Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia tiettyjä molekyylimarkkereina jotka voivat johtaa uusiin oivalluksia määrittää innovatiivisia hoitoja. Rooli DNMT3b ja sen ennusteita vuonna ennustetta suusyövän tunnistettiin. Ihmisen suusyöpä solulinjojen SCC4 ja SCC25 valittiin solujen kokeita. Muutokset kasvaimen kasvua, aggressiivisuus ja vastuullinen signalointireitille tutkittiin

in vitro

ja

in vivo

. Lisäksi 125 suusyövästä kudosnäytteiden analysoitiin immunohistokemiallista värjäystä kudokseen microarray dioja, ja korrelaatiot lasketaan välillä tason DNMT3b ja kliininen tulos potilaita. Meidän tietojen mukaan esto DNMT3b johtivat hitaampi kasvaimen kasvua, heikennettyjä kasvaimen invaasio kyky ja epiteelin mesenkymaalitransitioon, määritettynä

in vitro

ja

in vivo

kokeita. Aktivoitu IL-6 signalointi voisi olla vastuussa induktion DNMT3b ilmentymisen vaikutus suusyöpä. Mitä kliiniset tiedot, ilmaantuvuus DNMT3b immuunivaste suusyövän yksilöitä oli merkittävästi suurempi kuin ei-pahanlaatuinen epiteelin, ja myönteinen yhteys IL-6. Lisäksi ilmaus DNMT3b merkitsevästi liittyy riski imusolmuke osallistumista, taudin uusiutumisen ja lyhyemmät eloonjäämisen potilailla, joilla on patologinen III-IV suun syöpä. Johtopäätöksenä IL-6 -DNMT3b akseli voitaisiin ennustaa ennuste suusyövän klinikoilla, ja kohdistaminen DNMT3b voisi edustaa lupaava hoitostrategia.

Citation: Chen WC, Chen MF, Lin PY (2014 ) merkitys DNMT3b suun Cancer. PLoS ONE 9 (3): e89956. doi: 10,1371 /journal.pone.0089956

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japani

vastaanotettu: 30 lokakuu 2013; Hyväksytty: 24 tammikuu 2014; Julkaistu: 13 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ oli tukea Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan, myöntää CMRPG6A0222-3. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

useimmin suusyöpä ovat suun okasolusyöpää (OSCC), jotka ovat pahanlaatuisia kasvaimia pään ja kaulan. Tämä aggressiivinen epiteelin kasvain liittyy vakava sairastuvuus. Leikkauksen jälkeinen kemosädehoito (CCRT) johtaa paremmin paikallista alueellista ohjaus ja selviytymistä varten paikallisesti levinneen pään ja kaulan alueen syöpäpotilasta korkean riskitekijöitä [1]. Huolimatta huomattavaa edistystä hoidossa, 40-50%: lla potilaista, joilla paikallisesti edennyt sairaus uusiutumisen paikallisten tai etäinen taudin etenemistä [2]. Tutkitaan erityisiä molekyylimarkkereiden liittyvä epätasapaino solukuoleman ja lisääntymistä, kyky kudosinvaasio ja hoito herkkyys, voisi tarjota uusia oivalluksia tunnistamiseksi innovatiivisten hoitojen.

OSCC on monitekijäinen sairaus, joka liittyy ensisijaisesti kroonista tupakan, alkoholin ja pähkinä käyttää [3]. Geneettinen taipumus on myös liitetty suun kasvainten synnyssä, ja useita geneettisiä ja epigeneettisiä vaihtelussa osallistuvat syöpäsolujen kasvun [4]. Poikkeava DNA: n metylaatio on avainasemassa karsinogeneesis-, mikä epigeneettiset vaiennettu kasvaimeen synnyssä osallisena solukierron säätelyssä, apoptoosin ja DNA korjaukseen [5], [6]. DNA hypermetylaation usein esiintyy syöpää edeltävän ja syöpä kudoksiin [7]. Vuonna OSCC, p14, p16, MGMT, DAP-kinaasi ja E-kadheriinin olivat usein ja laajasti tutkii metyloidut geenit [8] – [12]. DNA: n metylaatio on tyypillisesti välittyy DNA metyylitransferaaseja (DNMT) ja nisäkkäiden genomien on kolme DNMT geenejä; DNMT3a ja DNMT3b vastaavat de novo metylaation ja muokata metyloitumaton DNA, ja DNMT1 uskotaan olevan vastuussa siitä, että metylaation [13] – [15]. DNMT3b on raportoitu osallistua karsinogeneesi useita syöpätyyppejä, mukaan lukien ruokatorven, mahalaukun ja keuhkosyöpä [16] – [18], mutta rooli DNMT3b in OSCC vaatii lisätutkimuksia. Raportoimme aikaisemmin, että aktivoitu IL-6 signalointi liittyi aggressiivisen kasvain käyttäytymistä suusyövän [19]. Suun syöpäsoluja, IL-6: n raportoitiin edistää kasvaimien syntyyn, jonka alterinig DNA: n metylaatio [20]. Näin ollen tutkimme ilmaus DNMT3b vuonna OSCC ja sen yhteyttä IL-6 signalointia esillä olevassa tutkimuksessa. Rooli DNMT3b vuonna OSCC

in vitro

ja

in vivo

, ja korrelaatio kliinisiä tuloksia potilailla, joilla on OSCC käyttäen immunokemiallinen värjäystä analyysiä tutkittiin myös.

Materiaalit ja menetelmät

Tissue yksilöitä ja ominaisuudet potilaiden

Institutional Review Board (IRB) Chang Gung Memorial Hospital hyväksyi tässä tutkimuksessa (Luvan numero: 98-3546B). Kirjalliset suostumukset allekirjoittivat potilaat heidän näytteen ja tiedot voidaan tallentaa sairaalassa ja käytetään tutkimukseen. Lupamenettely on hyväksynyt IRB. Näytteet otettiin takautuvasti kerättiin potilailta diagnosoitiin paikallisesti levinnyt OSCC jotka saivat parantava hoito ja joka on rakennettu osaksi kudossiruina (TMA) lohkot immu- analyysiä. Tutkimuksessa TMA lohkot koostuivat 125 OSCC tapauksissa pathologic III-IV (posken kautta, n = 48; ienten, n = 24; huuli, n = 10; kielen, n = 35; maku, n = 8), jonka AutoTiss 1000 (Ever BioTechnology, Kanada). Kun lohkot olivat saatavilla, hematoksyliinillä ja eosiini-värjättyä objektilasit arvioitiin uudelleen jonka patologi laadun arvioimiseksi TMA dioja. Tiedot koskevat alustavan diagnoosin, lavastus, patologiset tekijät, toistumisen ja eloonjäämisen kerättiin (taulukko 1). Eloonjäämistä analyysit suoritettiin käyttämällä Kaplan-Meier-menetelmää. Merkitys välillä ryhmäeroja arvioitiin käyttäen Sperman-rank-testi. Monimuuttuja analyysit suoritettiin käyttäen Coxin regressiomallin kokonaiselossaolo. Kaikki tilastolliset testit olivat kaksipuolisia, joissa merkitys määriteltiin p 0,05.

immunohistokemiallinen värjäys (IHC) B

kudososat TMA lohkot ja formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut kudokset leikataan 4-um: n leikkeitä, asennettu dioja, parafiini ksyleenillä ja dehydratoitiin käyttäen arvostellaan etanolia sarjassa. Antigeeni haku, jossa käytetään sitruunahappoa (pH 6,0) 30 minuutin ajan, minkä jälkeen hoito with3% vetyperoksidia. Levyjä inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa vasta-aineita spesifisten proteiinien. Spesifisiä vasta-aineita p-H2AX, MMP-9, verisuonen endoteelin kasvutekijä (VEGF), ja CD31 saatiin Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA), Chemicon (Temecula, CA), Research Diagnostics Systems, Inc. (Minneapolis, MN USA), ja DNMT1 ja DNMT3b ostettiin Abcam (Cambridge, MA), vastaavasti. Niitä käytettiin 1:100 laimennoksina. Kolmen pesun jälkeen fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS), leikkeitä inkuboitiin biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineen for10 min ja värjättiin peroksidaasi-avidiini ja pestiin jälleen PBS: ssä; sitten 3-amino-9-etyylikarbatsolia lisättiin. Leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä. IHC Aineisto analysoitiin Image Pro Plus 6.3 (IPP). Mikrovaskulaarinen tiheys (MVD) mittaukset käyttäen CD31 värjäystä Jokainen immunoreaktiivisia endoteelisolujen klusterin kontaktissa valitun kentän laskettiin. Aineisto IHC tutkittiin Good Speed ​​scan dian skannaus alusta, ja analysoitiin Image Pro Plus 6.3 (IPP). Tämä analyysi osoitti, että vasta-aineet suunnattu proteiineja, jotka olivat erittäin ilmaistaan ​​kasvaimen epiteelisoluissa (Fig. 1) verrattuna viereisen ei-syöpäkudoksessa. Histologista arviointia DNMT1 ja DNMT3b värjäyksen lisäksi IPP analyysin objektilasit uudelleen tarkastaa yhdellä patologi. DNMT1 ja DNMT3b immunoreaktiivisuus kudosnäytteen laskettiin varten solut osoittivat positiivista tumavärjäystä, riippumatta sytoplasmisen staining.The näytteet arvioitiin käyttäen semi-kvantitatiivinen immunoreaktiivisia pisteet (IRS). IRS laskettiin kertomalla värjäyksen intensiteetti (arvostellaan: 0 = ei, 1 = heikko, 2 = kohtalainen ja 3 = voimakas värjäytyminen) ja prosenttiosuus positiivisesti värjäytyneiden solujen (0 = alle 10% värjäytyneiden solujen, 1 = 11-50% värjäytyneiden solujen, 2 = 51-80% värjäytyneiden solujen ja 3 = yli 81% värjäytyneiden solujen). Kriteeri positiivista värjäytymistä on näyte, jossa on IRS pisteytyksen asteen 2.

. Tasot DNMT1 ja DNMT3b tutkittiin syövän (CA) ja ei-pahanlaatuista kudosta (NT) Western-blottauksella analyysi. B. tasot DNMT1 ja DNMT3b tutkittiin kuudella yksilöt (pariksi syöpä (CA) ja viereisen ei-pahanlaatuista kudosta (NT), RT-PCR: llä. Y-akseli esittää suhdetta kohdeproteiinin syöpäkudoksessa jaettuna, että ei-pahanlaatuinen yksilö. sarakkeet, keskiarvo kolmen erillisen kokeen; Bars, keskihajonta (SD), *, P 0,05. C. edustaja dioja IHC positiivisia värjäyksen DNMT1 ja DNMT3b vasta esitetään kuvin IPP (NT, vieressä olevaan ei pahanlaatuinen epiteelin, CA, suullinen syöpä kudosta). Kuvia edustavia kuvia näytetään suurennoksia x 100 (ylärivi) ja x 200 (alarivi). * (+) tarkoittaa positiivista värjäytymistä syövässä viereiseen NT.

Soluviljely ja reagenssit

ihmisen suusyövän solulinjoissa, SCC4 ja SCC25, saatiin Bioresource Collection and Research Center (BCRC). ihmisen rekombinantti IL-6-vasta-aine saatiin R 50 solua, pisteytettiin määrittämiseksi pinnoitus tehokkuuden ja elossa jakeet kunkin solulinjan.

Immunoblottausmääritys

western blotting Kokonaisten solujen ja suun kudosten uutteita, näytteet homogenisoitiin ja /tai käsiteltiin lyysipuskurilla (Calbiochem, La Jolla, CA). Suullinen kudosnäytteitä koostui kuudesta syövän kudosnäytteet ja kuusi ei-pahanlaatuinen epiteelin yksilöitä. NE-PER (Pierce, Rockford, IL) käytettiin erottamaan ydin- ja sytoplasman proteiineja. Määrittää

in vitro

vaikutuksia IL-6 Ab, ja DNMT estäjä, proteiinit uutettiin soluista läsnä ollessa tai ilman 5 ug /ml IL-6 neutraloivia vasta-aineita 24 h tai 5 uM 5- atsa-2′-deoksisytidiinin 36 tuntia, vastaavasti. Yhtäläisen määrän proteiinia ladattiin 4-20% gradientti SDS-PAGE-geelissä, proteiini siirrettiin nitroselluloosasuodattimille jälkeen erotetaan geelissä. Blotit blokattiin 2% BSA TBST: ssä 1 h, kalvoja inkuboitiin yli yön (4 ° C), jossa vasta-aineita DNMT1, DNMT3b, VEGF, E-kadheriinin, STAT3, pSTAT3

Tyr705, ja MMP-9. Membraanit inkuboitiin HRP konjugoidun sekundaarisen anti-vuohi-anti-hiiren tai anti-kani-vasta-aineiden (laimennus 1:1,000-1:2,000), vastaavasti, 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Proteiinit tehtiin näkyviksi tehostetun kemiluminesenssin. Kalvot uudelleenseulottiin vastaisella vasta-aineella r-tubuliinia tai tumalevy normalisoida proteiinia lastaus.

Reaaliaikainen RT-PCR (RT-PCR) B

Reaaliaikainen RT-PCR suoritettiin RNA uutetaan soluista ja kudosnäytteiden (kuusi syöpä kudosnäytteet ja kuusi ei-pahanlaatuinen suun kudosten kaksi yksilöt ajaa kunkin kaistan). RNA: ta (2 ug) käänteiskopioitu satunnainen aluke saamiseksi ensimmäiselle cDNA-juosteelle. Sekvenssit alukkeiden DNMT3b olivat 5’GACTCGAAGACGCACAGCTG -3 ’/5’CTCGGTCTTTGCCGTTGTTATAG ”. Ohjaamaan lastaus eroja, joka on β-aktiinin aluketta käytettiin kontrollina. Optimoitu PCR suoritettiin koskevasta iCycler Iq monivärinen reaaliaikainen PCR tunnistusjärjestelmä. Merkittävät fluoresoiva PCR-signaalit syöpäkudosten normalisoitiin keskiarvo saadut signaalit ei-pahanlaatuisten kudosten ja solujen kontrolloiduissa olosuhteissa.

immunofluoresenssi (IF) B

Solut, jotka osoittavat eksponentiaalinen kasvu ympättiin kansi luistaa immunofluoresenssivärjäyksen kanssa tai ilman hoitoa. Ilmoitettuina aikoina käsittelyn jälkeen solut kiinnitettiin, permeabilisoitiin 2% paraformaldehydillä 5 minuutin ajan ja pestiin PBST: llä. Levyjä inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa vasta-aineilla E-kadheriinin, DNMT3b, VEGF: n ja MMP-9: 1 h ja Texas Red-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineella. Objektilasit vastavärjättiin DAPI visualisoida ytimiä. Kahden pesun jälkeen PBST: llä, erityinen tavoite proteiinit visualisoitiin käyttämällä fluoresenssimikroskooppia.

Cell kulkeutumista ja solujen invaasiota määritys

Kapasiteetti soluinvaasion määritettiin käyttäen Cell Invasion Assay (Trevigen, Gaithersburg, MD). Kun oli inkuboitu 24 tuntia, solujen lukumäärä alakammiossa määritettiin mittaamalla fluoresoiva anioni calcein, vapautetaan solunsisäisten calcein acetoxymethylester. Validoida kokeita koskevien solujen vaeltamiseen, naarmu määritykset suoritettiin. 2 mm leveä naarmu vedettiin yli kunkin solun kerroksen käyttäen pipetin kärkeä. Levyt valokuvattiin aikoina ilmoitettu.

ksenograftimallissa

Tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals ohjeistuksen mukaan Institutes of Laboratory Animal Resources, National Research Council, USA protokolla hyväksyi valiokunnan Ethics eläinkokeiden Chang Gung Memorial Hospital (Luvan numero: 2012080902). Kahdeksan viikon ikäisiä naaras kateenkorvattomia nude-hiiriä käytettiin ksenografti kasvaimen istutuksen malli. Vuonna kohdunulkoinen tuumorin implantaation malli, soluja (1 x 10

6 kasvainsoluja ruiskutettiin ihonalaisesti kohti istutusta, viisi eläintä ryhmää kohti) istutettiin kahdenvälistä selkäpuolen pakaraan. Tuumorin koko mitattiin joka kolmas päivä istuttamisen jälkeen (päivä 0). Kasvaimen tilavuus laskettiin olettaen ellipsoidin muotoinen.

Tulokset

Tasot DNMT3b suun syöpä kudoksiin

ilmentymistä DNMT3b vuonna kudosnäytteet (pahanlaatuinen versus viereisen ei-pahanlaatuinen ) tutkittiin Western-blottauksella, kun taas mRNA: n osoitettiin reaaliaikaisella RT-PCR: llä (Fig. 1A-B). Vuoteen data, syöpä osoittivat merkittävästi suuremman DNMT3b kuin ei-pahanlaatuinen yksilö. IHC data TMA dioja vahvisti tämän havainnon että DNMT3b yliekspressoitui kasvainkudoksissa kuin viereisen ei-pahanlaatuisen epiteelin kudosten (Fig. 1 C). 125 suusyövän kudoksissa määritettiin DNMT3b ja DNMT1 käyttäen IHC-analyysi, 76 (61%), jolloin saatiin DNMT3b positiivinen immunoreaktiivisuus, mutta vain 36% (45/125) ja DNMT1 positiivista värjäytymistä. Lisäksi rooli DNMT3b kliinisessä tulos ihmisen OSCC arvioitiin edelleen käyttäen IHC värjäystä. Potilaat edelleen luokitella DNMT3b (+) tai DNMT3b (-) perusteella IHC tuloksia. Oli positiivinen korrelaatio esiintyvyys imusolmuke etäpesäke, taudin uusiutumisen ja DNMT3b positiivista värjäytymistä (taulukko 1). Kahdeksankymmentä-kolme prosenttia (40/46) potilaista, joilla tauti uusiutuu (myös paikallis- alueiden epäonnistumisen ja etäispesäkkeitä) osoitti positiivista värjäytymistä varten DNMT3b. Sen sijaan 46% (36/79) potilaista luokiteltu ottaa taudista vapaan aseman ilmaisi DNMT3b. Havainnot viittaavat siihen, että DNMT3b värjäystä voisi olla ennustearvo ennustetta suusyövän.

rooli DNMT3b kasvaimen kasvussa

tutkia, vuorotellen DNMT3b lauseke ollut merkitystä aggressiivinen kasvaimen kasvua, suusyöpä solut transfektoitiin DNMT3b-GFP hiljentäminen vektori. Kuten on osoitettu kuviossa 2A DNMT3b hiljentäminen vektori esti merkittävästi DNMT3b ilmentymistä syöpäsoluissa Western-blottauksella ja immunokemiallinen värjäys analyysi. Vaikutus DNMT3b kasvainsolujen kasvua määritettiin elävien solujen laskenta kuuden päivän aikana ja pesäkkeiden muodostumista. Tiedot solun kokeet osoittivat DNMT3b hiljentäminen vektorit merkitsevästi esti kasvainsoluproliferaation

in vitro

(Fig. 2B). Muutos solusyklin jakautumisen edelleen mitattiin. DNMT3b hiljentäminen Vektori johti solusyklin pysähtymiseen (Fig. 2C). Kuten kuvassa 2D havainnoimalla ksenograftikasvaimissa, estämällä DNMT3b käyttäen hiljentäminen vektoreita vähentynyt merkittävästi kasvaimen kasvua.

. Vaikutukset DNMT3b hiljentäminen vektorin tasosta DNMT3b vuonna SCC4 ja SCC25 osoitettu Western blottauksella ja immunokemiallinen värjäys

in vitro

. Kuvia edustavia kuvia näytetään ja nuoli osoittaa positiivista värjäytymistä DNMT3b soluissa. (C-V, solut kontrollivektorilla, DNMT3b-SV, jotka on vakaasti transfektoitu DNMT3b hiljentäminen vektori, DNMT-I, solut käsiteltiin DNMT estäjä). B. Vaikutus DNMT3b proliferaatioon suun syöpäsolujen määritettynä elävien solujen laskenta ja pesäkkeiden muodostumista. Sama määrä soluja (10

4) maljattiin kullekin levylle päivänä 0 ja niiden annetaan kasvaa niiden kulttuureissa. Laskimme elävien solujen lukumäärä inkubaation jälkeen 2, 4 ja 6 päivää. Y-akseli edustaa elävien solujen määrä. Point, tarkoittaa kolmen erillisen kokeen; baareja, SD. *,

p

0,05. C. Solut analysoitiin FACS: lla DNA sisällön hallinnassa tila tai DNMT3b esto. Aineisto osoittaa edustettuna kuvia. D. Vaikutukset DBMT3b hiljentäminen vektorin tasoista DNMT1 ja DNMT3b arvioidaan IHC ja ksenograftin kasvaimen kasvua. Kukin piste edustaa keskiarvoa kolmesta erillisestä kokeesta; baaria, SD; *,

P

0,05. Edustavia kuvia näytetään.

rooli DNMT3b kasvaimen invaasio

oli positiivinen yhteys DNMT3b värjäystä ja LN etäpesäke ja sairauksien vajaatoimintaa sairastavilla potilailla suusyövän (taulukko 1). osoitettuna käyttäen muuttoliikkeen tyhjästä ja invaasio määrityksiä DNMT3b hiljentäminen vektorit vaimenee hyökkäyksen kapasiteetti suun syöpäsolujen

in vitro

(Fig. 3A-B). Epiteelin mesenkymaalitransitioon (EMT) on keskeinen tapahtuma invasiivisuus kasvain [21]. Siksi määritettiin, oliko tämä mekanismi taustalla vaikutuksia DNMT3b suun syöpä invasiivisuus. DNMT3b hiljentäminen Vektori aiheuttama suun syöpäsolujen lisätä epiteelin ominaisuudet määritettynä ilmentymisen muutosten E-kadheriinin, tunnusmerkki EMT [22] ja vimentiinista (Fig. 3C-D). EMT on raportoitu liittyvän useita hyökkäyksen liittyviä tekijöitä, kuten VEGF ja MMP-9. Meidän tietojen mukaan esto DNMT3b että hiljentäminen vektorin vähensi VEGF: n ilmentymistä ja MMP-9. Angiogeneesi on yksi niistä mekanismeista, jotka edistävät kasvaimen etenemiseen, ja CD31-välitteistä endoteelisolujen-solu-vuorovaikutuksia ovat mukana angiogeneesin [23]. Siksi verisuoniverkoston sisällä kasvain mitattiin VEGF värjäys ja mikrovaskulaarinen tiheys (MVD) analyysi sen jälkeen, kun CD31 värjäystä. Kun suun kautta syöpäsolut kontrollivektoreihin ja ne, joilla DNMT3b hiljentäminen vektoreilla implantoitiin ihon alle hiiriin, olemme huomanneet, että kasvua estävä vaikutus indusoi DNMT3b hiljentäminen vektori liittyy pienempi ekspressiotasot EMT- ja angiogeneesiin liittyvä tekijä (Fig. 3E). Näin ollen ehdotimme, että DNMT3b yliekspressio on rooli kasvaimen edistäminen, ja angiogeneesin induktio ja EMT voisi olla kätyri mekanismeja.

. Invasiivista kapasiteetti suun syöpäsolujen kanssa tai ilman DNMT3b hiljentäminen vektori arvioitiin muuttoliike tyhjästä määrityksiä. Tulokset edustaja kuvia näytetään. Sarakkeessa, keskimääräinen kolmen erillisen kokeen. Bars, SD. *, P 0,05. B. invasiivisia kapasiteetit suun syöpäsolujen kanssa tai ilman säätelemiseksi DNMT3b arvioitiin invaasiomääritys vuonna SCC4 ja SCC25 suun syöpäsoluja. Tulokset on esitetty edustavien dioja ja määrällisiä tietoja. *,

P

0,05. C. Muutokset E-kadheriinin soluissa arvioidaan ja tulokset esitetään edustavista dioja (ylärivi, immunofluoresenssimenetelmällä kuva värjätään Ab DNMT3b ja DAPI varten ytimen; alarivissä, immunofluoresenssimenetelmällä kuva värjätään Ab E-kadheriinin ja DAPI for nucleus); (Blue: DAPI; Green: GFP-vektori, Red: kohdeproteiinin). D. Muutokset EMT liittyviä proteiineja solujen säännellä DNMT3b arvioitiin Western blot-analyysi (C-V, solut kontrollivektorilla, DNMT3b-SV, solut DNMT3b hiljentäminen vektori). E. IHC käyttämällä MMP-9, CD31, ja VEGF: n värjäytymistä formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut kudokset päässä ksenograftikasvaimissa. DNMT3b hiljentäminen vektorit merkittävästi vähentää angiogeneesiä ja EMT liittyviä muutoksia verrattuna kontrollivektorilla.

DNMT3b ja IL-6 liittyy kliininen tulos OSCC

Aiemmin kerroimme, että aktivointi IL-6 /STAT3 signaloinnin aiheuttama aggressiivinen kasvain käyttäytymistä ja EMT muutokset suusyövän [19]. Siksi korrelaatio DNMT3b ja IL-6 kliininen tulos III-IV ihmisen OSCC edelleen arvioitiin käyttäen IHC siitä TMA koostuu 125 näytettä. 125 kudosnäytteet testattiin DNMT3b ja IL-6, sekä 59 (61%) oli positiivisia. Kuten kuvassa 4A on esitetty, merkittävä positiivinen korrelaatio havaittiin syövän näytteestä, jotka värjäytyivät positiivisesti DNMT3b ja IL-6. Käyttämällä univariate analyysi, taudin uusiutumisen ja positiivista värjäytymistä varten DNMT3b ja IL-6 olivat kaikki merkitsevästi yhteydessä lyhyempi elinaika (taulukko 2 ja kuva 4B). Monimuuttujamenetelmin, ilmaus DNMT3b ja taudin uusiutumisen oli merkittävä ennustavat yleistä selviytymistä 125 suun syöpäpotilaiden (taulukko 3). Havainnot korostavat panosta DNMT3b ainevärjäystä huonon ennusteen suusyöpä. Proteiini-analyysi, inhibitio IL-6 signaloinnin alensivat DNMT3b ja EMT liittyvien tekijöiden ilmentyminen, joka liittyy heikennettyjen STAT3 ja Akt aktivointi (Fig. 5A-B). Lisäksi, kuvio 5C osoittaa, että vähentynyt DNMT3b IL-6-vasta-aineen lisääntynyt DNA-vaurioita ja solukuolemaan. Siksi ehdotetaan, että aktivointi IL-6 signalointi voisi olla vastuussa lisääntyneestä DNMT3b suun syöpiä.

. DNMT3b taso korreloi positiivisesti IL-6 ilmentymistä ihmisen suusyövän yksilöt (P 0,0001). Edustaja kalvot valitun tuumorinäytesylinterin positiivisesti värjäämällä sekä IL-6 ja DNMT3b on esitetty x 100 ja 400 suurennus. B. Survival erot mukaan kehittämään tautia vika tai ei, positiivinen värjäytyminen DNMT3b ja positiivista värjäytymistä sekä DNMT3b ja IL-6. Kaplan- Meier eloonjäämiseen käyrät osoittavat, että positiiviset ryhmät olivat yhteydessä lyhyempi selviytymisen verrattuna negatiivisilla ryhmän.

. IL-6 tasoista DNMT3b ja EMT-sukuiset proteiinit arvioivat immunof- analyysi

in vitro

ja tulokset esitetään edustavien dioja. B. vaikutus estää IL-6 tasolla DNMT3b, STAT3 /AKT aktivointi ja EMT-sukuiset proteiinit ovat arvioidaan Western blotting -analyysi. C. vaikutukset IL-6 tasolla DNMT3b ja solukuoleman proteiinien SCC4 ja SCC25 osoitettu immunokemiallinen värjäys

in vitro

.

Keskustelu

on raportoitu, että siirtyminen kertyvät DNA hypermetylaation voisi johtua yli-ilmentyminen DNA metyylitransferaasien [15]. Epigeneettiset geenien edistämä DNMTs, on havaittu oli erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia, tukee väitettä, että DNMT geenit ovat yli-ilmentynyt ihmisen syövissä ja sen aikana solun transformaatio [24] – [26]. Esillä olevassa tutkimuksessa, IHC TMA dioja paljasti, että taso DNMT3b ilmentyminen oli korkeampi 76 (61%), syövän näytteistä kuin viereisen ei-pahanlaatuisen suun epiteelin. Arvioimme lisäksi jos DNMT1 yliekspressoitiin OSCC käyttäen IHC TMA dioja. Tiedot osoittivat, että vain 45 (36%) syöpä näyte oli korkeampi DNMT1 verrattuna viereiseen ei-pahanlaatuisen epiteelin kudoksia. Tunnistaminen, kehittäminen ja valinta molekyylikohteista ovat tärkeitä syövän hoidossa. Ennustavan valtuudet DNMT3b tutkittiin edelleen kannalta kliininen tulos suun syöpä. Käyttämällä univariate analyysi, parannettu ilmauksia DNMT3b liittyivät merkittävällä tavalla suurempi ilmaantuvuus imusolmuke etäpesäke, korkeampi toistumisen määrä käsittelyn jälkeen ja lyhyemmän selviytymistä. Monimuuttujamenetelmin, tauti epäonnistuminen ja tehostettu ilmentyminen DNMT3b liittyi merkittävästi lyhyempi kokonaiselossaolo. Tutkia tarkemmin, ovatko DNMT3b vastasi aggressiivinen kasvain kasvun OSCC, me tukahdutti DNMT3b suun syöpäsolujen käyttäen vaiennettu vektorin. Tiedot on saatu solu kokeita ja ksenograftin kasvaimen kasvua kokeet paljastivat, että esto DNMT3b johtivat hitaampi kasvaimen kasvua. Lisäksi esto DNMT3b liittyi heikennetyn invasiivisuus. Molekyyli- ja fenotyyppisiä muutoksia, jotka osallistuvat muutosta epiteelin solun mesenkyymisolun tyyppi näyttävät olevan toiminnallisesti merkityksellisiä invasiivisia ominaisuuksia kasvaimia [21]. On raportoitu, että EMT liittyy OSCC etenemiseen [27], [28]. Molekyylitasolla markkeritaso, EMT on ominaista menetys E-kadheriinin ja lisääntyneen ilmentymisen vimentiinista ja hyökkäyksen liittyviä tekijöitä. DNMT3b hiljentäminen vektorit aiheuttama lisääntyminen E-kadheriinin ja pienenee VEGF ja MMP-9 suullisesti syöpäsoluja. Lisäksi angiogeneesi on yksi niistä mekanismeista, jotka edistävät kasvaimen etenemiseen, ja CD31 välitteistä endoteelisolujen-solu-vuorovaikutuksia mukana angiogeneesiä. Meidän tiedot, esto DNMT3b heikennetty kasvaimen kasvua, liittyy pienentynyt CD31 ja VEGF ilmaisuja kasvaimia. Nämä havainnot osoittivat, että DNMT3b voisi välittävät aggressiivinen kasvaimen kasvua suun syöpä ja edistäminen EMT ja angiogeneesi on yksi taustalla olevien mekanismien.

OSCC kehitys on osittain helpottaa kroonisten epiteelin ärsytystä ja tämä kasvain on enemmän yleisempää tupakoitsija tai jotka kuluttavat liikaa alkoholia. IL-6, on tulehdusta edistävä sytokiini, joka välittää krooninen tulehdus ja on raportoitu olevan tärkeä rooli tulehduksen rakentuvassa suun syövän synnyn [29], [30]. Raportoimme aikaisemmin, että aktivoitu IL-6 polkuja voisi olla vastuussa aggressiivisempia kasvaimen kasvua todetaan suusyövän, ja korkea aktivoitu STAT3 ja p-AKT tason indusoitiin IL-6 ja yhdistää IL-6 kasvaimien syntyyn [19]. On todettu, että IL-6-tasot kohoavat tässä kasvain ja IL-6 pidetään huono ennustetekijä suusyöpä. IL-6 eritystä suullinen levyepiteelikarsinooma syöpä on helpottaa microenvironment erityisesti strooman hyytymistekijä-1 [29]. Lisäksi useat hankkeet ovat osoittaneet, että IL-6- aiheuttama hypermetylaation ja geenien saattaa välittää DNMTs [18], [20], [31] – [33]. Yhdessä ehdotimme, että krooninen tulehdus stressi suuontelon voi edistää kasvainten synnyssä välittämiä lisääntynyt IL-6 aiheuttaa poikkeavaa DNA metylaatio kautta lisääntynyt DNMT3b aktiivisuutta. Esillä olevassa tutkimuksessa, IHC saadut tiedot kliinisistä näytteistä osoitti, että DNMT3b ekspressio korreloi merkitsevästi IL-6-värjäys. Kasvain aggressiivisuus todettu IL-6 positiivinen OSCC saattaa osittain kautta yliekspressio DNMT3b. Sen hypoteesin testaamiseksi, suhde IL-6 signalointi ja DNMT3b in OSCC tutkittiin edelleen esillä olevassa tutkimuksessa, onko sääntely IL-6 signalointi aiheuttaa muutoksia DNMT3b ilmaisua. Jonka kokeissa, joissa IL-6 signaloinnin tukahdutettiin IL-6-vasta-ainetta, havaitsimme, että aktivoitu IL-6 signaloinnin tärkeä rooli DNMT3b aktivointi liittyy aktivoitu STAT3 ja PI3K suun syöpäsoluja. Saadut tiedot esillä Tutkimus osoitti, että lisääntynyt DNMT3b indusoiman IL-6, joka saattaa välittyä aktivointi STAT3 ja PI3K signalointi, on kriittistä kasvaimen aggressiivisuus ja ennusteen suun syöpä. Siksi esitellään keskeisimmät signalointi polkuja, jotka on ajateltu yhdistää IL-6 ja DNMT3b suun syöpä (Fig. 6).

Yhteenvetona tulehdusta ja metylointi ovat molemmat uskotaan avainasemassa suun tumorigeneesin kuitenkin tulehdus perustuva vaikutuksia metylaatio tarvitaan lisätutkimuksia tässä sairaudessa. Tämä hanke perustettiin IL-6-DNMT3b akseli on todennäköisesti tärkeä ennusteeseen OSCC. Tunnistaminen, kehittäminen ja valinta molekyylikohteista ovat tärkeitä syövän hoidossa. Tulokset tukevat nousevan hypoteesia, että IL-6-DNMT3b akseli on merkittävä ennustaja, ja kohdentamalla DNMT3b voi edustaa lupaavaa hoitoa strategia OSCC.