Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Yli-ilmentyminen Aurora-kinaasien edistää kasvaimen kehittymisen soluja. Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää prekliininen profiili uusi yleiseurooppalainen Aurora estäjä, BPR1K653, ehdokkaaksi syövän hoitoon. Koska ilmaus lääkkeen effluksipumpun, MDR1, vähentää tehokkuutta erilaisten kemoterapeuttisten yhdisteiden ihmisen syövissä, tässä tutkimuksessa pyrittiin myös selvittää, onko tehoa BPR1K653 voi vaikuttaa ilmaus MDR1 syöpäsoluissa.

Keskeiset havainnot

BPR1K653 nimenomaan inhiboi Aurora-A: n ja Aurora-B-kinaasin pienillä nano-moolipitoisuuksien

in vitro

. Anti-proliferatiivinen aktiivisuus BPR1K653 arvioitiin ihmisen eri syöpäsolulinjoissa. Tulokset klonogeenisten testi osoitti, että BPR1K653 oli voimakkaampi kohdistaminen eri syöpäsolulinjojen riippumatta kudoksen alkuperästä, p53 tilan tai ilmentymisen MDR1. Solutasolla, BPR1K653 aiheuttama endo-replikointi ja myöhemmin apoptoosia sekä MDR1-negatiivisia ja MDR1-positiivisten syöpäsolujen. Tärkeää on, se osoitti voimakasta aktiivisuutta kasvua vastaan ​​ksenograftikasvaimissa ihmisen kohdunkaulan karsinooman KB ja KB-johdettu MDR1-positiivisia KB-VIN10 soluja nude-hiirissä. Lopuksi BPR1K653 myös näytteillä suotuisat farmakokineettiset ominaisuudet rotilla.

Päätelmät ja merkitys

BPR1K653 on uusi voimakas anti-syöpä yhdiste, ja sen teho ei vaikuta ilmaus useiden lääkkeille vastustuskykyiset proteiini, MDR1, syöpäsoluissa. Siksi BPR1K653 on lupaava syövän vastainen yhdiste, joka on potentiaalia hallintaan oli erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia, erityisesti potilaille, joilla on MDR1 liittyvää lääkeresistensseihin pitkittyneen kemoterapia-hoitoja.

Citation: Cheung CHA, Lin WH, Hsu JT -A, tunti TC, Yeh TK, Ko S, et ai. (2011) BPR1K653, Novel Aurora estäjät, Näytteillä voimakas anti-lisäkasvuaktiivisuus in MDR1 (P-gp170) -välitteisen monilääkeresistentit syöpäsoluja. PLoS ONE 6 (8): e23485. doi: 10,1371 /journal.pone.0023485

Editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 kesäkuu 2011; Hyväksytty: 18 heinäkuu 2011; Julkaistu: 24 elokuu 2011

Copyright: © 2011 Cheung et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat avustusta National Science neuvosto (NSC99-2323-B-400-006, NSC99-2323-B-400-007, NSC99-2120-M-006-005), Department of Health (DOH99-TD-C -111-004), ja National Health Research Institutes (CA-099-PP-02), Taiwan Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mitosis on keskeinen vaihe solusyklin joka on tiukasti säännelty monien proteiinien. Epänormaali ilmentyminen tai aktivointi näiden säätelevien proteiinien voi johtaa poikkeavaan mitoosia, joka johtaa syöpien kehittymisessä [1], [2]. Molekyylitasolla, Aurora-kinaasien (Aurora-A, Aurora-B ja Aurora-C) ovat seriini /treoniinikinaaseja, jotka toimivat keskeisinä säätelijöinä mitoosin. Normaaleissa fysiologisissa olosuhteissa, ne ovat välttämättömiä kehräkokoonpanon, sentrosomimäärän kypsymistä, kromosomi erottelu ja sytokineesiin [3], [4]. Patologisissa olosuhteissa, se on osoitettu, että Aurora-kinaasit ovat yli-ilmentynyt useissa ihmisen syövissä, ja myös ollut tärkeä rooli tässä prosessissa kasvaimen [5], [6], [7], [8]. Esimerkiksi Aurora-A-kinaasin yli-ilmentynyt ruoansulatuskanavan yläosaan adenokarsinooman [6]. Lisäksi korrelaatio Aurora-A ekspressiotasot ja syövän etenemistä on osoitettu potilailla, joilla on pään ja kaulan okasolusyöpä [9]. Toisaalta, Aurora-B-kinaasin on usein yli-ilmentynyt ensisijainen NSCLC ja pahanlaatuinen gliooma, erityisesti glioblastomas [10], [11]. Koska yli-ilmentyminen Aurora-A: n ja Aurora-B liittyy usein kasvaimen kehittymisen, näiden molekyylien on suunnattu syövän hoidossa. Ensimmäinen proof-of-concept pan-Aurora estäjä, VX-680 (MK-0457, Tozasertib), kehitettiin vuonna 2004 Vertex Pharmaceuticals (yhteistyössä Merck), jonka tavoitteena on kohdistaa syöpäsolujen. Tämä erityinen estäjä on osoitettu tehokkaaksi kohdistaminen syöpäsoluissa sekä

in vitro

ja

in vivo

, ja on saanut hyväksyntää Yhdysvaltain elintarvike- ja lääkevirasto (FDA) päästä kliinisten tutkimusten [12 ], [13], [14]. Sittemmin jatkuvasti työtä on tehty eri lääkeyhtiöiden etsimään mahdollisia Aurorakinaasi estäjiä, jotka osoittavat parempaa terapeuttista profiilia ja spesifisyys kuin verrata ensimmäisen sukupolven estäjä, VX680 [15], [16], [17], [18] , [19], [20], [21], [22], [23].

Vaikka varhainen onnistumisten kehittää erilaisia ​​Aurora estäjät, viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että tehokkuutta monet näistä kehittyi ja kliinisesti testattu estäjät, mukaan lukien VX680, PHA-739358 ja AZD1152, voidaan vaikuttaa ilmentymistä monilääkeresistenssin proteiinin MDR1 (P-gp170) syöpäsoluissa [24], [25]. Itse asiassa, yli-ilmentyminen MDR1 häiritsee myös laajan valikoiman eri kemoterapeuttisten aineiden [2], [26], [27], [28], [29]. Esimerkkejä on ilmaus transmembraaninen lääke effluksipumpun, MDR1, vähentää herkkyyttä syöpäsolujen paklitakseliin, vinkristiini (anti-mikrotubulus aineet), doksorubisiini (DNA interkalaatioaine), mitoksantroni, VP-16 (topoisomeraasi II estäjien) ja imatinibi (tyrosiinikinaasiestäjä) [28], [30], [31], [32], [33], [34]. Siksi on ollut suurta kiinnostusta identifioida uusia syövänvastaisia ​​yhdisteitä, jotka voivat voittaa MDR1 liittyvää vastus ja myös näytteille parantunut farmakologinen profiili.

Tässä tutkimuksessa uusi yleiseurooppalainen Aurora estäjä otsikkona BPR1K653 kehitettiin ja sen tehoa vs. eri MDR1-negatiivisia ja MDR1-positiivisten syöpäsolujen arvioitiin. Tulokset nykyisen tutkimuksen osoittavat, että toisin kuin edellä mainitut kemoterapia-aineiden, BPR1K653 on tehokas kohdistamaan sekä MDR1-negatiivisten ja positiivisten syöpäsolujen

in vitro

ja

in vivo

. Lisäksi BPR1K653 esittelee suotuisat farmakokineettiset ominaisuudet

in vivo

.

Tulokset

BPR1K653 on voimakas ja selektiivinen yleiseurooppalainen Aurora estäjä

In vitro

kinaasin inhibition määrityksessä osoitti, että BPR1K653 (kuvio 1A) inhiboi Aurora-A: n ja -B-kinaasin IC

50-arvo 124 nM ja 45 nM, vastaavasti (kuvio 1 B ja taulukko 1). Valikoivuus BPR1K653 arvioitiin sitten vastaan ​​eri kinaasien. BPR1K653 näytteillä vähemmän tehoa (eli IC

50 10 uM) in inhiboimaan ALK, CHK1, cMET, EGFR, FLT3, VEGFR1 ja VEGFR2 verrattuna Aurora-A: n ja Aurora-B-kinaasin (taulukko 1). Solujen aktiivisuus BPR1K653 tutkittiin myös. Aktivointi Aurora-A-kinaasin edellyttää automaattisen fosforylaatio on Thr288 jäännöksen, kun taas fosforylaation Thr232 jäännös on olennainen sääntelymekanismiin Aurora-B aktivointi [35], [36]. Täällä, Western blot-analyysi osoitti, että fosforin määrä-Aurora-A, -B ja -C kinaasin läsnä HCT116 syöpäsolujen käsitelty yleiseurooppalainen Aurora estäjät, VX680 (positiivinen kontrolli), väheni pitoisuudesta riippuvalla tavalla (kuvio 1C). Vähentäminen fosfori-histoni H3 (Ser10), suora substraatti Aurora-B-kinaasin, on laajalti käytetty indikaattorina Aurora-kinaasin inhibitio soluissa. Täällä VX680 vähensi myös fosforin määrä-histoni H3 (Ser10) läsnä soluissa kuin odottaa (kuvio 1 C). Yhdenmukaisesti näiden havaintojen BPR1K653 aiheuttama pitoisuudesta riippuvaa vähenemistä fosfori-Aurora-A, -B ja -C kinaasia HCT116-soluissa. HCT116-solut käsiteltiin BPR1K653 osoitti myös pitoisuudesta riippuvaa vähenemistä fosfori-histoni H3 (kuvio 1C).

(A) kemiallinen rakenne syövän yhdisteen BPR1K653. (B) BPR1K653 inhiboi sekä Aurora-A: n ja Aurora-B-kinaasin paljasti

in vitro

kinaasin inhibition määrityksessä. (C) HCT116 syövän soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla BPR1K653 ja kaupallisesti saatavilla pan-Aurora-kinaasin estäjä VX680, ja ilmaisu eri proteiinit analysoitiin Western-blottauksella. Tubuliinia käytettiin sisäisenä kontrollina.

BPR1K653 estää proliferaatiota useiden ihmisen syöpäsolulinjojen riippumatta niiden kudoksen alkuperästä ja p53:

Sen määrittämiseksi, onko BPR1K653 voi estää soluproliferaatiota, paneeli 11 eri syövän solulinjoissa käsiteltiin BPR1K653. Vertailun vuoksi soluja käsiteltiin myös kaksi hyvin tunnettu Aurora estäjät, VX680, ja PHA739358. On osoitettu, että menetys p53-toiminto indusoi monilääkeaineresistenssin tietyntyyppisissä syövän [37]. Tässä tulokset klonogeeniset määrityksen paljasti, että BPR1K653 oli tehokas (ts IC

50 0,5 uM) vastaan ​​erityyppisiä syöpäsoluja, kuten keuhko- (A549), suun (hioa-1 ja OECM-1) kohdunkaulan (KB) , paksusuoli (HT29), virtsarakon (NTUB1) ja leukemia /lymfooma (MV4-11 ja IM9), riippumatta p53 asemasta (taulukko 2). Lisäksi teho BPR1K653 osoitettiin olevan korkeampi kuin VX680 ja PHA739358 useimmissa testattujen syöpäsolulinjoissa (taulukko 2). IC

50-arvot VX680 ja PHA739358 eri syöpäsolulinjoissa (paitsi OECM-1-solut) olivat 2-10 taittuu korkeampi kuin BPR1K653. IC

50s VX680 ja BPR1K653 olivat tasavertaisia ​​OECM-1-soluissa. Yhdessä tuloksemme osoittivat, että BPR1K653 kykenee inhiboimaan erilaisten syöpäsolujen riippumatta niiden kudoksen alkuperästä ja p53 status.

BPR1K653 on yhtä tehokas estämään kasvun moni- lääkeresistenssin proteiini (MDR1) ilmentävillä syöpäsolut

on laajalti osoitettu, että yli-ilmentyminen MDR1 (P-gp, lääke effluksipumpun) indusoi lääkeresistenssin erilaisiin kemoterapeuttiset aineet. Sen määrittämiseksi, onko teho BPR1K653 on kumottu MDR1 ilmentymistä syöpäsoluissa, kolme monilääkeresistenssi- MDR1-ilmentävien syöpäsolujen linjat, KB-VIN10, KB-S15 ja NTU0.017 [2], [38], [39], [ ,,,0],40], käsiteltiin BPR1K653. Kuten on esitetty taulukossa 3, IC

50-arvo BPR1K653 ja KB-VIN10 ja KB-S15 oli samanlainen kuin emo-MDR1-negatiivinen KB-soluissa. IC

50 BPR1K653 ja KB-VIN10, KB-S15 ja KB olivat 14 nM, 11 nM ja 12 nM, vastaavasti. Lisäksi IC

50-arvo BPR1K653 että MDR1-ilmentävien NTU0.017 soluissa oli myös samanlainen kuin emo-MDR1-negatiivinen NTUB1 soluissa (taulukko 3). Aiemmat tutkimukset osoittivat, että Aurora-kinaasi-inhibiittorit, VX680 ja PHA739358, ovat substraatteja MDR1 [24], [25]. Tasaisen, meidän kaikkien testattujen MDR1-ilmentäviä syöpäsolulinjoja osoitti ristiresistenttejä VX680 ja PHA739358 (taulukko 3). Lisäksi taso MDR1 ilmentymisen korreloi tason VX680 /PHA-739358 resistenssin KB-VIN10 ja KB-S15 syöpäsolujen (kuva 2). Edelleen onko tehoa VX680 ja PHA739358 in KB-VIN10, KB-S15 ja NTU0.017 solut todella vaikutti ilmaus MDR1 soluja yhteistyössä käsiteltiin MDR1 modulaattori (negatiivinen säätelijä), verapamiili, ja solujen elinkelpoisuus määritettiin. Tässä, verapamiili hoito (10 uM) oli osoitettu voi palauttaa /herkkyyden lisäämiseksi sekä VX680 ja PHA739358 kaikissa testatuista MDR1-ilmentävien syöpäsolujen (taulukko 3). Kuitenkin, verapamiili hoito ei lisätä herkkyyttä BPR1K653 sekä MDR-negatiivisia ja MDR1-ilmentävien syöpäsolujen (tuloksia ei ole esitetty). Toisaalta, on osoitettu, että KB johdettu VP-16 resistentti syöpä-solulinjasta, KB-7D, yli-ilmentää toinen tyyppi ATP-riippuvaiset multi-lääkevuoto- proteiinia, MPR1 [41]. Mielenkiintoista on, että IC

50-arvo BPR1K653 ja KB-7D oli myös samanlainen kuin emo-MRP1-negatiivinen KB-soluja (taulukko 3).

Yhteensä mRNA uutettiin soluista, ja RT-PCR- suoritettiin ekspression havaitsemiseksi MDR1 KB, KB-VIN10 ja KB-S15-soluissa. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina.

BPR1K653 indusoi endo-replikointi sekä MDR1-negatiivisten ja positiivisten syöpäsolujen

Lisäksi suoritettiin kokeita vahvistaa uudelleen edellä pääteltiin, että tehokkuutta BPR1K653 ei vaikuta MDR1 ilmentymistä soluissa. Aurora-kinaasien inhibition indusoi endo-reduplication solujen, mikä osoittaa, että muodostuu polyploidian [14]. Tässä tulokset immunofluoresenssimikroskoopilla ja virtaussytometria-analyysi osoitti selvästi, että BPR1K653 indusoi muodostumista polyploidian (väestön 4N) KB-soluissa (kuvio 3A ja B, ja kuvio S1A). MDR1-ilmentävät KB-VIN10 soluja käsiteltiin samalla pitoisuudet BPR1K653 kuin olisi sovellettu KB-solut indusoivat myös muodostumista polyploidian (kuvio 3A ja C, ja kuvio S1A). Sen sijaan, VX680 vain indusoi muodostumista polyploidian KB-soluissa, mutta ei KB-VIN10 solujen saman kohtelun pitoisuudet (kuvio 3A, B ja C). Kuitenkin muodostumista polyploidian väestöstä on esitetty KB-VIN10 solujen yhteistyötä käsiteltiin 10 uM MDR-inhibiittori, verapamiili, ja VX680 (kuvio 3C). Nämä tulokset ovat sopusoinnussa havaintojen edellä klonogeeniset määrityksessä että ilmentymistä MDR1 syöpäsoluissa vaikuttaa tehokkuutta VX680 mutta ei BPR1K653.

(A, B ja C) KB ja KB-VIN10 soluja käsiteltiin jossa BPR1K653 ja VX680 48 tuntia. (A) Nucleus värjättiin sininen Hoechstin värillä ja mikrotubuleihin leimattiin punaisella kanssa Alexa Fluor®-merkityn anti-tubuliinia vasta-aine. (B ja C) Soluja inkuboitiin propidiumjodidilla ja sitten analysoitiin virtaussytometrialla. (D ja E) hioa-1-soluja käsiteltiin BPR1K653 48 tuntia. (D) Nucleus värjättiin sininen kanssa Hoechstin värillä. (E) Soluja inkuboitiin propidiumjodidilla ja sitten analysoitiin virtaussytometrialla.

Sen määrittämiseksi, onko BPR1K653 indusoi myös endo-replikaation syöpäsolulinjoissa muut kuin KB ja sen johdannainen, hioa-1-soluja käsitelty BPR1K653 ja solun sisältö analysoitiin microcopy ja virtaussytometria. Sekä immunofluoresenssimikroskoopilla ja virtaussytometria analyysi osoitti selvästi, että BPR1K653 edistänyt muodostumista polyploidian (populaatioiden 4N) in hioa-1 solujen pitoisuudesta riippuvalla tavalla (kuvio 3D ja E).

BPR1K653 vähentää histoni H3 fosforylaatio ja sykliini B1 ilmaisun sekä MDR1-negatiivisten ja positiivisten syöpäsolujen

Western blot -analyysi suoritettiin vahvistaa uudelleen, että tehokkuutta BPR1K653 ei vaikuta MDR1 ilmentymistä syöpäsoluissa. Histoni H3 on suora substraatti Aurora-B-kinaasin, ja endo-replikoituva solut yleensä näytä ilmentämisen vähentymiseen sykliini B1. Tässä kokeessa estyminen histoni H3 fosforylaation ja alas-säätely sykliini B1 ilmaisun näytettiin sekä KB ja KB-VIN10 soluja käsiteltiin samalla pitoisuuksilla, 12 (IC

50), 24 (2 x IC

50) ja 36 nM (3 x IC

50) BPR1K653 pitoisuutena riippuvalla tavalla (kuvio 4A ja B). Yhdenmukaisesti näiden havaintojen VX680 hoitoon (eli 170 nM ja 255 nM) esti myös fosforylaatiota histoni H3 ja ilmaisu sykliini B1-KB-soluissa (kuvio 4A). Kuitenkin sama VX680 hoito voinut aiheuttaa edellä molekyylitason muutoksia MDR1 ilmentävien KB-VIN10 soluissa. Verapamiili hoito (10 uM) on esitetty palauttaa herkkyys VX680 KB-VIN10 soluja, kuten on osoitettu väheneminen histoni H3 fosforylaation ja sykliini B1 ilmentymistä (kuvio 4B).

(A) KB-solujen käsiteltiin BPR1K653 ja VX680 48 tuntia ja ilmentäminen erilaisten proteiinien määritettiin Western blot -analyysillä. Suhteellinen kaistaintensiteettejä näytettiin. (B) KB-VIN10 soluja käsiteltiin joko BPR1K653 tai VX680 /ilman verapamiili 48 tuntia, ja ilmentäminen erilaisten proteiinien määritettiin Western blot -analyysillä. Suhteellinen kaistaintensiteettejä näytettiin. (C) Hone-1-soluja käsiteltiin BPR1K653 48 tuntia, ja ilmentäminen erilaisten proteiinien määritettiin Western blot -analyysillä. Aktiini käytettiin sisäisen valvonnan.

Voit selvittää BPR1K653 vähentää myös histoni H3 fosforylaatiota ja sykliini B1 ilmentymistä syöpäsolulinjoissa muu kuin KB ja sen johdannainen, hioa-1-solujen käsiteltiin BPR1K653 ja solunsisäiset proteiinit analysoitiin Western-blottauksella. Western blot-analyysi osoitti selvästi, että sekä fosforylaatiota histoni H3 ja ilmaus sykliini B1 määrä väheni BPR1K653 saaneilla Hone-1-soluissa (kuvio 4C).

BPR1K653 indusoi apoptoosia sekä MDR1-negatiivisten ja positiivisten syöpä solut

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että kohdistaminen Aurora-kinaasien edistää solujen endo-replikointi ja myöhemmät solujen apoptoosin [14]. Sen määrittämiseksi, onko BPR1K653 pystyy aiheuttamaan apoptoosia sekä MDR1-positiivisia ja -negatiivinen syöpäsoluja, KB ja KB-VIN10 soluja käsiteltiin BPR1K653 ja apoptoottisia ominaisuuksia analysoitiin anneksiini-V, reaaliaikainen kaspaasi-3 /-7 aktiivisuus kuvantaminen ja TUNEL määrityksissä. Tässä sekä soluliman määrä ja koko ytimen on korotettu BPR1K653-käsitellyn KB ja KB-VIN10 soluissa, mikä osoittaa, että BPR1K653 indusoi solun endo-replikaation odotetusti (kuvio 5A ja C, ja kuvio S1A). Translokaation fosfatidyyliseriinin molekyylin sisäisen-esitteen solukalvon ulkokalvon osoittaa esiintyvän varhaisen apoptoosin. Tulokset anneksiini-V-määritys osoitti, että BPR1K653 indusoi translokaatiota fosfatidyyliseriinin molekyylin sekä KB ja KB-VIN10 soluja, kuten käy ilmi, että vihreä fluoresoiva leima (Kuvio 5A). BPR1K653 indusoi myös kaspaasi-3 /-7 toimintaa ja DNA: n fragmentoituminen sekä KB ja KB-VIN10 soluja samoissa käsittelyolosuhteissa (kuvio 5B, C, D, ja kuvio S1A). Sen sijaan, VX680 vain indusoi translokaatiota fosfatidyyliseriinin molekyylin, kaspaasi-3 /-7 aktiivisuutta ja DNA: n fragmentoituminen KB-soluissa eikä sen MDR1-ilmentävät KB-VIN10 soluja (kuvio 5A, B, C ja D). Lisäksi pilkkominen PARP vasta esitetty MDR1 ilmentävien KB-VIN10 soluja käsiteltiin joko BPR1K653 tai VX680 /verapamiilia (co-hoito), eikä VX680 yksin, paljastamat Western blot-analyysi (kuvio 5E).

(A, B ja C) KB ja KB-VIN10 solut ympättiin 8-kaivokammio dioja yhdessä yössä. (A) Soluja käsiteltiin joko BPR1K653 tai VX680 48 tuntia. Translokaation fosfatidyyliseriinin molekyylin soluissa analysoitiin anneksiini V-FLUOS määritys ja solut katsella esimerkiksi UV-käytössä mikroskoopilla. Yleinen solujen morfologia visualisoitiin faasikontrastimikroskopiaan. (B) Soluja käsiteltiin joko BPR1K653 tai VX680 60 tuntia ja MagicRed ™ -DEVD Reaaliaikainen kaspaasi-3 /-7 Activity Kit (Immunokemia Technologies LLC) käytettiin havaitsemaan kaspaasi-3 /-7 soluissa , kuten on esitetty punaisella fluoresenssiemission. Tuma vasta- värjättiin sininen Hoechst 33342, ja solut tarkastella reaaliaikaisesti käyttäen UV-käytössä käänteinen mikroskoopilla. (C ja D) Detection solujen DNA: n fragmentoituminen TUNEL-määrityksellä. KB ja KB-VIN10 soluja käsiteltiin joko BPR1K653 tai VX680 72 tuntia. DNA sirpaloitumista analysoitiin käyttämällä TMR-punainen

In situ

Cell Death Detection kit. Nucleus DNA hajanaisuus värjättiin punaiseksi. Tuma vasta- värjättiin sininen by DAPI. Solut analysoitiin UV-aktivoitu mikroskoopilla. (C) edustaja kuvia näytettiin. (D) Leimatut solut laskettiin, ja prosenttiosuus apoptoottisten solujen laskettiin seuraavasti: kokonaismäärä punaisen fluoresoivasti leimattuja (DNA hajanaiset) tuma käytettävissä ÷ kokonaismäärä sinisen fluoresoivan leimatun tumassa saatavilla × 100. Kokeet toistettiin kahdesti. (E) BPR1K653 indusoi pilkkominen PARP KB-VIN10 syöpäsoluja. KB-VIN10 soluja käsiteltiin joko BPR1K653 (2 x IC

50 kt) tai VX680 (2 x IC

50 KB) /ilman verapamiili 72 tuntia. Pilkkominen PARP määritettiin Western blot -analyysillä. Aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina.

BPR1K653 indusoi myös apoptoosin hioa-1-soluissa, kuten on osoitettu induktio caspae-3 /-7 aktiivisuus

in vitro

(kuvio S1B).

BPR1K653 tukahduttaa kasvun sekä ihmisten MDR1-negatiivisten ja positiivisten syövän ksenografteissa

in vivo

Vaikka edellä esitetyt tulokset osoittivat, että BPR1K653 osoittaa voimakas anti-syöpä vaikutus

in vitro

, suoritettiin kokeita sen määrittämiseksi, onko BPR1K653 pystyy myös inhiboimaan Aurora-kinaasien ja kasvua sekä MDR1-negatiivinen /kasvaimia

in vivo

. KB-soluja kasvatettiin kuten

s.c..

Kasvaimia nude-hiirissä. Kun vakiintunut KB ksenografteissa olivat palpoitavissa kasvaimen koon ~75 mm

3, hiiret satunnaistettiin ajoneuvon hallinnan ja hoitoryhmien viiden eläimen ryhmään. Käsitellyt hiiret saivat joko 15 mg /kg BPR1K653 tai 30 mg /kg VX680

vatsaontelon.

Varten 5 päivää /viikko 2 peräkkäisen viikon ajan. Tulokset immuno-histokemiallista analyysiä kasvainkudoksen osat osoittivat, että anto BPR1K653 vähentänyt fosfori-histoni H3-positiivisten solujen läsnä kasvainkudoksissa verrattuna kontrolliin (10% vs. 60%) (kuvio 6A). Pieneneminen kasvaimen kasvunopeus hiirillä hoidettiin joko BPR1K653 tai VX680 5 päivää /viikko 2 peräkkäisen viikon havaittiin myös. Oli ~73% vähennys kasvaimen tilavuuden päivänä 30 eläimet käsiteltiin BPR1K653 (P 0,05). Lisäksi oli ~68% vähennys kasvaimen tilavuuden päivänä 30 eläimet käsiteltiin VX680 (P 0,05; kuvio 6B). BPR1K653 oli hyvin siedetty annos 15 mg /kg ilman merkkejä myrkyllisyydestä KB ksenograftissa kasvain mallia kuin painonlaskua hoidon jälkeen oli alle 10% hoitoryhmässä kuin verrata kontrolliryhmän (kuvio 6C ). Sen määrittämiseksi, onko tuumorin kasvu BPR1K653-käsitellyillä hiirillä oli yhteydessä kasvaa apoptoottisten syöpäsolujen populaatiot, kasvaimet poistettiin kirurgisesti hiiristä 12 päivää hoidon jälkeen ja kudosleikkeiden analysoitiin TUNEL-määrityksellä. Tulokset TUNEL-määritys osoitti, että määrä apoptoottisten solujen läsnä tuumorikudoksessa BPR1K653-käsitellyistä hiiristä oli huomattavasti korkeampi kuin kontrolliryhmän hiirillä (55% vs. 7%) (kuvio 6D). Tämä on johdonmukaista tulosten kanssa edellä

in vitro

kokeilu, joka BPR1K652 pystyy aiheuttamaan syöpäsolujen apoptoosia.

(A, B, C ja D) Nude-hiiret, joilla on ihmisen kohdunkaulansyövän KB ksenografteja sai vehikkeliä ohjaus (⧫), 30 mg /kg VX680 5 päivää /viikossa 2 viikon ajan (päivinä 6-10 ja 13-17, ▴) tai 15 mg /kg BPR0L075 5 päivää /viikossa 2 viikon ajan (päivinä 6-10 ja 13-17, •). (A) BPR1K653 hoito vähensi fosfori-histoni H3-positiivisten solujen läsnä kasvainkudoksissa. Immuno-histokemiallinen analyysi ilmentymisen fosfori-histoni H3 kasvainkudossektioista 24 h kuluttua toisen BPR1K653 hallinnon. Nucleus värjättiin sininen /violetti hematoksyliinillä ja fosfori-histoni H3 oli merkitty ruskea väri. Leimatut solut laskettiin, ja prosenttiosuus fosfori-histoni H3-positiivisten solujen läsnä kasvainkudoksissa laskettiin seuraavasti: kokonaismäärä solujen ruskea väri leimatun Ö kokonaismäärä solujen käytettävissä x 100. Koe toistettiin kahdesti. Tilastollisesti merkittävä ero määrän fosfori-histoni H3-positiivisten solujen läsnä kasvainkudoksissa hiirissä, joita käsiteltiin kontrolli versus BPR1K653 merkitään ”*”. * P 0,05. (B) mittaus kasvaimen tilavuus. Tilastollisesti merkittävä ero tuumorin koko hiirissä, joita käsiteltiin kontrolli versus BPR1K653 ja VX680 merkitään ”*”. * P 0,05. (C) mittaus eläimen painoa. (D) TUNEL-analyysi kasvaimen kudosleikkeiden 12 päivää post-BPR1K653 hoitoon. Kasvainkudossektioista analysoitiin FITC

In situ

Solukuolemaan havaitseminen pakki ja fluoresenssimikroskopialla. Tissue käsiteltiin DNaasi käytettiin positiivisena kontrollina. Green fluoresenssileimattu tuma osoittaa induktioon DNA pirstoutuminen. Koe toistettiin kahdesti. Kvantitatiivinen analyysi näytettiin. Tilastollisesti merkittävä ero määrän apoptoottisten solujen läsnä kasvainkudoksissa hiirissä, joita käsiteltiin kontrolli versus BPR1K653 merkitään ”*”. * P 0,05. (E ja F) Nude-hiiriä, joissa on P-gp170 /MDR-ilmentävät KB-VIN10 ksenografti käsiteltiin ajoneuvon ohjaus (⧫), 30 mg /kg VX680 varten 5 päivää /viikko 3 viikkoa (päivinä 12-16, 19 -23 ja 26-30; ▴) tai 15 mg /kg BPR0L075 5 päivää /viikko 3 viikon ajan (päivinä 12-16, 19-23 ja 26-30; •). (E) mittaus kasvaimen tilavuus. Tilastollisesti merkittävä ero tuumorin koko hiirissä, joita käsiteltiin kontrolli versus BPR1K653 ja VX680 merkitään ”*”. * P 0,05. (F) mittaus eläimen painoa. Tiedot ovat keskiarvo ± SD kasvaimen tilavuus (mm

3) kunakin ajankohtana (n = 5; * P 0,05).

On huomattava, että BPR1K653 on myös tehokas kohti MDR1- ilmentäviä -tuumoriksenografti kuin se on viljelty MDR1-ilmentäviä soluja. Täällä, KB-VIN10 -tuumoriksenografti käytettiin tehon arvioimiseksi BPR1K653 vastaan ​​MDR1 ilmentävä kasvain

in vivo

. Johtuen hitaasti kasvavat ominaisuuksia KB-VIN10, käsitellyt hiiret saivat joko 15 mg /kg BPR1K653 tai 30 mg /kg VX680

ip

varten 5 päivää /viikko 3 peräkkäisen viikon ajan sen sijaan, että 2 viikkoa, kuten KB-istutettu hiiriin. Verrattuna kontrollihiiriin, kasvu KB-VIN10 kasvaimen estyi merkittävästi hiirissä, joita hoidettiin 15 mg /kg BPR1K653. Oli -50% lasku kasvaimen tilavuuden päivänä 42 käsiteltyjen eläinten kanssa BPR1K653 (P 0,05). Sen sijaan, VX680 ei ole havaittavissa merkittävää kasvaimen kasvua estävä vaikutus hiirillä, joihin on siirretty KB-VIN10 soluissa (kuvio 6E). Lisäksi BPR1K653 oli hyvin siedetty annos 15 mg /kg (5 päivää /viikko 3 peräkkäisen viikon ajan) ilman merkkejä toksisuudesta, että KB-VIN10 ksenografti kasvain mallia kuin painonlaskua hoidon jälkeen oli alle 10 % hoitoryhmässä kuin verrata kontrolliryhmän (kuvio 6F). Siten BPR1K653 kykenee voimakas kasvaimia torjuvaa tehoa kohti sekä MDR-negatiivisia ja MDR-ilmentäviä tuumoriksenografteja.

farmakokinetiikka BPR1K653 rotilla

Lopuksi farmakokineettisiä tutkimuksia BPR1K653 saatiin käytettäväksi yli 24 tuntia ajan tutkia plasman BPR1K653 kerta laskimoon (taulukko 4). Kerta-annoksen jälkeen ja BPR1K653 annoksella 5 mg /kg rotilla, BPR1K653 saavutti maksimipitoisuuden plasmassa, 10 uM (5463 ng /ml) 2 min annostelun jälkeen, ja arvioitu BPR1K653 plasmassa pysyi pitoisuutena 3,9 nM (2,1 ng /ml) 24 h annostuksen jälkeen. Plasman puoliintumisaika, kokonaispuhdistuma ja jakautumistilavuus vakaassa tilassa (Vss) oli 3,9 ± 0,7 h, 49,3 ± 10,6 ml /min /kg ja 10,6 ± 5,1 l /kg.

keskustelu

Aurora-kinaasien ovat nousseet keskeisiksi säätelijöinä mitoosin ja todisteet osoittavat poikkeavuuksia niiden ilmaisun ja aktiivisuus ovat läheisesti kehittymistä ja etenemistä eri syöpiä. Tässä tutkimuksessa olemme kehittäneet uuden yleiseurooppalaisen Aurora estäjä BPR1K653 ja edelleen osoitti sen tehoa kohdentamisessa eri syöpien

in vitro

. Meidän läpäisevän röntgen- co-crystallography tutkimukset olivat osoittaneet fyysisen vuorovaikutuksen esiaste yhdiste BPR1K653 ja Aurora-kinaasien [42], ja nykyinen

in vitro

kinaasin eston tutkimus on vahvistanut kohde spesifisyys BPR1K653. Yhdenmukainen molekyylimuutokset havaittu soluissa, joita käsiteltiin Aurora-B-kinaasin erityisiä siRNA oligoja ja eri yleiseurooppalainen Aurora estäjät kuten VX680 ja SNS-314 [14], [43], [44], BPR1K653 hoito indusoi myös endo- replikointi solujen ja vähentää määrää fosforyloidun histoni H3 läsnä soluissa. Lisäksi, BPR1K653 kykenee indusoimaan syöpäsolujen apoptoosia, mutta ei autophagy (kuvio S2), joka on yhteinen tulos käsitellyissä soluissa Aurora-kinaasin estäjien [43]. Mielenkiintoista, BPR1K653 toimii kaikilla testatuilla p53-villityypin /-negatiivinen /-mutant syöpäsolulinjoja pienillä nano-moolipitoisuuksien (IC

50 20 nM), vaikka rajallinen kyky toisen yleiseurooppalaisen Aurora estäjät VX680 aiheuttavan endo-replikointi ja myöhemmät apoptoosin on osoitettu syöpäsolujen normaalin p53-riippuvaisen postmitoottisia tarkistuspiste toiminto toisessa tutkimuksessa [14]. Yhdessä BPR1K653 selektiivisesti estämään Aurora-kinaasien, ja toisin kuin VX680, se voi kohdistaa erilaisia ​​syöpäsoluja riippumatta p53:.

Lääkeaineresistenssi on yleinen ongelma hallintaan neoplastiset sairaudet, ja tehokkuutta monien kemoterapeuttisten rajoittaa se, että ne ovat substraatteja effluksipumpun MDR1 (P-gp170). Esimerkiksi Aurora-kinaasin estäjä AZD1152 /AZD1152-HQPA (Barasertib) osoitettiin olevan substraatti MDR1 [24]. Lisäksi meidän viittaus Aurora estäjät, VX680 (Tozasertib) ja PHA-739358 (Danusertib), olivat aikaisemmin osoitettu tehottomaksi kohdentamisessa MDR1 ilmentävien SA-Dx5 (doksorubisiini kestävä), MB-231-PTX ja H460-PTX (molemmat paklitakseli kestävä) syöpäsolujen muut tutkijat [25]. Tässä tutkimuksessa BPR1K653 osoitettiin olevan yhtä tehokas kaksi KB-johdettu MDR1-positiivisia syöpäsolulinjoja (KB-VIN10 ja KB-S15) ja yksi NTUB1-dervided MDR1-positiivisen syövän solulinja (NTU0.017)

in vitro

. Tämä ominaisuus on selvästi erilaisia ​​kuin hyvin tunnettu Aurora estäjät, VX680 ja PHA-739358, koska testattu MDR1-positiiviset syöpäsolut ovat vastustuskykyisiä näiden kemoterapeuttisten aineiden kuin vanhemman MDR1-negatiivisia soluja. Todellakin, co-inkuboimalla MDR1 inhibiittoria, verapamiilia, on osoitettu olevan tehokas uudelleen herkistämällä MDR1-ilmentävien syöpäsolujen sekä VX680 ja PHA-739358, kun taas saman kohtelun ei lisätä herkkyyttä BPR1K653 kummassakaan MDR1- negatiivinen (KB ja NTUB1) eikä MDR1-ilmentäviä soluja (KB-VIN10, KB-S15 ja NTU0.017). Tärkeää on, BPR1K653 on myös tehokas kasvun estämiseksi sekä MDR1-negatiivinen KB ja MDR1-ilmentävien KB-VIN10 syöpäsolujen

in vivo

, tukee oletusta, että yli-ilmentyminen yhteisen lääkkeen effluksipumpun MDR1 voisi ei häiritse tehoa BPR1K653 kohdentamisessa syöpäsoluihin. Koska kemoterapeuttisten yhdisteiden, kuten paklitakselin, vinkristiinin (anti-mikrotubulus aineet), doksorubisiini (DNA interkalaatioaine), tretinoiinia (

kaikki-trans

retinoiinihappo), mitoksantroni, VP-16 (topoisomeraasi II estäjien) ja imatinibi (