml), pitoisuudet PMBPs 24 tuntia. Olemme havainneet, että PMBPs annosriippuvaisesti vähentynyt liikkeen A2780 ja OV2008-soluissa (kuvio 5). Haavan sulkeminen hinnat PMBPs käsiteltyjen solujen olivat pienempiä kuin ei-käsiteltyjen solujen (

P 0

.

01

) (kuvio 5B ja 5C). Lisäksi olemme tutkineet invasiivisuus näiden solujen käyttäen 24-kuoppaista transwell kammioon, kun läsnä on eri pitoisuuksia PMBPs 24 tuntia. PMBPs merkittävästi esti muuttoliike ja hyökkäyksen mahdollisuudet munasarjasyöpäsoluja annoksesta riippuvaisella tavalla (

P 0

.

01

) (Kuva 6). Hoito 5-25 ug /ml PMBPs esti muuttoliikettä ja hyökkäystä 27% -66%, vastaavasti, A2780 soluissa, ja 11% -40% vuonna OV2008 soluissa kontrolleihin verrattuna (kuvio 6B ja 6C). Molemmat haavan paranemista määritys ja siirtokuoppaan kammion määrityksen mukaan PMBPs hillitsevän muuttoliike ja invaasion munasarjasyöpäsoluja.

Yksisolukerroksiset A2780 ja OV2008 solut raaputettiin pipetin kärki ja käsiteltiin PMBPs (0, 5, 10 , 25 ug /ml) 24 tuntia. (A) edustaja kuvia vaeltavien solujen mikroskoopilla 100 x suurennus kenttä, ennen ja jälkeen loukkaantumisen. (B, C) migraatio A2780 ja OV2008 solut kvantifioitiin mittaamalla haavan alueilla ennen ja jälkeen loukkaantumisen. Kokeet toistettiin kolme kertaa. **

P 0

.

01

ja ***

P 0

.

001

verrattuna kontrolliryhmään.

A2780 ja OV2008-soluja käsiteltiin PMBPs (0, 5, 10, 25 ug /ml) 24 tuntia. (A) Kuvat ovat soluja, jotka vaelsivat ja tunkeutuu päälle alapintaan transwell kalvon 100 x suurennoksella mikroskoopilla. (B, C) määrä soluja jokaisen kentän laskettiin ja keskiarvo. Tunkeutuneet solut ilmaistu suhteessa kuin kontrolliryhmään. Kokeet toistettiin kolme kertaa. **

P 0

.

01

ja ***

P 0

.

001

verrattuna kontrolliryhmään.

MMP-9 toimintaa ja ilmaisun PMBPs

Koska vaikutuksia PMBPs on munasarjasyövän solujen vaeltamiseen ja invaasiota, me tutki tarkemmin mekanismeja tässä prosessissa. Koska MMP-9: llä on tärkeä rooli syövän invaasio, seuraavan kerran havaitaan MMP-9: n entsyymiaktiivisuuden ja ilmaisun jälkeen PMBPs hoidon. MMP-9: n aktiivisuutta elatusaine tutkittiin gelatiinitsymografialla, ja MMP-9: n ilmentyminen tutkittiin Western blot. PMBPs annosriippuvaisesti tukahdutetaan MMP-9 aktiivisuuden (kuvio 7A) ja vähensi MMP-9 ekspressiotaso (

P 0

.

05

) (kuvio 7B). Siten estävää aktiivisuutta PMBPs on invasiivisuus munasarjasyöpä voi olla, ainakin osittain, koska tukahduttaminen MMP-9 -aktiivisuuden.

soluja käsiteltiin PMBPs (0, 5, 10, 25 ug /ml) 24 tuntia. (A) MMP-9 solusupernatantti eri pitoisuuksilla PMBPs tutkittiin gelatiinitsymografialla määrityksessä. Valkoiset nauhat edustavat MMP-9 välittämä liivate ruoansulatusta. (B) proteiini MMP-9 A2780-soluissa eri pitoisuuksina PMBPs arvioitiin Western blot. Histogrammi osoittaa keskimääräinen taso MMP-9 (± SD) kolmesta itsenäisestä kokeesta. MMP-9-proteiinin taso ilmaistu suhteessa latauskontrollina, β-aktiini ja standardoitu ei-hoidettuun kontrolliryhmään. *

P 0

.

05

ja **

P 0

.

01

verrattuna kontrolliryhmään.

PMBPs heikentää NFKB tumaansiirtymiseen ja MAPK-reitin aktivaatio

Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että estävä NFKB toiminta voisi estää syöpäsolujen invaasiota [14,15,16]. Me siis tutkittu vaikutus PMBPs on NFKB aktiivisuuden munasarjasyöpäsoluja. Hoito A2780 solujen PMBPs vähensi merkittävästi tumaansiirtymiseen NFKB ja fosforylaation IκBα (

P 0

.

05

) (kuvio 8A ja 8C). Nämä kysytään että PMBPs voi ainakin osittain estää munasarjojen syöpäsoluinvaasiota estämällä NFKB aktiivisuutta. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että aktivointi mitgen-activatied proteiinikinaasien (MAPK) sisältäen ERK1 /2, p38MAPK, JNK ovat mukana kasvaimen maahanmuutto- ja invaasio, ja että nämä MAPK toimivat ylävirtaan NFKB [17,18,19]. Siksi aktivoinnin tilan ERK1 /2, p38MAPK ja JNK tutkittiin A2780 soluissa, joita käsiteltiin eri pitoisuuksilla PMBPs. PMBPs esti merkitsevästi ERK1 /2 ja p38MAPK aktivointi (

P 0

.

05

), mutta ei JNK (

P 0

.

05

) (kuvio 8B ja 8D). Siten tukahduttaminen ERK1 /2 ja p38MAPK aktivaatio PMBPs voi edistää heikentynyt hyökkäyksen mahdollisuudet munasarjasyöpäsoluja.

(A, B) Soluja käsiteltiin PMBPs (0, 5, 10, 25 ug /ml) 24 tuntia. Solulysaatit valmistettiin ja alistettiin Western blot-analyysi. Proteiini taso ydin- p65, p-IκBα, IκBα, p-ERK, p-p38 ja p-JNK mitattiin. (C, D) histogrammit esittävät keskiarvo (± SD) taso ydin- p65, p-IκBα, IκBα, p-ERK, p-p38 ja p-JNK kolmesta itsenäisestä kokeesta. Ydin- p65, p-IκBα, IκBα, p-ERK, p-p38 ja p-JNK ekspressiotasot ilmaistiin suhteessa latauskontrollina β-Actin ja standardoitu ei-hoidettuun kontrolliryhmään. *

P 0

.

05

ja **

P 0

.

01

verrattuna kontrolliryhmään.

keskustelu

Munasarjasyöpä pysyy johtavana kuolinsyynä gynekologiset syövät lähinnä siksi myöhäisessä vaiheessa diagnoosin ja rajoitettu tehokkaita hoitoja, varsinkin uusiutuva sairaus [20]. Luonnontuotteet peräisin kasveista ovat lupaavia terapeuttisia aineita syöpähoitojen [21]. Siksi selvitimme mahdollisen käyttökelpoisuuden proantosyanidiinien alkaen

Pinus massoniana

kuoren munasarjasyöpäsoluja pyrkimys löytää uusia tehokkaita lääkkeitä varten munasarjasyövän hoitoon. Tuloksemme tässä osoittivat, että PMBPs vähensi lisääntymistä, indusoi apoptoosin ja tukahdutti kulkeutumista munasarjasyöpäsoluja.

Pinus massoniana

kuori ote on raportoitu estävän kasvua useiden syöpiä. Se selektiivisesti esti leviämisen ihmisen hepatoma BEL-7402 ja HepG2-soluissa, mutta hieman edisti kasvua ihmisen normaali maksan soluihin L-02 in vitro [8,9,22]. Se tukahdutti myös kasvua ihmisen kohdunkaulan syövän Hela-soluja ja indusoi apoptoosia. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että proantosyanidiineja uutettu

Pinus massoniana Lamb

kuori merkittävästi inhiboivat munasarjasyöpäsoluja mutta ei vaikuta normaaliin munasarjan soluissa. Havaitsimme myös, että syöpäsolujen kutistui ja irrotettiin viljelymaljoihin jälkeen PMBPs hoidon, mikä viittaa siihen, että PMBPs selektiivisesti estää kasvun munasarjasyöpä soluja ja aiheuttavat solujen kuoleman.

Tutkimme lisäksi anti-kasvain mekanismeja palveluksessa PMBPs on munasarjasyöpäsoluja. Apoptoosi on erittäin tärkeä rooli poistamalla mutatoitunut tai hyper kasvavia kasvainsoluja [23]. On olemassa useita erilaisia ​​luonnollisia tuotteita, jotka on raportoitu estää syöpäsolujen kasvua kautta apoptoosin [24]. Jotkut tutkimukset ovat osoittaneet, että

Pinus massoniana

riuute indusoida apoptoosia ihmisen kohdunkaulan syövän Hela-solut, ihmisen hepatooma HepG2-soluissa ja hiiren sarkooman S180-soluja annoksesta riippuvaisella tavalla [9,10,11]. Esillä olevassa tutkimuksessa, DAPI-värjäys data paljasti, että solut, joita käsiteltiin PMBPs näytetään erityinen apoptoottisten morfologisia muutoksia. Virtaussytometria tiedot osoittivat lisäksi, että osuus apoptoottisten solujen nousseet merkittävästi PMBPs hoitoa. Kaikki nämä tulokset osoittavat, että PMBPs indusoi apoptoosia munasarjasyöpäsoluja.

Apoptoosin induktio liittyy tukahduttaminen anti-apoptoottisten proteiinien ja säätely ylöspäin pro-apoptoottisten proteiinien [25]. On raportoitu, että Bcl-2-proteiinin on ensiarvoisen säätelyssä mitokondrioissa liittyvä apoptoottista reitin [26]. Down-regulation of Bcl-2 johtaa mitokondrion kalvon potentiaalia ja vapauttamaan sytokromi

c myynnissä maassa mitokondrioita sytosoliin aktivoimaan kaspaasi-9 [27]. Katkaistun kaspaasi-9 edelleen aktivoi kaspaasi-3, joka on yksi tärkeimmistä entsyymien luontaisten apoptoottisen reitin, aiheuttaa myöhemmin apoptoottisia tapahtumia [28]. Tässä meidän tulokset osoittivat, että PMBPs indusoi merkittävän mitokondrion kalvon potentiaalia. Lisäksi havaitsimme vähentäminen Bcl-2: n ilmentymisen mukana kohonneita pilkottiin kaspaasi-9 ja pilkottiin kaspaasi-3: n munasarjasyöpäsoluja käsiteltiin PMBPs. Voitaisiin harkita, että PMBPs voivat aiheuttaa apoptoosin kautta mitokondriot liittyvän apoptoottisen reitin.

Huomasimme, että PMBPs ehkäistä tehokkaasti munasarjasyöpä muuttoliikettä ja invaasiota. Yksi tärkeä tekijä, joka helpottaa metastaattinen syöpäsolujen leviämistä on proteolyyttisiä entsyymejä, jotka hajottavat ympäröivän soluväliaineen, ja siten helpottaa solumigraatio tyvikalvon läpi. Matrix (MMP) ovat mukana matriisissa remodeling [29]. Osalta munasarjasyöpä, ilmentymisen MMP-9 on yhdistetty invasiivisen alatyyppejä [30]. Työmme osoittaa, että PMBPs voisivat alas-säädellä MMP-9 ilmaisun ja toimintaa. Siksi PMBPs voi tukahduttaa MMP-9 toimintaa heikentävän muuttoliikettä ja hyökkäys valmiuksia munasarjasyöpäsoluja.

aktivointi NFKB on ratkaisevaa muuttoliike ja invaasion munasarjasyöpäsoluja [31,32,33]. Olemme ehdottaneet, että PMBPs voi estää NFKB toimintaa ja estävät munasarjasyövän hyökkäystä. Fosforylaatio IκBα voi vapauttaa NFKB-alayksiköt, jotka kuljetetaan sytoplasmasta tumaan solujen säädellä kohdegeenien [34]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että IκBα fosforylaatio ja NFKB translokaatio sytoplasmasta tumaan estyy PMBPs hoitoa (kuvio 8A ja 8C). NFKB toimii transkription tekijä MMP-9 sääntely [35,36]. Tuloksemme osoittavat, että PMBPs tukahduttaa NFKB aktiivisuutta ja tämä positiivisesti korreloi alas-MMP-9 ilmaisun.

MAPK signalointiryöpyn, kuten ERK1 /2, p38 MAPK ja JNK, on ​​liitetty siirtyminen ja hyökkäys lukuisia syöpäsolutyyppien [37,38,39]. Tässä tutkimuksessa olemme arveltu, että PMBPs voisi antagonisoivat MAPK signaalinvälitysreittien tukahduttaa maahanmuuttoa ja invaasion munasarjasyöpäsoluja. Tuloksemme osoittivat, että PMBPs hoito esti aktivoinnin ERK1 /2: n ja p38 MAPK annoksesta riippuvaisella tavalla, mutta sillä oli vähän vaikutusta JNK-reitin (kuvio 8B ja 8D).