Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tutkimusasetelma

Tutkiakseen erityisiä mekanismeja, joilla Golgi fosfoproteiini 3 (GOLPH3) vaikuttaa etenemisen mahasyövän ja tutkia sen kliinistä merkitystä.

Methods

immunohistokemiallinen analyysiä käytettiin arvioimaan korrelaatioita GOLPH3, fosforyloidun mTOR (p-mTOR), fosforyloitu Akt (p-Akt) fosforyloitu p70S6 (p-p70S6), fosforyloitu 4E-BP1 (p-4E-BP1) sekä kliinis-mahasyövän. MRNA ekspressiotasot GOLPH3, mTOR, Akt, p70S6 ja 4E-BP1 mahasyövän, kohdunkaulan läheisen ja pariksi normaalia kudosta analysoitiin RT-PCR. Western blotting käytettiin määrittämään proteiinin ilmentymistä GOLPH3, p-mTOR, p-Akt, p-p70S6 ja p-4E-BP1 kudoksissa.

Tulokset

korkea ekspressio proteiinin tasot GOLPH3, p-AKT, p-mTOR, p70S6, p-4E-BP1 positiivisesti liittynyt histologisia luokan (

p

0,05), syvyys invaasio (

p

0,05 ), kaukainen etäpesäke (

p

0,05) ja imusolmukkeesta osallistuminen (

p

0,05). Verrattuna syöpä läheisen ja pariksi normaaleissa kudoksissa, mRNA ekspressiotasot GOLPH3, AKT, mTOR, p70S6 ja 4EBP1 mahasyövän kudoksissa olivat huomattavasti korkeammat. Proteiinin ekspressiotasot GOLPH3, p-AKT, p-mTOR, p-p70S6 ja p-4E-BP1 mahasyövän kudoksiin oli myös merkittävästi korkeampi kuin carcinoma vieressä ja pariksi normaaleissa kudoksissa. Vahva positiivinen korrelaatio havaittiin välillä GOLPH3, p-mTOR, p-p70S6 ja p-4EBP1 lauseke (

r

= 0,410, 0,303 ja 0,276, vastaavasti,

p

0,05), mutta mitään merkittävää korrelaatiota ilmentymisen GOLPH3 ja p-Akt havaittiin.

päätelmät

GOPLH3 ekspressiotaso korreloi Akt /mTOR-signaloinnin ihmisen mahasyövän näytteitä. GOLPH3 yhdistettynä Akt /mTOR signalointi aktivointi voi olla tärkeä rooli kehityksen, erilaistumisen, invaasiota ja etäpesäkkeiden mahasyövän.

Citation: Peng J, Fang Y, Tao Y, Li K, Su T, Nong Y, et ai. (2014) Mekanismit GOLPH3 Associated kanssa Progression mahasyövän: esiselvitys. PLoS ONE 9 (10): e107362. doi: 10,1371 /journal.pone.0107362

Editor: Yuan-Soon Ho, Taipei Medical University, Taiwan

vastaanotettu: 13 kesäkuu 2014; Hyväksytty: 07 elokuu 2014; Julkaistu: 06 lokakuu 2014

Copyright: © 2014 Peng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki tiedot ovat saatavilla käsikirjoituksen ja lukuja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee Research Foundation Guangxin Health asianmukainen tekniikka ja kehityshanke (Grant numero: S201415-01). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Vaikka maailmanlaajuiset tilastot osoittavat, että mahasyövän (GC) on neljänneksi yleisin syöpä miehillä ja viidenneksi yleisin syöpä naisilla, kuolleisuutta mahasyövän toisella sijalla vain keuhkosyövän [1]. Maailmanlaajuinen esiintyvyys mahasyövän on laskenut toisen maailmansodan jälkeen [2]. Kuitenkin kehitysmaissa, kuten Kiinassa, sairastavuus ja kuolleisuus mahasyövän ovat pysyneet korkealla. Mahalaukun syövän hoito on parantunut viime vuosina, mutta useimmat potilaat ovat yhä diagnosoitu edennyt mahasyöpä, usein myös invaasio ja etäpesäkkeiden, mikä epätyydyttävä hoidon vaikutus hintaan. Koska mahasyövän uhkaa merkittävästi ihmisten terveydelle ja elämän, on tärkeää ymmärtää patogeneesiin mahasyövän prosessissa tumorigeneesin, invaasio ja etäpesäkkeiden ohjata varhainen diagnoosi ja hoito.

On yleisesti hyväksytty, että kasvaimen muodostumisen liittyy misregulation lukuisia onkogeenien, kasvaimen synnyssä ja etäpesäkkeiden liittyvien geenien Golgi fosfoproteiini 3 (GOLPH3), joka tunnetaan myös nimellä GPP34, GMx33 tai MIDAS, on 34-kD: n membraaniproteiini, joka alun perin tunnistettiin hiiren Golgin laite, proteomiikka-analyysi [3]. GOLPH3 kuuluu Golgin matriisiin proteiini perhe, joka on erittäin konservoitunut hiivasta ihmiseen [4]. Sen jälkeen GOLPH3 on modifioitu translaation, se on dynaamisesti kytketty negatiiviseen Golgin matriisi, nopeasti kuljetetaan trans-Golgi verkon (TGN) sytoplasmaan, ja jaettiin solukalvon vesikkelit ja endokriinisten solujen [4]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että GOLPH3 on mukana anterogradista ja taaksepäin Golgin kaupan, reseptorin kierrätystä, ja glykosylaatio Golgin laitteesta plasmamembraaniin; GOLPH3 myös tärkeä rooli solun tukirangan vuorovaikutusta ja ylläpidosta Golgin rakenteen [4] – [7]. Scott et ai. Ensimmäinen tunnistettu kasvaimia synnyttävän roolia GOLPH3 paljastamalla sen tärkeässä osassa kasvaimen solujen erilaistumiseen ja lisääntymistä ja sen läsnäolo monissa kiinteiden syöpien [8]. Mielenkiintoista, jotkut tutkimukset ovat ehdottaneet, että GOLPH3 säätelee syöpäsolut tehostamalla nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) aktiivisuus. mTOR on seriini /treoniini proteiinikinaasi, ja keskeinen integraattori fosfatidyyli-inositoli-3-kinaasi (RTK-PI3K) reittien tiedetään säätelevän solujen kasvua, lisääntymistä, ja selviytyminen ihmisen syöpäsoluja [9] – [10]. Monet tutkimukset tutkivat parhaillaan välistä suhdetta GOLPH3 ja useat kiinteiden syöpien kuitenkaan ole riittävästi todisteita, jotka tukevat oletusta, että GOLPH3 ilmentyminen liittyy ihmisen mahasyövän etenemisen ja ennusteen, ja mekanistinen perusta, jolla GOLPH3 vaikuttaa kasvaimen kehittymisen, invaasio ja etäpesäke mahasyövän jää epäselväksi. Tässä tutkimuksessa selvitimme kliininen merkitys suuri GOLPH3 ja AKT /mTOR signalointia mahasyövässä. Samalla olemme löytäneet suhde GOPLPH3 ja Akt /mTOR signalointi mahasyövän paljastaa mahdollista roolia GOLPH3 säätelyssä mTOR välittämän mahasyövässä kasvainten synnyssä, invaasio ja metastaasi.

Materiaalit ja menetelmät

Eettinen lausunto

Kaikki tutkimuksessa menettelyjä tarkistettiin ja hyväksyttiin Institutional eettinen Review Board ensimmäisen Affiliated sairaalan Guangxi Medical University ja johdetaan periaatteiden mukaisesti ilmaistu Helsingin julistus. Tietoon perustuva suostumus vapautettiin hallituksen johtuen tuoreet näytteet käsitellään ja nimettömiksi mukaan eettisiä ja oikeudellisia normeja.

kudosnäytteitä ja kliinisten tietojen valinta

tuore kudosnäytteitä kerättiin kahdeksankymmentä potilaiden mahalaukun syöpä, joille tehtiin kirurginen hoito First Affiliated sairaalan Guangxi Medical University aikana tammikuusta 2012 tammikuuta 2013. syöpä ja syöpä-viereisten kudosten (3 cm etäisyydellä syöpä) ja pariksi normaaleissa kudoksissa saatiin kunkin potilaan , ja potilas oli diagnosoitu itsenäisesti kaksi kokenutta patologit mukaan American sekakomitean Cancer kriteerien [11]. Täydellinen alkuperäinen kliiniset tiedot olivat käytettävissä potilaiden diagnosoitu mahalaukun syöpä. Ryhmässä oli mukana 36 naista ja 44 miehiä, joiden keski-ikä on 55,4 ± 13,1 vuotta (vaihteluväli 27-75 vuotta). Muita potilasryhmät on esitetty taulukossa 1, taulukossa 2 ja taulukossa 3. Potilaat, jotka saavat kemoterapiaa tai sädehoitoa ennen leikkausta tai jotka olivat aiemmin muita kasvaimia ulkopuolelle. Seuraavissa tutkimuksissa, osa näytteestä otettu leikkauksen aikana välittömästi pikajäädytettiin nestemäisessä typessä ja sen jälkeen säilytettiin -80 ° C: ssa, ja osa on vahvistettu 10% puskuroituun formaliiniin 24 tuntia ja upotettiin parafiiniin.

immunohistokemia

parafinoidut näytteet leikattiin 3-pm paksun osastoja cancerous, karsinooma-vieressä, ja pariksi normaali kudosnäytteistä ja asennettu lasi dioja. Osat alun perin paistettiin 65 ° C: ssa 2 tuntia. Sitten leikkeet parafiini 100% ksyleeniä ja niihin lisätään laskeva etanolissa (100%, 90%, 80%, ja 70% etanolia) ja tislattua vettä standardimenetelmien mukaisesti. Tämän jälkeen osat liotettiin sitraatti antigeenisen haku puskuria, kuumennettiin autoklaavissa, ja sen annettiin jäähtyä huoneen lämpötilaan. Sen jälkeen, kun leikkeet pestiin PBS: ssä kolme kertaa viiden minuutin ajan, 3% vetyperoksidia, lisättiin endogeenisen peroksidaasin salpaamiseksi aktiivisuuden ja ei-antigeenin sitova huoneenlämpötilassa 20 min. Pesun jälkeen jälleen PBS: llä, leikkeitä inkuboitiin, jossa spesifisen vasta-aineen kosteassa kammiossa yön yli 4 ° C: ssa. Seuraavat ensisijaiset vasta-aineita käytettiin: GOLPH3 vasta-aineen 1:100, p-mTOR-vasta-aineen 1:200, p-Akt-vasta-aineen 1:200, p-p70S6 vasta-aineen 1:100, ja p-4E-BP1 vasta-aineen 1 :200. Sillä negatiivinen kontrolli, ensisijainen vasta-aine korvattiin PBS: llä, ja jäljellä olevat vaiheet suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu. Sitten näytteet pestiin PBS: llä, ja polymeeriä vahvistava aine lisättiin osissa huoneenlämmössä 20 min. Pesun jälkeen kudosleikkeet käsiteltiin HRP-leimatun vuohen anti-kani-IgG, biotinyloitu anti-kani-immunoglobuliinia, ja streptavidiini-peroksidaasikompleksin reagenssia 30 min. Sitten leikkeitä visualisoida tuoreeseen 3-3 ”diaminobentsidiini ratkaisu, hematoksyliinillä vastavärinä, ja 0,1% suolahappoa (tukeen värierottelu). Lopuksi levyt asetettiin vapaalla ikenet ja analysoitiin kirkkaan kentän mikroskoopilla.

aste immunovärjäyksen Kunkin kudoksen osassa arvioitiin itsenäisesti kaksi kokenutta patologit jotka olivat sokea potilaiden kliiniset tiedot. Proteiinin ekspressiotasoja arvioitiin käyttäen semi-kvantitatiivinen pisteytys, joka perustuu kokonaisprosenttiosuus positiivisesti värjättyä kasvainsolujen ja värjäytymisen intensiteettiä. Prosenttiosuus positiivisesti värjäytyneiden solujen pisteytettiin seuraavien kriteerien: 0 (≤5% positiivisia kasvainsoluja värjätty), 1 (6-25% positiivisia kasvainsoluja värjätty), 2 (26-50% positiivisia kasvainsoluja värjätty), 3 (≥51% positiivisia kasvainsoluja värjätty). Värjäytymisintensiteettiä oli pisteytetty asteikolla 0-3 seuraavasti: 0 (ei värjäystä), 1 (heikko värjäystä = vaaleankeltainen), 2 (kohtalainen värjäytyminen = kelta-ruskea), 3 (voimakas värjäytyminen = ruskea). Analyysia varten yhteenlaskettu tulokset 4 määriteltiin heikkoa ilmentymistä, ja tulokset ≥4 määriteltiin korkea ilme.

RT-PCR

Kokonais-RNA eristettiin tuoreesta kudoksista käyttämällä TRIzol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. RT-PCR-alukkeita käytettiin tutkimuksessa suunniteltiin ja syntetisoitiin Shanghai Sangon Biological Engineering Services Co Ltd β-Actin käytettiin sisäisenä viitteenä. Tiedot alukesekvensseissä käytettiin tutkimuksessa on esitetty taulukossa 4. RT-PCR suoritettiin käyttäen kaksivaiheista menetelmää. Yksi mikrogramma kokonais-RNA: ta käänteistranskriboitiin cDNA: ksi 37 ° C: ssa 60 min ja 85 ° C: ssa 5 s. Sen jälkeen suoritettiin PCR mukaisesti seuraavissa olosuhteissa: kuumennus 95 ° C: ssa 5 min; 40 sykliä denaturointi 30 s 95 ° C: ssa, pariuttaminen 60 ° C: ssa 30 s, ja pidennys 30 s 72 ° C: ssa; ja lopullinen pidennys 72 ° C: ssa 7 minuuttia ennen kuin reaktio säilytettiin 4 ° C: ssa. Seitsemän mikrogrammaa lopullisen PCR-tuotteen ladattiin 2% agaroosigeelissä Sähköforeesilaitteet ja kuvantamisen analyysi ultraviolettivalossa. Määrä-One ohjelmisto (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) käytettiin mittaamaan bändejä ja β-aktiini harmaata sävyä PCR-tuotteiden.

Western blotting

cancerous, karsinooma läheisen ja pariksi normaali kudosnäytteitä punnittiin ja jauhettiin pieniksi paloiksi nestemäisessä typessä. Pre-jäähdytetty PBS: ää käytettiin pestä näytteitä, jotka sentrifugoitiin sitten 5000 rpm: ssä 4 ° C: ssa 5 min. Kun oli pesty kolme kertaa PBS: llä, ennen jäähdytetty fosfaatti hajotuspuskuria ja PMSF lisättiin. Näyte sonikoitiin 180 W 4 ° C: ssa 5 minuuttia ja sentrifugoitiin 1000 rpm 4 ° C: ssa 5 min; supernatantti sitten välittömästi poistettiin, ja proteiinipitoisuus kvantifioitiin Bradfordin menetelmällä käyttäen kaupallista pakkausta ostettiin Bio-Rad Laboratories. Supernatantit sekoitettiin latauspuskurilla ja keitettiin 100 ° C: ssa 5 min denaturoimiseksi proteiineja. Yhtä suuret määrät kutakin näytettä ladattiin kuoppiin 4-12% natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelillä, elektroforeesi ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi kalvo. Membraani blokattiin 5% BSA-puskurissa 1 tunti ravistellen ja inkuboitiin sitten 4 ° C: ssa yön yli yksittäisten primaaristen vasta-aineiden laimennettu TBST: ssä. Seuraavat ensisijaiset vasta-aineita käytettiin: polyklonaalinen kaniinin anti-ihmisen GOLPH3 (1:1000, Abcam plc, Cambridge, UK), kanin polyklonaalista anti-ihmis-p-p70S6 (Thr389) (1:1000, Cell Signaling Technology, Inc. Beverly, MA, USA), kanin polyklonaalista anti-ihmis-p-Akt (Ser473) (1:1000, Cell Signaling Technology, Inc. Beverly, MA, USA), monoklonaalinen kanin anti-humaani p-mTOR (Ser2448) (1:1000, Cell Signaling Technology, Inc. Beverly, MA, USA) ja monoklonaaliset kanin anti-humaani p-Akt (1:1000, Cell Signaling Technology, Inc. Beverly, MA, USA). Membraani pestiin sitten TBST: llä viisi kertaa viiden minuutin ajan kutakin, ja piparjuuren peroksidaasiin konjugoitua vuohen anti-kani-IgG sekundääristä vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, SC-2004) lisättiin ennen inkubointia huoneenlämpötilassa 1,5 tuntia ravistellen. β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. Pesun jälkeen TBST kolme kertaa viiden minuutin ajan, kaistalla havaittiin käyttämällä ECL prime Western blotting Kit (Shanghai Pufei Biotechnology, Shanghai, Kiina), ja määrä Yksi analyysin ohjelmisto (Bio-Rad, CA, USA) käytettiin arvioimaan densitometrian tiedot.

tilastolliset analyysit

Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttämällä Statistical Package for Social Sciences, versio 17,0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). RT-PCR: llä ja Western blot tulokset esitetään keskiarvona ± SE. Yksisuuntainen ANOVA seurasi LSD usean kantaman testejä käytettiin analysoimaan eroja ryhmien. Väliset suhteet GOLPH3 ja p-mTOR, p-Akt, p-4E-BP, ja p-p70S6 ekspressiotasot arvioitiin käyttämällä Pearsonin korrelaatiokerrointa. Liitot välinen proteiinin ilmentymisen ja kliinis muuttujia analysoitiin käyttäen chi-neliön testi. P 0,05 (kaksisuuntainen) käytettiin tilastollisen merkitsevyyden.

Tulokset

väliset suhteet kliinis muuttujien ja proteiinin ekspressiotasot immunohistokemiallisesti

immunohistokemiallinen tunnistus osoittivat, että GOLPH3, p-Akt, ja p-4E-BP1 olivat yleisimpiä sytoplasmassa, ja fosforyloitu m-TOR (p-mTOR) oli myös läsnä tumassa alhaisella tasolla. Kuitenkin p-p70S6 värjäytyminen havaittiin vain sytoplasmassa. GOLPH3 ja fosforyloitu Akt /mTOR-reitin proteiinit korkeammin ilmaistu mahasyövän ryhmässä kuin para-karsinooma kudoksen ja pariksi normaali limakalvo ryhmissä (kuvio 1, taulukko 5). Lisäksi väliset suhteet kliinis muuttujien ja proteiinin ilmentymiseen tutkittiin ja on esitetty yhteenvetona taulukossa 1, taulukossa 2 ja taulukossa 3. tilastollinen analyysi paljasti, että positiivinen ilmaus määrä GOLPH3 mahalaukun syövän ryhmä korreloivat voimakkaasti histologinen arvosana (

p

= 0,011), syvyys invaasio (

p

= 0,007), kaukainen etäpesäke (

p

= 0,002), ja imusolmukkeesta osallistuminen (

p

0,004), kun taas se ei merkittävästi korreloi iän tai sukupuolen (

p

= 0,801 ja 0,833, tässä järjestyksessä). Mielenkiintoista, korkeat ekspressiotasot p-Akt, p-mTOR, p-4E-BP1 ja p-p70S6 havaittiin olevan yhdenmukaisia ​​korkea GOLPH3 ilme.

V: mahasyöpä ryhmä B: Tällä karsinooma -adjacent kudosryhmässä C: Parilliset normaali kudos ryhmä. Edustavia kudosleikkeiden päässä mahasyövän ryhmä (n = 80), karsinooma-viereiseen kudokseen ryhmä (n = 80) ja yhdistetty normaalia kudosta (n = 80). Immunohistokemia tulokset osoittivat, että GOLPH3, p-Akt, p-mTOR ja p-4E-BP1 oli eniten ilmaistaan ​​tumaan, p-p70S6 on eniten ilmaistu sytoplasmassa. GOLPH3, fosforyloitu Akt-mTOR-signalointireitin, p-4E-BP1 ja p-p70S6 olivat erittäin ilmaistaan ​​mahasyövässä ryhmissä.

mRNA ilmaus GOLPH3 ja mTOR signalointireitin liittyviä geenejä RT-PCR:

uutetaan RNA: ta mahasyöpä, para-karsinooma kudosta, ja vastaaviin normaaleihin kudosnäytteitä kahdeksankymmentä potilailla, joilla on mahalaukun syöpä. Ilmentymistasojen GOLPH3 ja mTOR-signalointireitin liittyviä geenejä, mukaan lukien Akt, mTOR, eukaryoottinen translaation aloituksen tekijä 4E sitova proteiini 1 (4E-BP1), ja p70 ribosomaalinen proteiini S6-kinaasi (p70S6), arvioitiin kolmen ryhmän RT -PCR. Ilmaisu tasot näiden geenien mahakarsinoo- olivat korkeampia kuin syöpä-viereisten kudosten ja huomattavasti korkeampi kuin pariksi normaaleissa mahan kudoksissa. Keskimääräinen tiheys ja ilmentymisen jakautuminen GOPLH3, mTOR, Akt, 4E-BP1 ja p70S6 on esitetty kuviossa 2. Tilastollinen analyysi paljasti, että ekspressiotasot GOLPH3 ja mTOR-signalointireitin liittyvät geenit olivat merkittävästi erilaisia ​​eri mahan kudoksissa (

p

0,05).

syöpä: mahalaukun syöpä (n = 80); paracancerous: Tällä paracancerous kudos ryhmä (n = 80); normaali: Parilliset normaali mahan limakalvon ryhmä (n = 80). A, B, C, D ja E: mRNA-tasot on GOPLH3, Akt, mTOR, 4E-BP1, p70S6 eri mitattiin RT-PCR: llä, vastaavasti. F, G, H, I ja J: densitometrinen määrällinen GOLPH3, Akt, mTOR, 4E-BP1 ja p70S6 mRNA: n ilmentymisen eri kudoksissa, vastaavasti. MRNA: n ilmentyminen oli merkitsevästi erilainen toistensa kanssa ja saavutti syöpään. Tiedot esitetään keskiarvona ± SE. *

p

0,05 versus syöpä,

#

p

0,05 versus paracancerous.

Proteiinin ilmentymistä GOLPH3 ja mTOR signalointireittiin liittyviä proteiineja Western blottauksella

Western blotting-analyysi osoitti, että GOLPH3, p-mTOR, p-Akt1, p-4EB-P1 ja p-p70S6 myös ilmaistu mahasyövän, kohdunkaulan läheisen ja pariksi normaali mahan limakalvoa ryhmiä. Mielenkiintoista, progressiivinen kasvu havaittiin keskiarvot edellä mainitun proteiinin ilmentymisen tasoja pariksi normaalista mahalaukun limakalvon ryhmässä ja mahasyövän ryhmään (kuva 3), ja siellä oli merkittävä ero ryhmien välillä (

p

0,05).

V: proteiini tasot GOPLH3, p-Akt, p-mTOR, p-4E-BP1 ja p-p70S6 eri mitattiin western blottauksella. B, C, D, E ja F: Tällä GOPLH3, p-Akt, p-mTOR, p-4E-BP1 ja p-p70S6 proteiinin tasot eri kudoksissa, vastaavasti. syöpä: Mahalaukun syöpä (n = 80); paracancerous: Tällä paracancerous kudos ryhmä (n = 80); normaali: Parilliset normaali mahan limakalvon ryhmä (n = 80). Tiedot esitetään keskiarvona ± SE. *

p

0,05 versus syöpä,

#

p

0,05 versus paracancerous.

väliset korrelaatiot ilmaus GOLPH3 ja signalointi signalointi reittiin liittyvät proteiinit

Pearsonin korrelaatio analyysi paljasti voimakkaan korrelaation GOLPH3 ilmaisun ja että signalointireitin (taulukko 6). Tilastollinen analyysi osoitti, että Pearson tulomomenttikorrelaatioanalyysia kertoimet olivat kaikki positiivisia mahasyövän ryhmä. Mielenkiintoista, GOLPH3 ilmentyminen oli voimakkaasti yhteydessä p-mTOR, p-4E-BP1 ja p-p70S6 (

r

= 0,410, 0,203 ja 0,128, vastaavasti,

p

0,05) ilmaisu ja positiivinen korrelaatio GOLPH3 ja p-Akt oli lähes merkitsevä (

p

= 0,054). Samaan aikaan, vahva korrelaatio välillä havaittiin ekspression p-4E-BP1 ja edellä mainittujen proteiinien kanssa, lukuun ottamatta p-mTOR. Fosforyloituu mTOR ilmentyminen myös korreloi positiivisesti p-Akt ilmentymistä (

r

= 0,521,

p

= 0,027). Fosforyloitua p70S6 ekspressio korreloi myös ilmentymisen p-Akt (

r

= 0,274,

p

0,001) ja p-mTOR (

r

= 0,451,

p

= 0,007).

keskustelu

Vaikka esiintyvyys mahasyövän on vähentynyt viime vuosina [2], on yhä vakava uhka ihmisten terveydelle . Useimmat mahasyöpäpotilaista diagnosoidaan edenneessä vaiheessa ja taipumus esiintyä kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden. Kuluneen vuosikymmenen aikana, ei suuria parannuksia on saatu aikaan varhaiseen diagnosointiin ja hoitoon mahalaukun syövän. Ymmärtäminen molekyylibiologian taustalla mahasyövän puuttuu edelleen. Vuodesta 2009 GOLPH3 on saanut paljon huomiota kuin onkogeeni. Tämä proteiini paikantuu sytoplasmisen kasvot trans-Golgin ja on ollut tiiviisti mukana kasvainten muodostumiseen [3], [8]. Suuret tutkimuksissa on havaittu, että GOLPH3 yliekspressio esiintyy useissa ihmisen syövissä, mukaan lukien munasarjan epiteelin karsinooma, munuaissolukarsinooma, glioblastooma, ruokatorven okasolusyöpä, ja suun kielen syöpä [12] – [16]. Tutkimusten mukaan GOLPH3 on mukana kasvainten synnyssä ja korreloi huonon ennusteen. Lisäksi yksi tutkimus kertoo, että GOLPH3 yliekspressio liittyy huono kliinistä tulosta mahasyövistä [17]. Kuitenkin tarkka mekanismeista tämän suhteen ovat epäselviä, ja tarkka molekyylipaino mekanismi, jolla GOLPH3 on mukana mahasyövän tuumorigeneesiin, invaasio ja metastaasi on huonosti ymmärretty. Tutkia mahdollisuuksia molekyylitason mekanismi, jonka GOLPH3 osallistuu mahasyövän, ensin käytetään immunohistokemia paikantaa GOLPH3 sen erilaisissa mahalaukun kudoksissa. Olemme havainneet, että GOLPH3 oli pääasiassa paikallisia sytoplasmaan, ja se ilmaistiin mahalaukun syövän, para-karsinooma ja pariksi normaaleissa mahan kudoksissa. Mielenkiintoista, hinnat korkeat GOLPH3 ilmaisun olivat 75,00% (60 out of 80) mahasyövän kudoksissa, 43.75% (35 out of 80) in carcinoma-viereisten kudosten ja 12,50% (10 out of 80) normaaleissa kudoksissa, vastaavasti ( Taulukko 5). Lisäksi GOLPH3 yli-ilmentyminen havaittiin mahasyövässä kudosten ja oli erittäin liittyvät mahasyövän invaasiota ja etäpesäkkeiden. Tuloksemme ehdotti, että korkea GOLPH3 ilmentyminen merkitsevästi liittyvät histologiset grade (

p

= 0,015), syvyys invaasio (

p

0,001), imusolmuke etäpesäke (

p

0,001), ja kaukainen etäpesäke (

p

= 0,006) mahasyövän kudoksissa (taulukko 1). Lisäksi Western blotting ja RT-PCR suoritettiin arvioimaan GOLPH3 ilmentymisen proteiinin ja mRNA-tasoja. Mielenkiintoista on, että tulokset olivat samanlaisia ​​kuin havaittiin immunohistokemiallisella analyysillä. Edellä esitetyt havainnot osoittavat, että lisääntynyt GOLPH3 ilmentyminen liittyy läheisesti esiintyvyys mahasyövän, ja GOLPH3 voi olla mukana mahasyövän ja metastaasit.

Viime aikoina yhä useammat signaalitransduktioreaktioteiden on raportoitu osallistuvat kasvaimen invaasion ja metastaasin. Nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR), joka on seriini /treoniini-kinaasi alavirtaan fosfatidyyli-3-kinaasi (PI3K) /Akt-signalointireitin ja sisältää mTORC1 (mTOR /RAPTOR) ja mTORC2 (mTOR /RICTOR), säätelee proteiinisynteesiä, solujen leviämisen, solujen aineenvaihduntaa ja erilaistuminen [18], [19]. Aktivoidut mTORC1 peräkkäin suoraan aktivoi alavirran tavoitteita, mukaan lukien p70S6 kinaasi (S6K) ja eukaryoottien initiaatiofaktoria 4E-sitovan proteiinin 1 (4E-BP1), ja mTORC2 on osoitettu olevan keskeinen rooli Akt fosforylaation Ser473, jolloin täysi aktivointi Akt [20], [21]. Vaikka Akt aktivoi suoraan mTOR /RAPTOR, se voi myös suoraan tai epäsuorasti aktivoida p70S6 kinaasi /4EBP1 reitin tämän reitin fosforyloimalla tuumorisuppressorigeenin TSC2 [22]. Akt /mTOR-reitin on osoitettu olevan usein aktivoida eri pahanlaatuisia kasvaimia, kuten rintasyöpää, urothelial, munasarjasyöpä, haimasyöpä neuroendokriinisiä kasvaimet, ihmisen medulloblastoma, melanooma, kohdun limakalvon syöpä ja hepatosellulaarinen karsinooma; Näin ollen, tämän reitin edustaa mahdollista terapeuttinen kohde monissa syövissä [23] – [30]. Tutkimuksessamme RT-PCR: llä ja Western blot osoitti, että mRNA: n ja proteiinin ekspressiotasot p-Akt, p-mTOR, p-4E-BP1 ja p-p70S6 mahalaukun syövän ryhmä oli huomattavasti korkeampi kuin para-karsinooma kudosten ja pariksi normaali mahan kudoksessa ryhmät (kuvio 2, kuvio 3). Sen määrittämiseksi, ovatko ekspressiotasot p-Akt, p-mTOR, p-4E-BP1 ja p-p70S6 liittyi kriittinen kliinis ominaisuudet, suoritimme lisäanalyysejä. Tässä tutkimuksessa 81,25% 80 potilaiden mahalaukun syöpä oli korkea p-mTOR ilmaisu, 77.50%: lla oli korkeat p-4E-BP ilmaisu, 76.25%: lla oli korkeat p-p70S6 ilmaisun, ja vain 75,00% oli korkea p-Akt ilme (Taulukko 5). Yllättäen immunohistokemiallinen analyysi paljasti, että ekspressiotasot näiden proteiinien ilmaisut olivat merkitsevästi yhteydessä syvyys hyökkäyksen, imusolmuke ja etäinen etäpesäke, ja histologinen luokka, mutta eivät liittyneet sukupuolen tai iän (taulukko 1, taulukko 2 ja taulukko 3) . Nämä tulokset viittaavat siihen, että Akt /mTOR -systeemi aktivoituu mahasyövän ja voi olla tärkeä rooli mahasyövässä kasvainten synnyssä, invaasiota ja etäpesäkkeiden.

Äskettäin Scott ym. paljasti, että GOLPH3 voi edistää solujen transformaation ja kasvaimen kasvua konstitutiivisesti aktivoimalla mTOR signalointireitin melanoomasoluissa ja että GOLPH3 stimuloi mTOR signalointireitin kautta mTORC1 ja mTORC2 komplekseja, mikä edistää kasvainsolujen kasvua ja proliferaatiota [8]. On kuitenkin epäselvää, onko tämä ilmiö esiintyy myös mahasyövän kudoksissa. Tietääksemme, meidän tutkimus on ensimmäinen tutkia synnyssä GOLPH3 edistää kasvaimen kehittymisen, invaasiota ja etäpesäkkeiden mahasyövän. Tuloksemme osoittavat merkittävää positiivinen suhde ilmaus GOLPH3 ja p-mTOR, p-4E-BP1 ja p-p70S6 (

r

= 0,410, 0,203 ja 0,128, vastaavasti,

p

0,05). Kuitenkin korrelaatio ilmentymisen GOLPH3 ja p-Akt ei ollut merkitsevä (

r

= 0,258,

p

0,05) (Taulukko 6). Erityisesti huomattavasti korkeampi GOLPH3 ilmentyminen liittyy korkea ilmentyminen p-mTOR, p-4E-BP1 ja p-p70S6 mahasyövän kudoksiin, ja tämä suhde oli merkitsevästi yhteydessä syvyys hyökkäyksen, histologiset laatu, ja imusolmukkeesta ja kaukainen etäpesäke. Tuloksemme paljasti erilaisia ​​suhteita GOLPH3 ja Akt /mTOR viestintäproteiinit, ja välistä positiivista GOLPH3 ja p-Akt oli lähes merkitsevä. Erityinen syitä suhdetta GOLPH3 ja p-Akt ovat epäselviä ja niitä pitäisi tutkia edelleen. Me spekuloida, että näytteen koko voi olla liian pieni. Lisäksi GOLPH3 voi ensisijaisesti aktivoida Akt /mTOR signalointireitin kautta aktivoitua mTORC1 pikemminkin monimutkaisia ​​kuin mTORC2 monimutkainen, jolloin p70S6 ja 4E-BP1 fosforylaation, mikä vaikuttaa mahasyöpä. Nämä tulokset osoittavat, että GOLPH3 voi olla osallisena mahasyövän tuumorigeneesiin, invaasio ja metastaasi kautta epänormaalin aktivoitumisen Akt /mTOR-signalointireitin.

Yhteenvetona, tässä tutkimuksessa havaittu korkea ekspressiotasot GOLPH3, p-Akt, p-mTOR, p-4E-BP1 ja p-p70S6 mahalaukun syövän ryhmään voimakkaasti, jotka korreloivat histologinen arvosana, syvyys invaasio, etäinen etäpesäke, ja imusolmuke osallistuminen kliinis muuttujien analyysi ja immunohistokemia. Lisäksi ilmaus GOPLH3 korreloi aktivaation Akt /mTOR signalointireitin ihmisen mahasyövän näytteitä. Näiden tulosten perusteella, me spekuloida, että GOLPH3 saattaa vaikuttaa etenemistä ja etäpesäke mahasyövän aktivoitumisen kautta Akt /mTOR signalointireitin. Lisäksi ehdotamme, että esto geenien ilmentymistä on GOLPH3 ja mTOR-signalointireitin voivat edustaa uutta tavoite mahalaukun syövän hoidossa. Lopuksi, invaasio ja muuttoliike mekanismit GOLPH3 mahasyövän vielä lisätutkimuksia.