Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Eturauhassyöpä on yleisin syöpä miehillä Yhdysvalloissa, ja immunoterapian on osoitettu olevan lupaava strategia hoitoon Metastasoivassa kastraatio kestävä eturauhasen syöpä. Pyrkimykset tunnistaa uusia eturauhasen kasvain antigeenejä helpottaa kehittämään tehokkaita syövän rokotteita eturauhassyöpää. Prostataspesifisen G-proteiiniin kytkeytynyt reseptori (PSGR) on uusi antigeeni, joka on osoitettu spesifisesti yli-ilmentynyt ihmisen eturauhassyövän kudoksiin. Tässä tutkimuksessa kuvaamme tunnistamisen PSoR peptidiepitoopeille tunnistavat CD8

+ T-solujen HLA-A2 riippuvaisella tavalla.

Menetelmät /Principal Havainnot

Kaksikymmentäyksi PS GR-peptidit ennustettiin immuniteettia tietotekniikan lähestymistapaa, joka perustuu HLA-A2 sitova motiivi. Nämä peptidit tutkittiin niiden kyky indusoida peptidi-spesifisten T-soluvasteiden perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa (PBMC: t), jotka saatiin joko HLA-A2

+ terveiden luovuttajien tai HLA-A2

+ eturauhassyöpäpotilailla. Tunnustaminen HLA-A2-positiivisesta ja PSoR ilmentävien LNCaP testattiin myös. Niistä 21 PSGR-peptidit, kolme peptidiä, PSGR3, PSGR4 ja PSGR14 usein indusoi peptidi-spesifisten T-soluvasteiden PBMC sekä terveiltä luovuttajilta ja eturauhassyöpäpotilailla. Mikä tärkeintä, nämä peptidi-T-solujen tunnustettu ja tappoi LNCaP eturauhassyövän solut HLA-luokan I-rajoittuneesti.

Johtopäätökset /merkitys

Olemme tunnistaneet kolme uutta HLA-A2-rajoittunut PSoR -johdannainen peptidit tunnistavat CD8

+ T-solut, jotka puolestaan ​​tunnistaa HLA-A2

+ ja PSoR

+ syöpäsoluja. PS GR-peptidit tunnistetaan, voidaan käyttää diagnostisina markkereina sekä immuunijärjestelmän tavoitteet kehittämiseen anticancer rokotteita.

Citation: Matsueda S, Wang M, Weng J, Li Y, Yin B, Zou J, et al. (2012) tunnistaminen Prostate-Specific G-proteiini reseptorin kuin kasvain tunnistama antigeeni CD8

+ T Cells for Cancer immunoterapia. PLoS ONE 7 (9): e45756. doi: 10,1371 /journal.pone.0045756

Editor: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 11, 2012; Hyväksytty: 24 elokuu 2012; Julkaistu: 20 syyskuu 2012

Copyright: © Matsueda et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ oli osittain tuettu avustuksia National Cancer Institute, National Institute of Health ja Cancer Research Institute, ja The Methodist Hospital Research Institute. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on tullut yleisin syöpä miehillä Yhdysvalloissa ja on toiseksi yleisin kuolinsyy syöpään American men [1]. Hoidon taso useimmille potilaille, joilla on eturauhasen syöpä on leikkaus ja /tai sädehoito. Kuitenkin uusiutunut leikkauksen jälkeen tai sädehoitoa edelleen tapahtuu jopa 30%: lla potilaista. Vaikka androgeenipuutteen hoito on tehokas hoito vastaan ​​uusiutuva sairaus, useimmat näistä potilaista kehittyy lopulta androgeeni-tulenkestävien eturauhassyöpä, joka ei ole herkkä perinteistä hoitoa. Siksi tehokkaampi ja vähemmän myrkyllisiä hoitoja tarvitaan kiireellisesti. Immunoterapia on osoitettu olevan lupaava lähestymistapa eturauhassyövän hoitoon, erityisesti potilailla, joilla on metastaattinen kastraatio kestävä eturauhassyöpä [2] – [4]. Valjastaminen immuunijärjestelmää hävittämiseksi pahanlaatuisia soluja on lupaava lähestymistapa syövän hoidossa, mutta vasta viime aikoina se on herättänyt vain yksittäisiä kliininen menestys [4] – [6]. Viimeaikaiset Food and Drug Administration (FDA) hyväksymiseen liittyvät immunoterapia-pohjainen rokote /lääke sipuleucel-T

(

Provenge) ja ipilimumab (Yervoy) edustavat virstanpylväitä alalla syövän immunoterapiassa [7], [8]. Lisäksi vaiheen III kliinisessä tutkimuksessa, että gp100 peptidin melanooman myös tuottanut erittäin rohkaisevia kliinisiä tuloksia [9]. Kuitenkin kliininen hyöty raportoitu näille tekijöille ovat laskeneet kauas täydellinen vaste ja pysyvää parannuskeinoa. Kun kyseessä on sipuleucel-T, selviytymisen hyötyä potilaille oli vain 4,1 kuukautta ilman objektiivista kasvaimen regressio tai merkittäviä muutoksia prostataspesifisen antigeenin (PSA) tasot. Tuoreessa tutkimuksessa käyttämällä eläinmalleja edelleen paljastaa, että on tärkeää kasvaimen antigeenejä herättämisessä immuunivasteisiin kehittyvä kasvain [10], vauhdittaa enemmän kartoitus tällaisista vasta syövän immunoterapiaa. Lisäksi koska eräät suuret hyljintäantigeenien voivat hävitä tai muuttunut johtuen T-solujen valinta ja tappaminen [11], parasta on kohdistaa useita kasvaimen antigeenejä, jotka ovat läsnä yksittäisiä kasvaimia immunoterapiassa.

Toistaiseksi useita eturauhasen kasvaimen antigeenejä on hyvin määritelty, kuten PSA [12], [13], prostein [14], [15], eturauhasen kantasolun antigeeni (PSCA) [16], eturauhasspesifinen membraani (PSMA ) [17] – [19], eturauhasen hapan fosfataasi (PAP) [20] ja ohimeneviä reseptorin potentiaalisten p8 (trp-p8) [21]. Lisäksi HLA-luokka I-rajoitettuja epitooppeja, jotka ovat peräisin näistä kasvaimen antigeenejä on kuvattu [22]. Yksi haittapuoli yhden kasvaimen antigeeni-pohjainen immunoterapia on, että immuuni paeta voi esiintyä. Siksi löytää uusia eturauhassyövän antigeenejä kehittämiseen tehokkaampaa ja antigeenispesifisten rokotteiden metastasoituneen eturauhassyövän tarvitaan. Prostataspesifisen G-proteiiniin kytkeytynyt reseptori (PSGR) on jäsen G-proteiiniin kytkettyjen haju- reseptorin perhe, ja on erittäin ilmaistaan ​​eturauhassyövän soluissa verrattuna normaalin eturauhasen solujen [23] – [25], mikä viittaa siihen, että PS GR voi olla suunnattu kehittää uusia immunoterapeuttisen strategioita eturauhassyöpää vastaan.

pyrkii määrittämään, onko PS GR voi tunnistaa T-solut, kuvaamme tunnistamisen PSGR-johdettujen T-soluepitooppeja T-solujen tunnustaa immuunivastetta -bioinformatics lähestymistapa. Kaksikymmentäyksi peptidejä, jotka ennustettiin sitoutuvan HLA-A2-molekyyli valittiin ja syntetisoitiin. Kaikki nämä peptidit arvioitiin

in vitro

niiden kyky stimuloida T-soluja PBMC sekä terveillä koehenkilöillä ja eturauhasen potilaat perustuu interferoni-γ (IFN-γ) vapautuminen mitattiin ELISA tai ELISPOT määrityksiä. Kolme peptidejä havaittiin indusoivan IFN-γ release perifeerisissä T-solut sekä terveillä koehenkilöillä eturauhassyöpäpotilaalla. Mikä tärkeintä, nämä peptidi-spesifisten T-solut voitaisiin tunnistaa HLA-A2

+, PSGR-ilmentäviä LNCaP-solujen HLA-luokan I-riippuvaisella tavalla.

Materiaalit ja menetelmät

terveiltä luovuttajilta ja eturauhassyöpä potilaat

kymmenen HLA-A2

+ eturauhassyöpäpotilaalla ja kymmenen HLA-A2

+ tervettä henkilöä otettiin tähän tutkimukseen, kun kirjallinen suostumus saatiin. Kaikki protokollat ​​hyväksyi Institutional Review Board (IRB) ja Baylor College of Medicine ennen opintojensa. 20 ml perifeeristä verta saatiin kunkin henkilön, ja ääreisverenkierron mononukleaariset solut (PBMC: t) eristettiin tiheysgradienttisentrifugaatiolla käyttäen Lymphoprep (Nycomed Pharma AS, Oslo, Norja). Juuri eristetty PBMC: t kryosäilöttiin myöhempää käyttöä 1 ml jäädyttäminen alustassa, joka sisälsi 90% FCS: ää ja 10% dimetyylisulfoksidia (DMSO) on -140 ° C: ssa. Ekspression HLA-A2-molekyylien PBMC: t on saatu syöpäpotilaiden ja terveiden varmistettiin virtaussytometrillä FITC-leimatun HLA-A2 mAb BB7.2 (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA).

Solulinjat

T2-soluja (HLA-A2

+ TAP-solulinjaan), PC3-solut (HLA-A2-negatiivinen eturauhassyöpä-solulinjaa), ja LNCaP-soluja (HLA-A2-positiivisesta eturauhasen karsinoomasolulinja) olivat kaikki hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Kaikkia solulinjoja pidettiin yllä RPMI-1640-alustassa (Mediatech, Manassas, VA, USA), jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 1% L-glutamiinia ja 1% penisilliiniä ja streptomysiiniä.

Peptidit

Kaksikymmentäyksi PSGR-peptidit (taulukko 1) ennustettiin käyttämällä BIMAS (https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/), SYFPEITHI (https://www.syfpeithi.de/), ja Rankpep (https://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html), joka perustuu HLA-A2 sitova motiivi. Vain epitooppeja, jotka ennustivat ainakin kaksi näistä algoritmit valittiin lisätestejä. Peptidit syntetisoitiin kiinteän faasin menetelmällä käyttäen peptidisyntetisaattoria (AApptec, Inc .; Louisville, KY, USA), puhdistettiin käänteisfaasi-korkean erotuskyvyn nestekromatografia ja validoitu massaspektrometrialla. Syntetisoitu peptidejä liuotettiin DMSO: hon pitoisuutena 10 mg /ml ja säilytettiin -80 ° C: ssa myöhempään käyttöön saakka.

In vitro

stimulaatio peptidi-spesifisten T-solujen vuonna PBMC

PBMC (1 x 10

5 solua /kuoppa) joko terveillä henkilöillä tai eturauhassyöpäpotilaalla inkuboitiin vakio peptidin pitoisuuksilla 20 ug /ml per peptidi [26] – [28] vuonna 96-U-pohjaisen mikrolevyille (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) 200 ul: aan T-solujen väliaine (TCM), joka koostuu RPMI 1640 (Mediatech, Manassas, VA, USA), 10% ihmisen AB-seerumia (Valley Biomedical, Winchester, USA), 50 uM 2-merkaptoetanolia, 100 U /ml interleukiini-2 (IL-2), ja 0,1 mM MEM ei-välttämätön aminohappo liuos (Invitrogen, Grand Island, NY, USA). Puolet TCM poistettiin ja korvattiin tuoreella TCM sisältävät peptidit (20 ug /ml), 5 päivän välein. Sen jälkeen, kun 14 päivää viljelyn jälkeen solut kerättiin ja testattiin niiden kyky tuottaa IFN-γ vastauksena T2-solujen (1 x 10

4 solua /kuoppa), jotka on valmiiksi ladattu joko PS GR-peptidi (5 ug /ml) tai kontrollipeptidiä (irrelevantti HLA-A2-sitoutuvan peptidin: NLLTHVESL) negatiivisena kontrollina. 18 tunnin kuluttua inkubaation supernatantit kerättiin, ja IFN-γ vapautuminen määritettiin ELISA-määrityksellä.

Rapid Expansion Protocol (REP) ja PS GR-peptidi-spesifisten T-solujen

PS GR-peptidispesifiset T-solut laajennettiin nopea laajeneminen protokolla (REP) kuten aiemmin on kuvattu [29] pienin muutoksin. Lyhyesti, päivänä 0, 0,1-0,5 x 10

6 PSGR-peptidin spesifisten T-soluja viljeltiin T25 pullossa 20 ml: lla RPMI-1640, johon oli lisätty 10% ihmisen AB-seerumia, 50 uM 2-merkaptoetanolia, ja 30 ng /ml OKT3-vasta-aine (Ortho Biotech, Bridgewater, NJ), jossa on 20 x 10

6 säteilytetty allogeenisten PBMC: ja 5 x 10

6 säteilytetty Epstein-Barrin virus (EBV) transformoituja B-soluja feeder-soluja. Pulloja inkuboitiin pystyssä 37 ° C: ssa 5% CO

2. IL-2 (300 IU /ml) lisättiin päivänä 1 ja päivänä 5, puoli soluviljelmän supernatantti poistettiin ja täydennettiin tuoreella alustalla, joka sisälsi 300 IU /ml IL-2. 14 päivän kuluttua aloittamisesta REP, solut kerättiin ja kryosäilytetään tulevia kokeita.

ELISA-määritys

Sytokiinien vapautuminen mitattiin päällystämällä 96-kuoppaisia ​​ELISA-levyjä (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY , USA) 1 ug /ml anti-ihmis-IFN-γ (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) yön yli 4 ° C: ssa. Levy pestiin kuusi kertaa PBS: llä, joka sisälsi 0,05% Tween-20 (pesuliuos) poistamaan sitoutumaton peittävän vasta-aineen, ja salvattiin 1% BSA /PBS: ää huoneen lämpötilassa 2 tuntia. Sen jälkeen, 50 ui supernatanttia lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 1 tunnin ajan, sitten 50 ui 0,5 ug /ml biotinyloitua anti-ihmis-IFN-γ (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) lisättiin ja levyjä inkuboitiin vielä 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Inkubaation jälkeen levyt pestiin ja niitä inkuboitiin 30 min Poly-HRP-streptavidiini (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY, USA) laimennettuna 1:5000 PBS /1% BSA: ta. Levyt pestiin ja 100 ui TMB-substraattiliuosta (Sigma-Aldrich Co .; St. Louis, MO, USA) lisättiin kuoppaa kohti. Kolorimetrinen reaktio pysäytettiin 2 N H

2SO4 ja levyt luettiin 450 nm: ssä käyttäen ELISA-levyn lukijalla.

IFN-y-ELISPOT-määritys

IFN-y-ELISPOT-määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [27] määrittää peptidi-spesifisten sytotoksisten T-lymfosyyttien (CTL: t) sen jälkeen, kun

in vitro

laajentamiseen. Lyhyesti, 96-ELISPOT-levyt (Millipore, Bedford, MA, USA) päällystettiin yön yli 4 ° C: ssa 7,5 ug /ml anti-ihmis-IFN-γ (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Levyt pestiin kuusi kertaa steriilillä PBS: llä poistamaan sitoutumaton peittävän vasta-aineen. T-solut ympättiin 1 x 10

5 solua kuoppaa kohti ja inkuboitiin T2-soluja yksinään, T2-soluja pulssitettiin kanssa PSGR peptidi (5 ug /ml) tai irrelevanttia peptidiä negatiivisena kontrollina. Soluja stimuloitiin 5 ug /ml OKT3-vasta-aine (Ortho Biotech, Bridgewater, NJ, USA) käytettiin positiivisena kontrollina. Kun oli inkuboitu näytteitä 18-20 tunnin ajan 37 ° C: ssa ja 5% CO

2, levyt pestiin pesuliuoksella. 0,75 ug /ml biotinyloitua anti-ihmis-IFN-γ (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) lisättiin, ja levyjä inkuboitiin 2 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Inkubaation jälkeen levyt pestiin pesuliuoksella ja inkuboitiin edelleen Poly-HRP-streptavidiini (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY, USA) laimennettuna 1:1000 PBS /1% BSA: ta 1 tunnin ajan. Levyt pestiin ja 200 ui 4-kloori-1-naftoli-substraattia (Sigma-Aldrich Co .; St. Louis, MO, USA) lisättiin kuhunkin kuoppaan. Lopuksi levyt pestiin juoksevan veden alla ja kuivattiin huoneenlämpötilassa. IFN-γ pilkkuja muodostavien solujen määristä (SFC) laskettiin käyttäen ELISPOT lukijaa (CTL Technologies, Minneapolis, MN, USA).

RNA ja RT-PCR

RNA ja RT PCR suoritettiin, kuten on raportoitu aiemmin [30]. Lyhyesti, kokonais-RNA uutettiin syöpäsolujen 1 ml Trizol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Kolme mikrogrammaa RNA: ta käänteistranskriboitiin cDNA: ksi 30 ul: n tilavuudessa ja 1 ui kutakin cDNA: ta käytettiin myöhemmissä PCR-reaktiossa pari PSGR spesifisiä alukkeita: Aluke 1: 5′-GAAGATCTATGAGTTCCTGCAACTTC-3 ’, aluke 2: 5’ -CCCAAGCTT TCACTTGCCTCCCACAG-3 ’. β-aktiini käytettiin lastaus ohjaus: aluke 1: 5’-CATGATGGAGTTGAAGGTAGTTTCG-3 ’; Aluke 2: 5’-CAGACTATGCTGTCCCTGTACGC-3 ’. PCR-reaktio toteutettiin seuraavissa olosuhteissa: 94 ° C 2 min, 94 ° C: ssa 30 s, 56 ° C: ssa 30 s, 72 ° C 1 min 20 s, yhteensä 35 sykliä, 72 ° C: ssa 10 min, ja β-aktiini ajettiin 25 sykliä. Yhtä suuret määrät PCR-tuotteita ladattiin sitten ja havaittujen geelielektroforeesilla.

Sytotoksisuusmääritys

PS GR-johdettu peptidi-spesifisten T-solut testattiin sytotoksisuuden sekä PC3 ja LNCaP jonka laktaattidehydrogenaasin (LDH ) määritys (Promega, Madison, WI, USA). Analyysi suoritettiin noudattaen valmistajan ohjeita. LDH: n vapautuminen laskettiin seuraavalla kaavalla:

Sytotoksisuus (%) = (kokeellinen – efektori spontaani – kohde spontaani LDH: n vapautuminen) /(Target Maximum – Target Spontaani LDH: n vapautuminen) x 100.

Spontaani vapautuminen määritettiin käyttämällä supernatantti kohdesolujen yksinään tai efektorisoluja yksin, ja suurin vapautuminen määritettiin käyttämällä supernatantti kohdesolujen inkuboitiin lyysausliuoksella sisältyvät LDH kit. Sen määrittämiseksi, T-solu tunnistaa on HLA-I rajoitettu, anti-HLA-I, anti-HLA-II, tai anti-CD19-mAb (kaikki ATCC, Manassas, VA, USA) lisättiin kuoppiin aloitettaessa viljelmän .

Solunsisäinen IFN-γ Sytokiini Värjäys

PSoR peptidin spesifisten T-solujen (0,5-1 x 10

6) viljeltiin 0,5 × 10

6 T2-soluja pulssitettiin kanssa tai ilman peptidiä (5 ug /ml) läsnä ollessa GolgiStop (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) 48-kuoppaisen levyn 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Solut värjättiin anti-CD8 ja anti-IFN-γ ja analysoitiin käyttämällä FACScalibur konetta.

Tilastot

Studentin t-testiä käytettiin analysoimaan määrällisiä eroja koekaivoja ja valvonnan ELISA ja ELISPOT määrityksiä. P 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

induktio PSoR peptidiä-spesifisten CTL: ien in Healthy Avunantajat

Voit selvittää PSoR-reaktiivinen T-solujen esiasteet ovat läsnä terveillä aineet, saimme PBMC: t 10 HLA-A2

+ terveen luovuttajan ja stimuloitiin ne

in vitro

kuhunkin 21 PSGR-johdetut peptidit, jotka sisältävät HLA-A2-sitova motiivi (taulukko 1). 2 viikon kuluttua peptidin stimulaatio, supernatantit peptidi-stimuloitujen T-solut analysoitiin ELISA-määrityksellä havaitsemiseksi IFN-γ vapautumista vasteena T2-soluja pulssitettiin tai ilman niitä peptidejä. Kuten on esitetty taulukossa 2, 13 PSGR-peptidit kykenivät indusoiva peptidi-spesifisten T-soluvasteiden ainakin yksi 10 terveillä koehenkilöillä. Tärkeää on, PSGR3, PSGR4 ja PSGR14 voivat aiheuttaa T-solujen vasteita 7 10 Terveillä henkilöillä, mikä osoittaa, että nämä 3 peptidit ovat immunogeenisiä ja mahdollisesti pystyvät laajentamaan antigeenispesifisten T-solujen terveillä koehenkilöillä.

läsnäolo PS GR peptidin spesifisten CTL: ien eturauhassyöpäpotilailla

Koska peptidi-spesifisten T-solujen vastaan ​​PSGR3, PSGR4 ja PSGR14 havaittiin yli 70% terveillä koehenkilöillä, päättelimme, että CTL esiasteita, jotka tunnistavat nämä 3 peptidit voivat myös olla korkea PBMC eturauhassyövän potilailla. Testata hypoteesia, me tutki näitä kolmea peptidi ehdokkaat voivat aiheuttaa peptidi-spesifisten CTL: ien päässä PBMC HLA-A2

+ eturauhassyöpäpotilaalla. PBMC eturauhassyöpäpotilaalla kerättiin ja stimuloitiin

in vitro

kanssa PSGR3, PSGR4 tai PSGR14 peptidejä. Kuten on esitetty taulukossa 3, PSGR3, PSGR4 ja PSGR14 todellakin indusoi peptidi-spesifisten CTL: ien PBMC: istä eturauhassyövän potilailla.

tunnustamisesta Eturauhassyöpä Cell Lines, jonka PS GR-Derived peptidi-spesifisten T-solujen

Jotta saataisiin suuri määrä PSGR peptidin spesifisten T-solujen tarkempaa analysointia, lisäsimme PSGR-peptidi-T-soluja tunnistetaan taulukoissa 2 ja 3. määrittää tehokkaan pitoisuuden peptidin loading T2-soluja T-solu tunnistaa teimme peptidi titraus kokeissa. Kuten kuviossa 1A on esitetty, kaikkien 3 peptidit peptidin konsentraatio 5 ug /ml oli riittävä kyllästämään sitoutumiskohtien HLA-A2-molekyylien T2-soluja T-solu tunnistaa. Siksi me johdonmukaisesti tämän peptidin pitoisuuden esikiristyslaite T2-solujen ELISA ja /tai ELISPOT määrityksiä. Laajennettu T-solut pidettiin antigeenispesifisyys ja erittävät merkittäviä määriä IFN-γ stimulaation jälkeen pulssattujen T2-solujen vastaavan peptidien, mutta ei kontrolli-peptidiä (kuviot 1A, B, C, D). ELISPOT-määrityksessä edelleen varmisti PSoR peptidin spesifisten T-solujen laajennetussa T-solut (kuviot 1E, F, G) B

tunnustamisesta T2-solujen esiasennetut titrattiin pitoisuuksia peptidejä (0-20 ug /ml) laajennettu PSGR peptidi-spesifisten T-solujen testattiin ELISA-määrityksellä (A). Laajennettu PSGR3 T-soluja (B ja E), PSGR4 T-soluja (C ja F) ja PSGR14 T-soluja (D ja G) olivat vastaavasti inkuboitu yhdessä T2-soluja (1 x 10

4 solua /kuoppa) yksin täydellistä kasvualustaa (CM), tai T2-soluja ladattu valmiiksi joko vastaava peptidi (5 ug /ml) tai kontrollipeptidiä negatiivisena kontrollina. Soluja inkuboitiin 18 -24 tunnin ajan, IFN-γ eritystä supernatantissa määritettiin ELISA-määrityksellä (B, C ja D). IFN-γ pilkkuja muodostavien solujen määristä (SFC) laskettiin ELISPOT-määrityksellä (E, F ja G). Data piirretään keskiarvoja ± SD. Tulokset edustavat ainakin kolmen erillisen kokeen. *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,001 vs. kontrollit, (T2-soluja yksinään tai T2-soluja pulssi kanssa kontrollipeptidiä).

sen määrittämiseksi, onko PS GR-peptidin spesifisten T-solujen pystyivät tunnistamaan ja tappaa HLA-A2

+, PSGR-ilmentävien syöpäsolujen, käytimme HLA A2-negatiivista PC3-solulinjassa ja HLA-A2-positiivisesta LNCaP eturauhassyövän solulinja. Ilmentymistä PSGR näissä kahdessa solulinjassa tutkittiin RT-PCR: llä. Yhdenmukainen aiemman raportin [31], PSoR oli hyvin ilmaistu LNCaP, mutta ei PC3, DU145 tai normaalin eturauhasen solulinja PNT1A (kuva 2 A). Kuten on esitetty kuviossa 2B, PSGR3-, PSGR4- tai PSGR14-spesifisiä T-soluja sekä terveillä luovuttajilla ja potilailla voisi tunnistaa ja tappaa HLA-A2-positiivinen, PSoR ilmentävät LNCaP, mutta ei HLA-A2-negatiivista PC3-soluja. Nämä tulokset viittaavat siihen, että PS GR-spesifisten T-solut tunnistavat T-soluepitooppeja, jotka ovat endogeenisesti prosessoidun ja tarjolla olevan eturauhasen syöpäsoluja.

ilmentyminen PSGR-mRNA: n eri solulinjoissa määritettiin RT-PCR: llä (A). PS GR-johdettu peptidi-spesifisten T-solut testattiin sytotoksisuuden sekä PC3 ja LNCaP, että LDH-määritystä (B). Tiedot B piirretään keskiarvoina ± SD. Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen. *

P

0,05, vs. kontrolli.

T-solut tunnistavat PSoR peptidejä vastaan ​​HLA-I rajoitetulla tavalla

Voit testata, onko indusoimat vasteet by PS GR-peptidit ovat riippuvaisia ​​CD8-

+ T-solut, yhteisrahoittaisimme viljeltiin PSGR peptidin spesifisten T-solujen kanssa pulssattujen T2-solujen tai ilman vastaavia peptidejä läsnä ollessa GolgiStop 4 tuntia. Värjäys CD8-molekyylien ja solunsisäisen IFN-γ myöhemmin suoritettiin. Vain CD8

+ T-solujen havaittiin tuottavan IFN-γ vasteena pulssattujen T2-solujen peptidejä vastaan ​​(kuvio 3A), kun taas CD4

+ T-solut eivät tuottaneet IFN-γ (tuloksia ei ole esitetty).

PS GR-peptidin spesifisten T-soluja viljeltiin yhdessä T2-soluja vastaan, joille kanssa tai ilman tietyn peptidin läsnä GolgiStop on 48-kuoppalevyllä 4 tuntia 37 ° C: ssa. Solut värjättiin anti-CD8 ja anti-IFN-γ, sitten analysoitiin FACScalibur kone (A). PS GR-peptidin spesifisten T-soluja yhdessä inkuboitiin LNCaP-solujen yksin väliaineessa, tai LNCaP-solujen läsnä ollessa, joko anti-HLA-I-mAb (W6 /32), HLA-II mAb tai kontrolli-mAb (anti- -CD19 mAb). 4 tunnin inkuboinnin jälkeen sytotoksisuus LNCaP määritettiin LDH määrityksessä (B). Tiedot B piirretään keskiarvoina ± SD. Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen. *

P

0,05, verrattuna kontrolleihin.

Voit selvittää, onko tunnustamista LNCaP solujen PSoR peptidin spesifisten T-solujen on HLA-I rajoitettu, me CO- viljellyt LNCaP-solujen PSGR-johdettu peptidi-spesifisten T-solujen läsnä ollessa, joko anti-HLA-I-mAb (W6 /32) tai kontrolli-mAb: t (HLA-II mAb tai anti-CD19-mAb). Kuten kuviossa 3B on esitetty, sytotoksisuus näiden peptidi-spesifisten T-solujen inhiboitui täysin lisäämällä anti-HLA-I-mAb, mutta ei anti-HLA-II (HLA-DR) tai kontrolli-mAb (anti-CD19- ), mikä viittaa siihen, että tunnustaminen LNCaP solujen PSoR peptidin spesifisten T-solujen on HLA-I rajoitettu.

keskustelu

on hyvin tunnettua, että CD8

+ T-solut on kriittinen rooli säätelyssä kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen. Peptidiepitoopit, jotka ovat peräisin kasvaimeen liittyvistä antigeeneistä (TAA: t), voidaan tunnistaa antigeeneiksi T-solujen yhteydessä MHC-I-molekyylit [32], [33]. Tunnistaminen TAA: iden ja niiden peptidejä, jotka T-solut tunnistavat ovat välttämättömiä kehittää tehokkaita syövän rokotteita.

tavoitteena olevassa tutkimuksessa oli tunnistaa HLA-A2 sitova PSoR johdettujen epitooppien tunnistavat CD8

+ T-solujen PBMC terveiden koehenkilöiden ja eturauhassyövän potilailla. Kolme eri atk-pohjainen Ennustusalgoritmien lukien BIMAS, SYFPEITHI, ja Rankpep käytettiin skannata PSGR proteiinisekvenssi HLA-A2-sitovia peptidejä, joka perustuu HLA-A2 sitova motiivi. Vain peptidejä, jotka ennustivat menestyksellisesti vähintään 2 ulos 3 eri atk-pohjainen Ennustusalgoritmien olivat mukana. Kaksikymmentäyksi 9mer tai 10mer peptidejä valittiin tässä tutkimuksessa tämän kriteerin mukaisesti. Kaikki nämä peptidit testattiin niiden kyvyn suhteen stimuloida PBMC joko terveillä henkilöillä tai eturauhasen syöpä potilaiden vapauttamiseksi IFN-γ. 21 peptidit, kolme peptidiä usein indusoi spesifiset T-soluvasteita PBMC: saatu joko terveillä henkilöillä tai syöpäpotilailla, ja nämä peptidi-spesifisten T-solujen on myös tunnustettu HLA-A2

+ PS GR-ilmentävien LNCaP-soluja, mikä viittaa siihen, että nämä peptidit ovat luonnollisesti prosessoitujen eturauhasen syöpäsoluja.

PSGR on eturauhasen kudosspesifinen geenin homologia G-proteiiniin hajuste-reseptorin geenin perhe, ja se on erityisesti ilmaistu ihmisen eturauhasen kudoksissa [23] – [25]. Ilmaus PSGR on merkittävästi suurempi ihmisen eturauhasen intraepiteliaalinen neoplasia ja eturauhasen kasvaimien kuin normaaleissa kudoksissa [25]. Kiinnostavaa, vaikka PSGR on pidetty uutena kohteena eturauhassyövän immunoterapiaa, T-soluepitooppeja, jotka ovat peräisin PSGR ei ole tunnistettu. Tämä on tietääksemme ensimmäinen raportti tunnistaa ja kuvata PSoR johdettujen epitooppien tunnistavat CD8

+ T-soluja. Tunnistaminen PSGR-johdettujen epitooppien T-solut tunnistavat edelleen vahvistaa PSGR lupaavana kohteena syövän kehittymisen rokotteita.

Useimmat ita ovat itse antigeenejä [34], siis itse toleranssi voi esiintyä käytettäessä yrittävät suojella yksilön autoimmuniteetin kehittymistä. Tätä pidetään merkittävä este induktioon TAA-spesifisten T-solujen, jotka kykenevät hävittämään kasvaimet

in vivo.

Kuitenkin tutkimuksessamme, vaikka PSoR ilmentyy normaalissa eturauhasessa kudoksessa, immuunisieto vastaan ​​PS GR voi rikki, koska T-solujen vasteet PSoR johdettuja epitooppeja olivat usein havaittavissa PBMC joko terveillä henkilöillä tai eturauhassyöpäpotilaille.

Suuri määrä immunoterapian kliinisten tutkimusten perustuu rokotuksista kasvaimen lysaatit, TAA proteiineja, TAA peptidejä ja RNA tai DNA, joka koodaa TAA on jo tehty. Kuitenkin useimmat näistä tutkimuksista eivät ole saavuttaneet halutut tulokset. Yksi syy on se, että ilmaus näiden TAA: iden on heterogeeninen keskuudessa kasvaimia eri potilaista ja voi vaihdella jopa kesken etäpesäkkeitä yhdestä potilaasta saatujen [35], [36], mikä immuuni paeta voi ilmetä, kun immuuniterapeuttista lähestymistapa perustuu vain yhteen TAA. Välttämiseksi immuuni paeta, rokote-pohjainen immunoterapeuttinen strategioita, jotka kohdistuvat useita kasvaimen antigeenejä ovat välttämättömiä kehittämisen onnistuneen syövän rokotteita. Näin ollen löytää uusia eturauhasen kasvainantigeenejä, kuten PSoR, T-solujen immunoterapian tarvitaan edelleen, siitä huolimatta useita eturauhasen kasvaimen antigeenejä, mukaan lukien PSA: [12], [13], PSCA [16], PSMA [ ,,,0],17] – [19], PAP [20], Prostein [14], [15] ja trp-p8 [21], on havaittu viime vuosina.

FDA on äskettäin hyväksynyt syöpä rokote, Sipuleucel-T, hoitoon potilailla, joilla on pitkälle edennyt eturauhassyöpä perustuu vaiheen III tutkimuksessa [8]. Sipuleucel-T valmistetaan autologista PBMC: istä, jotka sisältävät antigeenia tarjoavat solut, jotka on inkuboitu rekombinanttiproteiinin koostuu PAP liittyy granulosyytti-makrofagipesäkkeitä stimuloiva tekijä (GM-CSF). Sipuleucel-T oletettavasti toimii osittain kasvattamalla PAP-CD8

+ T-soluvasteita, myös osoittaa, että on tärkeää kasvaimen antigeenispesifisen CD8

+ T-solujen aiheuttama syöpä rokotteita. Toistaiseksi Sipuleucel-T on ensimmäinen solu immuuniterapeuttista aineen hyväksynyt FDA, joita käytetään syövän hoitoon potilailla. FDA hyväksyntä Sipuleucel-T terapeuttisena syöpä rokote paitsi vahvistaa tehoa syövän immunoterapian, mutta myös antaa vahvan sysäyksen alan syöpäimmunologian [37]. Siksi tunnistaminen ja kehittäminen lisää uusia TAA: iden lukien PSoR ja peptidin johdannaiset tunnistavat CTL: t on ehdottomasti välttämätöntä helpottaa kehittämään tehokkaita syövän rokotteita eturauhasen syövät sekä muut syöpätyypit tulevaisuudessa.

Lisäksi tunnistamien epitooppien CD8

+ T-soluja voidaan käyttää diagnostisia välineitä, joilla seurataan peptidin CD8

+ T-solujen yksilöissä aikana immunisaation, mikä tunnistaa optimaaliset aikataulut immunisointiin hoidon aikana, kuten onko myöhemmät immunizations tarvitaan yksilöiden kun kasvaimen vastaisen immuniteetin heikkenee.

Yhteenvetona olemme tunnistaneet kolme uutta PSoR johdettu CTL-epitooppeja. Koska PS GR-ilmentyminen on voimakkaasti säädelty ihmisen eturauhasen syövissä, PSGR-peptidit voivat toimia diagnostisina työkaluina tai immunoterapeuttinen tavoitteet syövän vastaisten rokotteiden yksin tai yhdessä muiden epitooppien kanssa, jotka ovat peräisin muista eturauhasen antigeenejä.

Kiitokset

kiittää Drs. Adebusola Alagbala Ajibade ja Audrea M. Burns kriittisen lukema käsikirjoituksen ja Hui apua kuvassa valmisteluun.