Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Suuri määrä ihmisen kasvaimeen liittyviä antigeenejä, joita tunnistavat CD8

+ T-solujen HLA luokan I (HLA-I) -restriktoidun muoti on tunnistettu. Special AT-rikas sekvenssi sitova proteiini 1 (SATB1) ilmentyy erittäin monissa eri ihmisen syöpiä osana neoplastisen fenotyypin, ja ylös-säätely SATB1 ilmaisu on oleellisen tärkeää tuumorin eloonjäännin ja etäpesäkkeiden, jolloin tämä proteiini voi toimia järkevä tavoite syöpärokotteisiin.

Menetelmät /Principal havainnot

Kaksitoista SATB1 peptidit ennustettiin immuniteettia tietotekniikan lähestymistapa perustuu HLA-A * 02 sitova motiivi. Nämä peptidit tutkittiin niiden kyky indusoida peptidi-spesifisten T-soluvasteiden perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa (PBMC: t), jotka saatiin HLA-A * 02

+ terveiden luovuttajien ja /tai HLA-A * 02

+ syöpäpotilailla . Tunnustaminen HLA-A * 02

+ SATB1 ilmentäviä syöpäsoluja testattiin myös. Kahdestatoista SATB1-peptidit, SATB1

565-574 usein indusoi peptidi-spesifisten T-soluvasteiden PBMC sekä terveiltä luovuttajilta ja syöpäpotilailla. Tärkeää on, SATB1

565-574 spesifisten T-solujen tunnustettu ja tappoivat HLA-A * 02

+ SATB1

+ syöpäsoluja HLA-I-rajoittuneesti.

Johtopäätökset /Merkitys

Olemme tunnistaneet uuden HLA-A * 02-rajoitettu SATB1 peptidin epitooppi tunnistavat CD8

+ T-solut, jotka puolestaan ​​tunnistaa ja tappaa HLA-A * 02

+ SATB1

+ kasvainsoluja. SATB1 johdettu epitooppi tunnistettu, voidaan käyttää diagnostisen markkerin sekä immuunijärjestelmän kohteena syövän kehittymiseen rokotteita.

Citation: Wang M, Yin B, Matsueda S, Deng L, Li Y, Zhao W , et ai. (2013) tunnistaminen Erityistä AT-Rich Sequence sitova proteiini 1 uutena Kasvain tunnistama antigeeni CD8

+ T Cells: vaikutuksia Cancer immunoterapia. PLoS ONE 8 (2): e56730. doi: 10,1371 /journal.pone.0056730

Editor: Silke Appel, University of Bergen, Norja

vastaanotettu: 26 lokakuu 2012; Hyväksytty: 14 tammikuu 2013; Julkaistu: 21 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ oli osittain tuettu avustuksia National Cancer Institute, National Institutes of Health ja Cancer Research Institute, ja The Methodist Hospital Research Institute. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Yksi lupaavimmista lähestymistavoista syövän hoidossa perustuu valjastaa immuunijärjestelmään kitkeä pahanlaatuisia soluja [1], jonka onnistuminen riippuu pitkälti määrittää soveltuvat kasvaimeen liittyviä antigeenejä (TAA) kehittämään tehokkaita syöpä rokotteita. On vakiintunut, että kasvainsolut ilmentävät TAA jotka voidaan tunnistaa CD8

+ T-solujen yhteydessä HLA luokan I (HLA-I) molekyylejä. Suuri määrä TAA: ita, ja TAA-johdettuja epitooppeja on tunnistettu [2], [3], ja jotkut näistä proteiineista ja peptidijohdannaiset jo kliinisissä rokotteen tutkimuksissa. Viimeaikaiset hyväksyntöjä immunoterapian-pohjainen rokote /lääke sipuleucel-T (Provenge) ja ipilimumab (Yervoy) Food and Drug Administration (FDA) edustavat virstanpylväitä alalla syövän immunoterapiassa [4], [5]. Ja vaiheen III kliinisessä tutkimuksessa, että gp100 peptidin melanooman tuottivat erittäin lupaavia tuloksia [6]. Lisäksi työtä kahdesta riippumattomasta korosti kasvaimen antigeenejä herättämisessä immuunivasteisiin kehittyvä kasvain [7], [8], epäilemättä tehostaa edelleen pyrkimyksiä etsiä uusia kasvain antigeenejä syövän immunoterapiaa.

huolimatta niinkin lupaavia tuloksia, menestystä syöpärokotteessa tutkimuksissa kokonaisuutena on ollut satunnaista [9] – [11]. Viime parin vuoden aikana useat ita, joita ilmentyy erilaisten kasvainten on havaittu [2], [3]. Kuitenkin suurin osa kuvattujen antigeenien tähän mennessä on tarpeeton selviytymisen ja kasvun kasvainsolujen, lukuun ottamatta muutamia TAA: iden, kuten telomeraasia [12], surviviini [13] ja anti-apoptoottisten jäsenten Bcl-2- perhe (Bcl-2, Bcl-X (L) ja Mcl-2) [14]. Kasvainsolut voivat siis karannut valvontaa immuunijärjestelmää kautta menetys ja /tai alas-säätely tuumoriantigeenien [15]. Näin ollen, kohdistaminen ita, jotka ovat välttämättömiä selviytymisen ja kasvainsolujen kasvua voidaan paremmin estää immu- antigeeni-puutteellisten muunnosten seurauksena rokotuksen ja parantaa tehokkuutta syövän immunoterapiassa [15], [16]. Tällainen immunogeeninen kasvain antigeenejä, jotka saavat aikaan minimaalinen immuunijärjestelmän paeta vuoksi ovat optimaaliset rokotekandidaateiksi syövän immunoterapiassa.

Special AT-rikas sekvenssi sitova proteiini 1 (SATB1) on tumatekijä, joka toimii globaalina chromatin järjestäjä. Se säätelee geenien ilmentyminen taittamalla kromatiinin osaksi silmukka verkkotunnuksia, ja kiinniottamiseksi DNA -verkkotunnuksia SATB1 verkon rakenteeseen [17]. SATB1 näytti olevan yli-ilmentynyt aggressiivinen rintasyövän solulinjoissa, mutta puuttuu tai sitä ei voitu havaita normaaleissa ja kuolemattomiksi ihmisen rintarauhasen epiteelisolujen, mikä viittaa rooliin SATB1 in uudelleenohjelmointi chromatin organisaatiossa ja lopulta transkription profiileja rintasyövistä edistää kasvua ja etäpesäkkeiden [18] . Lisäksi, korkeampi SATB1 ilmentymisen liittyi monien muiden syöpien, mukaan lukien kurkunpään okasolusyöpä [19], endomet- kohdun limakalvon syöpä [20], maksasyövän [21], peräsuolen syöpä [22], ihon pahanlaatuinen melanooma [23 ], mahasyöpä [24], [25], munasarjasyöpä [26], eturauhassyöpä [27], keuhkosyöpä [28] ja gliooma [29]. Up-regulation SATB1 tämäntyyppisissä syövät voivat edistää kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden. Koska SATB1 on välttämätön kasvaimen kasvu /eloonjäämisen ja etäpesäkkeiden, immuuni paeta menetys tai alas-säätely SATB1 ilmentyminen voi heikentää jatkuvaa kasvainsolujen kasvua ja /tai etäpesäkkeitä, jolloin SATB1 houkutteleva kohde syöpälääkkeiden rokotteita erilaisia ​​syöpiä, jotka ekspressoivat SATB1.

tässä raportissa kuvaamme tunnistamisen SATB1 johdettujen T-soluepitooppeja T-solu tunnistaa käyttäen immunologisesti bioinformatiikan lähestymistapaa. Valitsimme kaksitoista peptidejä, jotka ennustettiin sitoutuvan HLA-A * 02-molekyyli. Ne syntetisoitiin ja arvioitiin

in vitro

niiden kyky stimuloida T-soluja PBMC terveillä koehenkilöillä ja /tai syöpäpotilaille perustuu interferoni-γ (IFN-γ) vapautumista. Yksi näistä peptideistä, SATB1

565-574, havaittiin indusoivan IFN-γ release perifeerisissä T-soluissa sekä terveillä koehenkilöillä ja syöpäpotilailla. Tärkeää on, SATB1

565-574 erityinen T-solut pystyivät tunnistamaan ja tappaa HLA-A * 02

+, SATB1 ilmentävä kasvain solujen HLA-I-riippuvaisella tavalla. Nämä tulokset osoittavat pätevyyden immunologiseen bioinformatiikan lähestymistapaa ja ehdottaa SATB1

565-574 voivat edustaa uutta kasvain epitooppia syövän immunoterapiassa.

Materiaalit ja menetelmät

Terveet luovuttajat ja syöpäpotilaat

HLA-A * 02

+ eturauhas- tai munasarjasyöpä potilaiden ja kymmenen HLA-A * 02

+ tervettä henkilöä otettiin tähän tutkimukseen, kun kirjallinen suostumus saatiin. Kaikki protokollat ​​hyväksyi Institutional Review Board (IRB) on Baylor College of Medicine ennen opintojensa. 20 ml perifeeristä verta saatiin kunkin henkilön, ja ääreisverenkierron mononukleaariset solut (PBMC: t) eristettiin tiheysgradienttisentrifugaatiolla käyttäen Lymphoprep (Nycomed Pharma AS, Oslo, Norja). Juuri eristetyt PBMC: t kryosäilöttiin myöhempää käyttöä 1 ml jäädyttäminen alustassa, joka sisälsi 90% FCS: ää ja 10% dimetyylisulfoksidia (DMSO) on -140 ° C: ssa. HLA-A * 02 ilmentymistä PBMC saatu syöpäpotilaiden ja terveiden varmistettiin virtaussytometrillä FITC-leimatun HLA-A * 02 mAb BB7.2 (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA).

Cell Lines

Kaikki rintasyövän solulinjat (MCF-7, CAMA-1, MDA-MB-134VI, MDA-MB-175VII, MDA-MB-361, DU4475, MDA-MB-231, MDA -MB-436, MDA-MB-453, MDA-MB-468), T2-soluja (HLA-A * 02

+ TAP-solulinjaan), eturauhassyövän solulinjoissa (PC3, LNCaP ja DU145), munasarjasyövän solulinja Ovcar-3 ja lymfooman solulinja Jeko-1 hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Munasarjasyöpäsolu solulinjaa Skov-1 [30], [31] oli lahja tri Kunle Odunsi (Roswell Park Cancer Institute, NY, USA); lymfooma solulinjaa L1236 [32], [33] oli lahja Dr. Catherine M. Bollard (Baylor College of Medicine, Houston, USA). Kaikkia solulinjoja pidettiin yllä RPMI-1640-alustassa (Mediatech, Manassas, VA, USA), jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 1% L-glutamiinia ja 1% penisilliiniä ja streptomysiiniä.

Peptidit

Kaksitoista SATB1 peptidejä (taulukko 1) ennustettiin käyttämällä BIMAS (https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/), SYFPEITHI (https://www.syfpeithi.de/), ja Rankpep (https://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html), joka perustuu HLA-A * 02, sitova motiivi. Epitooppeja, jotka ennustivat vähintään kahden näiden algoritmien valittiin lisätestausta varten. Peptidit syntetisoitiin kiinteän faasin menetelmällä käyttäen peptidisyntetisaattoria (AApptec, Inc .; Louisville, KY, USA), puhdistettiin käänteisfaasi-korkean erotuskyvyn nestekromatografia ja validoitu massaspektrometrialla. Syntetisoitu peptidejä liuotettiin DMSO: hon pitoisuutena 10 mg /ml ja säilytettiin -80 ° C: ssa myöhempään käyttöön saakka. Yksi peptidi (SATB1

544-552) jätettiin pois tutkimuksesta johtuu vaikeuksista peptidisynteesin.

In vitro

stimulaatio peptidi-spesifisten T-solut PBMC: eissä

PBMC (1 x 10

5 solua /kuoppa) joko terveillä henkilöillä tai syöpäpotilaiden inkuboitiin vakio peptidin pitoisuuksilla 20 ug /ml per peptidi [34] – [37] 96-kuoppaisille U-pohja mikrolevyillä (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) 200 ul: aan T-solujen väliaine (TCM), joka koostuu RPMI 1640 (Mediatech, Manassas, VA, USA), 10% ihmisen AB-seerumia (Valley Biomedical, Winchester , USA), 50 uM 2-merkaptoetanolia, 100 IU /ml interleukiini-2 (IL-2), ja 0,1 mM MEM ei-välttämätön aminohappo liuos (Invitrogen; grand island, NY, USA). Puolet TCM poistettiin ja korvattiin tuoreella TCM sisältävät peptidit (20 ug /ml), 5 päivän välein. Sen jälkeen, kun 14 päivää viljelyn jälkeen solut kerättiin ja testattiin niiden kyky tuottaa IFN-γ vastauksena T2-solujen (1 x 10

4 solua /kuoppa), jotka on valmiiksi ladattu joko SATB1 peptidi (5 ug /ml) tai kontrollipeptidiä (irrelevantti HLA-A * 02, sitova EBV peptidi: GLCTLVAML) negatiivisena kontrollina. 18 tunnin kuluttua inkubaation supernatantit kerättiin, ja IFN-γ vapautuminen määritettiin ELISA-määrityksellä.

Rapid Expansion Protocol (REP) ja SATB1 peptidi-spesifisten T-solujen

SATB1 peptidi-spesifisten T-solut laajennettiin nopea laajeneminen protokolla (REP) kuten aiemmin on kuvattu [38] pienin muutoksin. Lyhyesti, päivänä 0, 0,1-0,5 x 10

6 SATB1 peptidi-spesifisten T-soluja viljeltiin T25 pullossa 20 ml: lla RPMI-1640, johon oli lisätty 10% ihmisen AB-seerumia, 50 uM 2-merkaptoetanolia, 30 ng /ml OKT3-vasta-aine (Ortho Biotech, Bridgewater, NJ, USA) ja 30 ng /ml anti-CD28-vasta-ainetta (R St. Louis, MO, USA) lisättiin kuoppaa kohti. Kolorimetrinen reaktio pysäytettiin 2 N H

2SO4 ja levyt luettiin 450 nm: ssä käyttäen ELISA-levyn lukijalla.

RNA uuttaminen ja RT-PCR-

RNA ja RT-PCR: llä oli suoritetaan raportoitu aiemmin [39]. Lyhyesti, kokonais-RNA uutettiin syöpäsolujen 1 ml Trizol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Kolme mikrogrammaa RNA: ta käänteistranskriboitiin cDNA: ksi 30 ul: n tilavuudessa ja 1 ui kutakin cDNA: ta käytettiin myöhemmissä PCR-reaktiossa pari SATB1 spesifisiä alukkeita: Aluke 1:5′-TGCAAAGGTTGCAGCAACCAAAAGC-3 ’; 5’-AACATGGATAATGTGGGGCGGCCT-3 ’. GAPDH käytettiin lastaus ohjaus: primer 1:5’-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3 ’; Primer 2:5’-TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT-3 ’. PCR-reaktio toteutettiin seuraavissa olosuhteissa: 95 ° C 1 min, 95 ° C: ssa 40 s, 60 ° C: ssa 30 s, 72 ° C: ssa 40 s, yhteensä 40 sykliä, 72 ° C: ssa 5 min, ja GAPDH ajettiin 25 sykliä. Yhtä suuret määrät PCR-tuotteita ladattiin sitten ja havaittujen geelielektroforeesilla.

Western Blot

Koko solu-uutteet valmistettiin ja ajettiin SDS-PAGE-geeleillä. Proteiinit siirrettiin PVDF-kalvolle (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) ja edelleen inkuboitiin SATB1 vasta-aineella (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). LumiGLO kemiluminesenssisubstraatilla System KPL (Gaithersburg, MD, USA) käytettiin proteiinin havaitsemiseksi.

FACS-analyysi

Solut (0,5 x 10

6) värjättiin joko FITC-anti -CD8, PE-Cy5-anti-CD4 (molemmat eBioscience, San Diego, CA, USA) tai FITC-anti-HLA-A * 02 (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) PBS: ssä, joka sisälsi 2% FBS: ää on jäillä 30 minuutin ajan, ja pestiin sitten kahdesti PBS: ssä. Jälkeenpäin solut suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan PBS: ää ja analysoitiin käyttämällä FACScalibur kone. Sillä DimerX HLA-A * 02: Ig värjäys, SATB1 reaktiivinen CD8

+ T-soluja inkuboitiin puhdistettujen HLA-A * 02: Ig-dimeeri (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) ladattiin tietyn peptidin, ja värjättiin FITC anti-hiiri-lgG1 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Virtaussytometria suoritettiin FACScalibur koneella.

Sytotoksisuusmääritys

SATB1 peptidin spesifisten T-solut testattiin sytotoksisuuden peptidiä ladattu T2-soluja, kaksi HLA-A * 02

+ SATB1

+ syöpäsolulinjoista (Skov-1 ja Jeko-1) ja HLA-A * 02 negatiivinen SATB1

+ PC3 solulinja negatiivisena määräysvalta (LDH) määritys (Promega; Madison, WI, USA). Analyysi suoritettiin noudattaen valmistajan ohjeita. LDH: n vapautuminen laskettiin seuraavalla kaavalla:

Sytotoksisuus (%) = (kokeellinen – efektori spontaani – kohde spontaani LDH: n vapautuminen) /(Target Maximum – Target Spontaani LDH: n vapautuminen) x 100.

Spontaani vapautuminen määritettiin käyttämällä supernatantti kohdesolujen yksinään tai efektorisoluja yksin, ja suurin vapautuminen määritettiin käyttämällä supernatantista kohdesolujen inkuboidaan lyysiliuoksella sisältyy LDH kit.

tilastot

Studentin t-testiä käytettiin analysoimaan määrällisiä eroja koekaivoja ja valvontaa ELISA-määritykset. P 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

SATB1 mRNA ilmentyy Erilaisia ​​Syövät

tutkia SATB1 ilmentyy syöpäsoluissa, mRNA lauseke SATB1 vuonna erilaisten kasvainsolujen suoritettiin RT-PCR: llä. Kuten kuviossa 1 on esitetty, SATB1 mRNA ilmentyy suuresti erilaisia ​​syöpiä, kuten rintasyöpää, munasarjasyöpä, eturauhassyöpä sekä lymfooma. Kun taas normaalin eturauhasen epiteelisolujen linja, PNT1A ei ilmaista SATB1 mRNA.

mRNA ilmaisu SATB1 eri solulinjoissa määritettiin RT-PCR: llä. Rintasyöpä solulinjat (MCF-7, CAMA-1, MDA-MB-134VI, MDA-MB-175VII, MDA-MB-361, DU4475, MDA-MB-231, MDA-MB-436, MDA-MB- 453 ja MDA-MB-468), eturauhasen syöpä (PC) solulinjat (PC3, LNCaP ja DU145), munasarjasyöpä (OC) solulinjoja (Ovcar-3 ja Skov-1), lymfoomåsolulinjojen (Jeko-1 ja L1236 ) ja normaalissa eturauhasessa epiteelisolulinja PNT1A sisällytettiin kontrollina. Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen.

induktio SATB1-johdettu peptidi-spesifisten CTL: ien in terveiltä luovuttajilta

Ensin saadaan PBMC: t 10 HLA-A * 02

+ terveen luovuttajan, onko SATB1-reaktiivinen T-solujen esiasteiden olivat läsnä näissä terveillä koehenkilöillä. Soluja stimuloitiin

in vitro

kaksi viikkoa kunkin SATB1 johdetut peptidit, jotka sisältävät HLA-A * 02-sitova motiivi (taulukko 1). Lopussa peptidin stimulaatio, supernatantteja viljelmistä analysoitiin ELISA havaitsemiseksi IFN-γ vapautumista vasteena T2-soluja pulssitettiin tai ilman niitä peptidejä. Kuten on esitetty taulukossa 2, lähes kaikki 11 SATB1-peptidejä (10/11) kykenivät indusoiva peptidi-spesifisten T-soluvasteiden ainakin yksi terveillä koehenkilöillä. Erityisesti peptidi SATB1

565-574 indusoi korkeamman tason IFN-γ release ( 900 pg /ml) 4 10 terveillä koehenkilöillä, mikä osoittaa sen korkea immunogeenisyys ja mahdollisuuksia laajentaa antigeenispesifisten T-solujen terveillä koehenkilöillä.

läsnäolo SATB1 peptidin Specific CTL syöpäpotilaiden

-analyysi osoitti, että peptidi-spesifisten T-solujen vastaan ​​SATB1

565-574 havaittiin ~ 60% terveillä koehenkilöillä, siksi perusteltu, että CTL esiasteita, jotka voivat tunnistaa tämän peptidin voi olla runsaasti PBMC syöpäpotilailla. Testata hypoteesia, tutkimme onko peptidi SATB1

565-574 voisi aiheuttaa peptidi-spesifisten CTL: ien välillä PBMC HLA-A * 02

+ munasarjasyöpä potilaille. PBMC kolmesta HLA-A * 02

+ munasarjasyöpä potilasta kerättiin ja stimuloitiin

in vitro

peptidillä SATB1

565-574. Kuten on esitetty taulukossa 3, peptidi SATB1

565-574 kykeni indusoimaan peptidi-spesifisten CTL: ien PBMC: istä munasarjasyövän potilailla, mikä osoittaa, että peptidi on erittäin immunogeeninen, ei ainoastaan ​​terveillä henkilöillä, mutta myös syöpäpotilailla. Olemme myös päättäneet, onko tämä peptidi ehdokas voisi aiheuttaa peptidi-spesifisten CTL: ien PBMC: istä HLA-A * 02

+ eturauhassyöpäpotilailla. Samoin kuin munasarjasyövän potilailla, peptidi SATB1

565-574 samoin indusoi peptidi-spesifisten CTL: ien välillä PBMC 5 eturauhassyöpäpotilaalla sekä (taulukko 3), mikä osoittaa CTL esiasteita, jotka tunnistavat tämän peptidin on runsaasti PBMC syöpään potilailla.

SATB1 peptidin indusoima CD8

+ T Cell-riippuvainen Responses

analysoimiseksi edelleen SATB1

565-574 peptidi-spesifisten T-solujen, seuraavan kerran laajennettu SATB1

565-574-peptidi-T-soluja tunnistetaan taulukoissa 2 ja 3, jotta saadaan riittävä määrä näissä soluissa. Tätä varten suoritimme peptidi titrauskokeita määrittää optimaalisen peptidin pitoisuus lastaus T2-soluja T-solu tunnistaa. Kuten kuviossa 2A on esitetty, T2-soluja voidaan herkistää peptidi SATB1

565-574, mutta ei kontrolli EBV-peptidiä T-solu tunnistaa pitoisuutena 0,08 ug /ml, ja sitoutumiskohdat HLA-A * 02-molekyylien T2-solut alkoivat kyllästyä 5 ug /ml. Lisäämällä edelleen pitoisuudet SATB1

565-574 ei lisätä IFN-γ. Siksi olemme johdonmukaisesti peptidin pitoisuus 5 ug /ml esikiristyslaite T2-solujen meidän ELISA-menetelmällä. Laajennettu T-solut pidettiin antigeenispesifisyys ja erittävät merkittäviä määriä IFN-γ stimulaation jälkeen pulssattujen T2-solujen vastaavan peptidien, mutta ei kontrolli-EBV-peptidiä (kuviot 2A ja B). Saadakseen suoria todisteita osajoukkoja vastaamisen T-solujen kuviossa 2B, laajennettu SATB1 peptidireaktiivista PBMC köyhdytettyä joko CD4

+ T-soluja (kuvio 2C) tai CD8

+ T-soluja (kuvio 2D ) ennen inkubointia peptidien ELISA-määrityksissä. Kuten on esitetty kuviossa 2E, CD8

+ T-soluja, ei CD4

+ T-soluja (kuvio 2F), joka on saatu laajennettu PBMC: istä vastasi SATB1

565-574 pulssi T2-soluja, mikä osoittaa, että T-soluvasteen aiheuttama SATB1

565-574 riippui CD8

+ T-soluja. Lisäksi dimerX HLA-A * 02: Ig värjäytymistä (kuvio 2G ja H) ja IFN-γ solunsisäistä värjäystä (kuvio S1) osoittivat myös, että SATB1

565-574 indusoi peptidispesifisten, HLA-A * 02-restriktoituja CD8

+ T-solu-riippuvaista vasteita.

indusoi CD8

+ T-solu-riippuvaista vasteita. Tunnustaminen T2-solujen esiasennetut titrattiin pitoisuuksia peptidejä (0-20 ug /ml) laajensi SATB1

565-574-T-soluja terveiltä luovuttaja # 1 testattiin ELISA-määrityksellä (A). Laajentunut SATB1-reaktiivisen PBMC (B) oli yhdessä inkuboitiin T2-soluja (1 x 10

4 solua /kuoppa) yksin täydellisessä alustassa (CM) tai T2-soluja ladattu valmiiksi joko SATB1

565 -574 (5 ug /ml) tai kontrolli EBV peptidi negatiivisena kontrollina. Soluja inkuboitiin 18-24 tunnin ajan, IFN-γ eritystä supernatantissa määritettiin ELISA-määrityksellä. SATB1-reaktiivinen PBMC: köyhdytettyä CD4

+ T-solut (C) ja SATB1-reaktiivisen PBMC-CD8

+ T-soluja (D) varmistettiin virtaussytometrillä. Tunnustuksista T2-soluja pulssitettiin SATB1

565-574 by SATB1-reaktiivinen PBMC: köyhdytettyä joko CD4

+ T-solut (E) tai CD8

+ T-solujen (F) määritettiin ELISA: lla. SATB1 reaktiivinen CD8

+ T-soluja inkuboitiin puhdistettujen HLA-A2: Ig-dimeeri ladattu ohjaus EBV peptidi (G) tai peptidillä SATB1

565-574 (H), ja värjättiin sitten FITC-anti-hiiri- IgG1. Solut analysoitiin käyttäen FACScalibur kone. Data (A, B, E ja F) esitetään keskiarvoina ± SD. Tulokset edustavat ainakin kolmen erillisen kokeen. *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,001 vs. kontrollit, (T2-soluja yksinään tai T2-soluja pulssi kanssa ohjaus EBV peptidi).

kirjaaminen ja tappaminen syöpäsolujen jonka SATB1 peptidiä CD8

+ T-solujen HLA-I rajoitetulla tavalla

Perustuen meidän tulokset tähän mennessä, SATB1

565-574 CD8

+ T-solut käytettiin seuraavissa kokeissa. Sen määrittämiseksi, onko SATB1 peptidin spesifisten T-solujen pystyivät tunnistamaan ja tappaa HLA-A * 02

+, SATB1 ilmentäviä syöpäsoluja, käytimme HLA-A * 02

– SATB1 mRNA positiivinen eturauhassyövän solulinja PC3 (negatiivisena kontrollina) ja viisi HLA-A * 02

+ SATB1 mRNA positiivisen syöpäsolun linjat. Ekspression SATB1 mRNA näiden 6 solulinjoissa on aiemmin tutkittiin RT-PCR: llä (kuvio 1) ja HLA-A * 02 ilmentyminen varmistettiin virtaussytometrillä (kuvio 3A). Lisäksi olemme myös tarkistanut ilmaus SATB1 proteiinin näistä solulinjoista (kuvio 3B), ja totesi, että kaikki syövän solulinjat ilmensivät SATB1 proteiinin paitsi PC3 ja Ovcar-3. Näin ollen, Ovcar-3 pidettiin myös negatiivisena kontrollina. Kuten on esitetty kuviossa 4A, SATB1

565-574 erityisiä T-solut voivat tunnistaa HLA-A * 02

+ SATB1 ilmentävät Skov-1 ja Jeko-1-soluissa, mutta ei PC3 tai Ovcar-3-soluja. Kaksi muuta HLA-A * 02

+ SATB1 ilmentävien syöpäsolulinjoissa (CAMA-1, MDA-MB-231), voi vasta tunnistaa, kun ne esikäsiteltiin IFN-γ (kuvio 4B), mikä viittaa siihen, että joko tehostettu HLA-A * 02 ilme solujen pinnoilla (kuva S2) tai induktion immunoproteasomien IFN-γ, voivat helpottaa esittämistä oikean epitoopin solujen pintaan T-solujen valvonnan. Sen sijaan normaalit solut, mukaan lukien PNT1A ja autologisia PBMC: itä, ei tunnista SATB1

565-574 erityisiä T-soluja (kuvio 4A). Lisäksi, SATB1

565-574 spesifisten T-solut eivät tunnista in vitro-eriytetty Th subsets, mukaan lukien Th1, Th2 ja Th17 soluja (kuvio S3).

(A) Soluja värjättiin FITC -anti-HLA-A * 02 PBS: ssä, joka sisälsi 2% FBS: ää. Sitten solut pestiin ja suspendoitiin uudelleen PBS: ään ja analysoitiin käyttämällä FACScalibur kone. (B) ekspressio SATB1 proteiinin eri kasvainsolujen määritettiin western blot. Aktiini käytettiin latauskontrollina.

(A) SATB1

565-574 spesifisten T-solujen terveestä luovuttajasta # 1 viljeltiin yksin keskipitkällä tai yhdessä inkuboitiin erilaisten kasvainten solut samoin kuin normaalit solut (PNT1A ja PBMC); (B) Kasvaimen solut esikäsiteltiin ilman tai IFN-γ (10 ng /ml) 48 tuntia ennen inkuboinnin SATB1

565-574 spesifisten T-solujen. SATB1

565-574 spesifisten T-soluja viljeltiin pelkässä alustassa negatiivisena kontrollina (punainen sarake); Estää HLA-riippuvainen vasteet, joko anti-HLA-I-mAb (W6 /32) tai HLA-II-mAb lisättiin soluviljelmiin aikana inkuboinnin SATB1

565-574 spesifisten T-solujen kanssa Skov-1 (C) tai Jeko-1-soluissa (D). Soluja inkuboitiin 18 -24 tunnin ajan, IFN-γ eritystä supernatantissa määritettiin ELISA-määrityksellä. SATB1

565-574 CD8

+ T-solut testattiin sytotoksisuuden T2-soluja pulssitettiin kanssa tai ilman peptidejä (E), Skov-1 (F) ja Jeko-1 (G), jonka LDH-määritystä. HLA-A * 02 negatiivinen PC3-soluja käytettiin negatiivisena kontrollina LDH määrityksessä. Data A-G piirretään keskiarvoja ± SD. Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen. *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,001 verrattuna kontrolleihin.

sen määrittämiseksi, onko tunnustamista syöpäsolujen SATB1

565-574 CD8

+ T-solujen oli HLA-I rajoitettu, yhteisrahoittaisimme viljellyt SATB1

565-574 erityisiä T-soluja joko Skov- 1 tai Jeko-1-soluja, kun läsnä oli joko anti-HLA-I-mAb (W6 /32) tai anti-HLA-II mAb. Kuten on esitetty kuviossa 4C ja D, T-solujen vasteita esti täydellisesti lisäämällä anti-HLA-I-mAb, mutta ei anti-HLA-II (HLA-DP mAb), mikä viittaa siihen, että tunnustamista kasvainsolujen SATB1

565-574 CD8

+ T-solujen on HLA-I rajoitettu.

edelleen tutkia SATB1

565-574 CD8

+ T-solut pystyivät tappamaan HLA-A * 02

+, SATB1 ilmentäviä syöpäsoluja, teimme sytotoksisuusmäärityksiä. Kuten on esitetty kuviossa 4E, SATB1

565-574 spesifisten T-solujen tappoi T2-soluja pulssitettiin SATB1

565-574, mutta ei T2-soluja yksinään tai niitä pulssitettiin ohjaus EBV-peptidiä. Tärkeää on, SATB1

565-574 spesifisten T-solujen pystyivät tappamaan HLA-A * 02

+, SATB1 ilmentävät Skov-1 ja Jeko-1-soluissa, mutta ei HLA-A * 02

– PC3 soluja (kuvio 4F ja G). Nämä tulokset viittaavat siihen, että SATB1

565-574 erityinen T-solut tunnistavat T-soluepitoopin, joka endogeenisesti prosessoidun ja tarjolla olevan kasvainsolujen.

Keskustelu

On vakiintunut, että CD8

+ T-solut on kriittinen rooli säätelyssä kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen. Peptidiepitoopit, jotka ovat peräisin TAA voidaan tunnistaa antigeeneinä T-solujen yhteydessä MHC-I-molekyylit [40], [41]. Tunnistaminen ihanteellinen TAA: iden ja niiden peptidejä, jotka T-solut tunnistavat ovat välttämättömiä kehittää tehokkaita syövän rokotteita. Ihanteellinen ita kuten anti-apoptoottiset proteiinit [14], telomeraasia [12] ja surviviinista [13], on joko pakollinen tuumorikasvulle /selviytyminen, voi edustaa optimaalista tavoitteita rokotteen välittämän syövän immunoterapiassa. SATB1 ilmentyy erittäin monissa eri ihmisen syövissä ja ylös-säätely SATB1 ilmaisu on oleellisen tärkeää tuumorin eloonjäännin ja etäpesäkkeiden, siten SATB1 edustaa yksi tällainen ihanteellinen TAA: iden.

tavoitteena olevassa tutkimuksessa oli tunnistaa HLA -A * 02 sitova SATB1 johdettujen epitooppien tunnistavat CD8

+ T-solujen PBMC terveiden koehenkilöiden ja syöpäpotilailla. Kaksitoista SATB1 peptidit ennustettiin käyttämällä BIMAS, SYFPEITHI, ja Rankpep perustuu HLA-A * 02, sitova motiivi. Peptidejä, jotka ennustivat vähintään 2 3 ohjelmat valittiin lisätestejä niiden kyky stimuloida PBMC terveillä koehenkilöillä ja /tai syöpäpotilaille. Lisäksi tutkimukset osoittivat, että 10: ssä 11 syntetisoitiin SATB1 peptidit kykenivät indusoiva peptidi-spesifisten T-soluvasteiden vähintään yksi 10: terveillä koehenkilöillä. Erityisesti SATB1

565-574 havaittiin indusoivan korkeampi IFN-γ release ( 900 pg /ml) 4 10 Terveillä henkilöillä, mikä osoittaa, että tämä peptidi voi olla immunogeeninen ja mahdollisesti pystyy laajentamaan antigeeniä T-soluja terveillä koehenkilöillä. Lisäksi SATB1

565-574 indusoi usein spesifisten T-solujen vasteita PBMC munasarjasyöpää sairastavilla potilailla sekä PBMC eturauhassyöpäpotilailla. Tärkeää on, SATB1

565-574-peptidi-T-solujen tunnustettu ja tappoi HLA-A * 02

+ SATB1 ilmentävien Jeko-1, Skov-1-soluja samoin kuin IFN-γ-käsitelty rintasyövän solulinjoissa ( CAMA-1 ja MDA-MB-231), mikä viittaa siihen, tämä peptidi on luonnollisesti käsitellyt syöpäsolut.

SATB1 on maailmanlaajuinen chromatin järjestäjä ja transkriptiotekijä ja on tullut avaintekijä integroimalla korkeamman asteen chromatin arkkitehtuuri geenisäätelyn [42]. SATB1 edistää kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden kohdentamalla kromatiinin organisaatio ja transkription profiileja, ja on erittäin ilmaistaan ​​erilaisia ​​syöpiä, kuten rintasyöpää [18], kurkunpään okasolusyöpä [19], endomet- kohdun limakalvon syöpä [20], maksasyövän [21] , peräsuolen syöpä [22], ihon pahanlaatuisen melanooman [23], mahasyöpä [24], [25], munasarjasyöpä [26], eturauhassyöpä [27], keuhkosyöpä [28] ja gliooma [29]. Kasvainsoluissa, joilla on korkea SATB1, geenejä, jotka edistävät kasvaimen etenemisen ja etäpesäkkeiden oli säädelty, kun taas geenejä, jotka estävät kasvaimen etäpesäke oli tukahdutettu [17]; kun taas hiljentäminen of SATB1 vähentänyt invasiivisen ja metastaattisen kapasiteetti syöpäsolujen [43].