Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

neurotrofiinireseptoreiden alun perin tunnistettiin hermosoluissa. He olivat äskettäin havaittu joidenkin syöpien yhdessä invasiivisuus, mutta toiminto näiden tyrosiinikinaasireseptoreihin ei aiemmin tutkittu peräsuolen syöpä (CRC) soluja.

menetelmät ja havainnot

Me raportoimme tässä että ihmisen CRC solulinjat tiivistetään hermo kasvutekijä Brain-hermokasvutekijä (BDNF) stressiolosuhteissa (seerumistarvaatio). Samanaikaisesti CRC solut ilmensivät korkea (TrkB) ja matalan affiniteetin (p75

NTR) reseptoreita solukalvon, kun taas TrkA ja TrkC, kaksi muuta korkea affiniteettireseptorin NGF: n ja NT-3, vastaavasti, olivat havaittavissa. Osoitamme, että BDNF indusoi solujen lisääntymistä ja oli antiapoptoottisena vaikutus välittyvät TrkB, arvioituna K252a, joka on Trk farmakologinen estäjä. Se tukahdutti sekä solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen CRC solujen, jotka eivät ilmennä TrkA eikä TrkC. Samanaikaisesti kasvu BDNF eritystä, sortilin, proteiini toimii neurotrofiini kuljettaja sekä co-reseptorin p75

NTR, lisättiin sytoplasmassa primaarinen ja metastaattinen CRC soluja, mikä viittaa siihen, että sortilin voivat säännellä neurotrofiinireseptoreiden liikenteen näissä soluissa. Kuitenkin pro-BDNF, myös havaittu CRC-soluissa, oli koekspressoitu p75

NTR at solukalvon ja yhteistyössä paikallistaa sortilin. Toisin kuin BDNF, eksogeenisen pro-BDNF aiheuttama CRC apoptoosin, mikä viittaa siihen, että vastapaino mekanismi osallistuu valvontaan CRC solujen selviytymisen kautta sortilin kuten co-reseptorin p75

NTR, korkean affiniteetin reseptori pro- neurotrofiinit. Samoin, osoitamme, että BDNF ja TrkB selostukset (eikä p75

NTR) on yli-ilmentyy potilaiden kasvaimia verrattuna niiden viereisten normaaleissa kudoksissa, erityisesti pitkälle edennyt CRC.

Johtopäätös

Yhteenvetona nämä tulokset korostavat, että BDNF ja TrkB ovat välttämättömiä CRC solujen kasvua ja selviytymistä in vitro ja in kasvaimia. Tämä autokriinisen silmukka voi olla suuri merkitys määrittelemään uusia hoitomuotoja kehitettäessä.

Citation: Akil H, Perraud A, Melin C, Jauberteau MO, Mathonnet M (2011) hienosäätö roolit Endogeenisen Brain-hermokasvutekijä , TrkB ja Sortilin kolorektaalisyövässä Cell Survival. PLoS ONE 6 (9): e25097. doi: 10,1371 /journal.pone.0025097

Editor: Mark P. Mattson, National Institute on Aging Intramural tutkimusohjelma, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 23 elokuu 2011; Julkaistu: 26 syyskuu 2011

Copyright: © 2011 Akil et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Ligue contre le Cancer ja Conseil régional du Limousin. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Brain-hermokasvutekijä (BDNF), jäsen neurotrofiiniryhmän, tiedetään olevan keskeinen rooli modulaatiota solujen selviytymisen, erilaistumisen ja apoptoosin hermoston [1].

BDNF signaaleja kahden solun pinnan reseptorien: korkean affiniteetin tropomyosin liittyvä kinaasi (Trk) reseptorin B (TrkB), tyrosiinikinaasi-reseptorin ja matalan affiniteetin reseptori (p75

NTR), sekä kuoleman domeenin reseptori kuuluvat tuumorinekroositekijä (TNF) reseptorin perhe, yhteinen reseptori kaikki neurotrofiinit hermokasvutekijä (NGF), neurotrofiini-3 (NT-3), ja neurotrofiini-4/5 (NT-4/5 ). Neurotrofiinit syntetisoidaan esiasteita (proneurotrophins), jotka proteolyyttisesti kypsä neurotrofiinien. Pro-BDNF lohkaisu voi tapahtua joko solunsisäisesti toiminnan furiinin tai proconvertase, sisällä tai sen ulkopuolella, että plasmiinin, matriksin metalloproteinaasi 7 (MMP-7) tai MMP-9 [2]. Sekä kypsä BDNF ja pro-BDNF ovat biologisesti aktiivisia, toisistaan ​​poikkeavia rooleja, jotka heijastavat erilaisia ​​affiniteettia: pro-BDNF näyttää suuremmat affiniteetit p75

NTR, kun taas kypsät BDNF on suurempi affiniteetti TrkB.

BDNF sitoutuu 145 TrkB täyspitkän reseptorin ja katkaistu gp95TrkB variantti, joka säilyttää suora signalointi toiminta [3] ja lisää spesifisyyttä BDNF [3], [4], [5]. Vaikka Trk-reseptorit ovat mukana useimmissa selviytymisen ja kasvun ominaisuudet neurotrofiinien, toiminnot p75

NTR, laajalti tutkittu hermosoluissa, riippuu hermosolujen tyyppi, ligandin läsnäolon, ja yhdistys on yhteis- reseptoriin. Todellakin, p75

NTR liittyy Trk koreseptorin Parantaa [6] tai tukahduttaa neurotrofiini-välitteisen solujen eloonjäämistä [7]. Se on äskettäin osoitettu olevan kykenee sitomaan pro-BDNF ja aiheuttavat solujen kuoleman, kun liittyy sortilin (jäsenen Vps10p-domain-reseptorit perheen) [8], [9], [10].

Siten sääntely pro-BDNF käsittely lisää ylimääräisiä valvoa tasapaino p75

NTR ja TrkB sitoutuminen [11], [12]. Antiapoptoottisten toiminta BDNF välittyy vaikka vuorovaikutuksen korkean affiniteetin reseptorit 95 ja 145TrkB [5], kun taas pro-BDNF indusoi apoptoosin kautta vuorovaikutus reseptorin kanssa kompleksin p75

NTR ja sortilin [10], [13].

Sortilin on ilmaistu useissa kudoksissa, erityisesti aivojen, selkäytimen, sydän, lihas, rasvasolut [14] ja B-lymfosyytit [8]. Sortilin alun perin kuvattu ihmisen hermosoluissa kuin solunsisäinen liikenne proteiinia neurotrofiinien ja proneurotrophins [15] ja viime aikoina, koska kuljettaja Trk neurotrofiinireseptoreiden sisään hermosoluihin [16]. Lisäksi sortilin oli myös tunnettu co-reseptori (NTSR3) on G-proteiiniin kytketyn reseptorin neuro- reseptori-1 (NTSR1), joka aktivoituu neurotensiini [17]. Neuro- alun perin osoitettu olevan rooli kasvun ja eloonjäämisen kolorektaalisyövän (CRC) soluja, sen sitoutumisen kautta tähän sortilin /NTSR1 kompleksin [18].

BDNF on patogeneesiin ja ennusteen lukuisia ihmisen maligniteettien, kuten neuroblastoomat [19], [20], medulloblastooman [21], eturauhassyöpä [22], [23], keuhkosyöpä [24], haimakarsinooma [25], [26], [27], ja maksasyövän [28]. CRC, yli-BDNF [29] ja TrkB [30] äskettäin raportoitu potilaiden kudoksissa mutta tietoja käsittelee toimintaa BDNF kriinisenä silmukoita CRC solujen eloonjäämistä. Koska TrkB ilmentyminen liittyy useisiin syöpiin; tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli määritellä ehdot endogeeninen eritys BDNF ja ilmaisun neurotrofiinireseptoreiden CRC. Tässä osoitamme, että endogeeninen BDNF erittyy CRC-solut toimitti seerumideprivaatiolle ja indusoi solujen eloonjäämistä kautta TrkB tyrosiinikinaasireseptori, joka ilmentyy kalvon korosti soluja. On huomionarvoista, että TrkB ja BDNF ilmentymistä parannettu potilaiden kasvaimia etenkin myöhemmissä vaiheissa. Yhdessä nämä tiedot korostavat merkitystä BDNF /TrkB väylän kasvun ja potentiaalia invasiivisuus CRC.

Materiaalit ja menetelmät

Solut ja kulttuuri

Ihmisen CRC solulinjat vastaavat eri kasvaimen vaiheissa hankittiin American Type Culture Collection. WiDr [31] ja SW480 [32] olivat ensisijainen CRC solulinjat, kun taas kaksi muuta riviä olivat peräisin CRC etäpesäkkeitä, imusolmuke (SW620 peräisin samasta potilaasta kuin SW480 viiva) [32] ja askitis (COLO 205) [33]. Perusolosuhteissa, WiDr-solut ylläpidettiin MEM-alustassa (Gibco), jota oli täydennetty 10% lämmön avulla inaktivoitua sikiövasikan seerumia (FCS) (Gibco), 1 mM natriumpyruvaattia (Gibco), 1% ei olennaisia ​​aminohappoja (Gibco), 100 IU /ml penisilliiniä ja 100 mg /ml streptomysiiniä (Gibco). SW480, SW620 ja COLO 205 riviä viljeltiin RPMI-alustassa (Gibco), jota oli täydennetty 10% FCS, 100 IU /ml penisilliiniä ja 100 mg /ml streptomysiiniä, 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, ja 5% CO2: ta. Viljellyt solut korosti 24-72-h seerumistarvaatio. Hiiren antagonistista anti-BDNF monoklonaalinen vasta-aine (mAb) klooni 35928,11 (10 ug /ml) hankittiin Calbiochem. Rekombinantti ihmisen BDNF (100 ng /ml), rekombinantti-pro-BDNF (4 ng /ml), ja K252a (200 nM) ostettiin Alomone labs.

Potilaat ja kudosnäytteiden

Kaikki potilaasta johdettujen kudoksia kerättiin ja arkistoitu kello Tumorotheque Limogesin yliopistollisen sairaalan, pöytäkirjojen mukaisesti hyväksymä Institutional Review Board (AC N 2007-34, DC 2008-604 ja 72-2011-18). Kirjallinen suostumus saatiin kaikkien aineiden tätä tutkimusta varten. Kasvaimen kudokset saatiin 20 potilasta, joille tehtiin kirurginen poisto CRC Limoges yliopistollisen sairaalan välillä tammikuussa 2006 ja helmikuussa 2007. Neljä adenokarsinooma potilasta vaiheessa (mukaan pTNM luokitusta [34]) on valittu tämän tutkimuksen. Kudokset neljästä potilailla, joilla on hyvänlaatuinen peräsuolen sairauden, megadolichocolon, käytettiin kontrolleina.

RT-PCR-analyysi

CRC solulinjoja viljeltiin elatusaineessa, joka sisälsi tai ei 10% FCS 24-72 -h. SV kokonais-RNA: eristäminen (Promega) käytettiin eristämään kokonais-RNA solulinjoissa, kuten on kuvattu valmistajan ohjeiden mukaisesti. Määrä RNA: ta määritettiin kvantitatiivisesti mittaamalla absorbanssi 260 nm: ssä käyttäen Nanodrop spektrofotometriä ND-1000 (Labtech). Puhtaus RNA tarkistettiin suhde DO260 /DO280 nm välillä 1,83 ja 2,00. Koska RNA: n hajoaminen vahvistettiin elektroforeesilla 1,5% agaroosigeelillä, joka sisälsi etidiumbromidia. RNA: n eristäminen potilaiden kudoksista suoritettiin, kuten on kuvattu [35]. Ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi synnytettiin käyttäen SuperScript III (Invitrogen). PCR suoritettiin käyttämällä Taq-DNA-polymeraasia (Invitrogen). Kokonais-RNA eristettiin ihmisen neuroblastooma solulinjojen (IMR32, SH-SY5Y) ja ihmisen erythromyeloblastoid leukemian K562-soluja käytettiin positiivisina kontrolleina. Non-käänteiskopioitiin näytteistä (valmistaja jättämällä pois käänteiskopioijaentsyymin) ajettiin rinnakkain käänteistranskriptoituneet näytteiden jättää saastumisen genomista DNA.

Alukkeet suunniteltiin käyttäen Primer 3 (edellyttäen julkisia by Whitehead Institute for Biomedical Research /MIT Center for genomitutkimuksen, Cambridge, MA, ja saatavilla https://www.wi.mit.edu). Suunniteltu alukepareja luetellaan yhdessä niiden odotettua tuotetta koon ja hehkutuslämpötiloja taulukossa 1.

Yhdistelmät

uuton jälkeen PCR-tuotteiden Rapid PCR puhdistusjärjestelmät (MARLIGEN biotieteiden), mukaan valmistajan ohjeiden, PCR-tuotteet sekvensoitiin suoraan käyttäen BigDye® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems), joka GeneAmp® PCRSystem 2700 lämpösyklilaitteessa (Applied Biosystems). Fragmentit puhdistettiin saostus isopropanolilla. Sekvensointi Geeli ajettiin automaattisella laser fluoresoiva DNA-sekvensseri ABI PRISM® 3130 × l Genetic Analyser (Applied Biosystems) ja homologioille tarkastettiin käyttämällä Finch TV, puhalluksen jälkeen kanssa BDNF, TrkB145, TrkB95, p75

NTR, ja sortilin GenBank-sekvenssit (NM_001143816, NM_001018064, NM_001007097, NM_002507 ja NM_002959, vastaavasti).

Western blot

hiiren anti-BDNF (1 ug /ml) ja hiiren anti-TrkB (1 ug /ml) vasta-aineiden (Ab: t) hankittiin yhtiöstä R 1 ug /ml) Abs Santa Cruz Biotechnology, kanin anti-TrkA (1:1000), kanin anti-TrkC (1:1000) ja hiiren anti-Akt (1:2000) Abs Cell Signaling Technology. Aliyhtyvät solulinjoja viljelmiä hajotettiin (5 minuuttia jäällä) kun dosviljelypulloihin 1 × Cell hajotuspuskuria (Cell Signaling Technology), joka sisältää 1 mM PMSF (Sigma-Aldrich). Suspensiota sonikoitiin 1 min (a tykytys 40 Hz joka 20. sek) hajoaminen kromosomi-DNA ja sentrifugoitiin 14000 g: ssä 10 minuutin ajan. Supernatantit kerättiin ja proteiinipitoisuus määritettiin käyttämällä Bradford-proteiinin pitoisuus määrityksessä (Sigma). SDS-PAGE suoritettiin, ja proteiinit olivat elektro-blotattiin PVDF-membraaneille (BIOTRACE ™). Tunnin inkuboinnin jälkeen huoneen lämpötilassa estoliuoksessa (5% rasvatonta kuivamaitoa PBS: ssä), kalvot altistettiin erityisen ensisijainen Abs blokkausliuoksessa yön yli 4 ° C: ssa. Sitten membraanit pestiin kolmesti 5 min TBS /0,1% Tween-20 ja immunoreaktiot havaittiin piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista Ab hiiri, kani tai vuohi Ig (DakoCytomation) laimennetaan 1:2000 blokkausliuoksessa 1 h huoneenlämpötilassa. Pesun jälkeen visualisointi immunokompleksien suoritettiin käyttäen Immobilon Länsi Kemiluminesenssiin HRP Substrate (Millipore). Proteiini-lastaus ohjaus suoritettiin anti-Actin Ab (Cell Signaling Technology). Western blotit skannattiin käyttäen bio-kuvantamisjärjestelmä (Genesnap, Genetool, Syngene-). Densitometristä analyysit suoritettiin käyttäen ImageJ ohjelma (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA https://rsb.info.nih.gov/ij/). Proteiinin ilmentyminen määritettiin suhteelliset yksiköt viitaten aktiinin ilmentymistä.

Immunofluoresenssi

Solut kasvatettiin 12 mm: n peitinlasit kiinnitettiin 4% PFA huoneen lämpötilassa 30 minuuttia, ja läpäiseviksi tai 0,1% Triton X-100. Epäspesifinen sitoutuminen estettiin 30 minuutin inkuboinnin PBS-2% BSA: ta huoneenlämpötilassa. Peitinlasit inkuboitiin sitten yön yli 4 ° C: ssa blokkausliuoksessa ensisijaisen Ab. Seuraavat Abs käytettiin: kanin anti-BDNF Ab (1 ug /ml; Santa Cruz Biotechnology), kanin anti-pro-BDNF Ab (8 ug /ml; Alomone Labs), hiiren anti-TrkB Ab (2,5 ug /ml; R Santa Cruz Biotechnology) ja vuohen anti-sortilin Ab (1 ug /ml; Santa Cruz Biotechnology). Solut pestiin 3 kertaa PBS: ssä, ja inkuboitiin 2 tuntia huoneen lämpötilassa Alexa Fluor-konjugoidun sekundaarisen Ab (Invitrogen) laimennettuna 1:5000 PBS: ssä. 3 pesun jälkeen PBS: ssä, tumat värjättiin 5 minuutin ajan DAPI. Sen jälkeen intensiivisen pesujen peitelaseja ylösalaisin objektilaseille ja asentaa Dako Fluorescent Mounting Medium (DakoCytomation). Negatiiviset kontrollit olivat soluja inkuboitiin merkityksetön normaali kanin, hiiren tai vuohen IgG (Sigma). Kuvat otettiin käyttäen -konfokaalimikroskoopilla (Carl Zeiss, LSM 510); pinta tonttien fluoresenssin tietoja tuotettiin ImageJ ohjelma.

ELISA

Kun 24-h, 48-h ja 72-h kulttuuri, näytteet supernatantin solulinjoista kerättiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes päivän määrityksen. Immunomääritykset Systems (Promega), joka on spesifinen BDNF suoritettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM (pg /ml). Vähintään kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin kullekin koetilalle, joista jokaisella on mittausten kolmena kappaleena.

soluproliferaatiomäärityksissä

Solulisääntyminen mitattiin käyttämällä Click-se edu Alexa Fluor 488 Virtaussytometriaa määritys ( Invitrogen), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, soluja (2 x 10

5 per kuoppa) inkuboitiin yön yli kahdentoista kuoppalevyille ennen hoitoa, sitten viljellään 24-h seerumittomassa väliaineessa tai ilman eksogeenisen BDNF, K252a tai molemmat BDNF ja K252a lisättiin samanaikaisesti . Leviämisen arvot mitattiin käyttäen BD LSRFortessa virtaussytometrialla (BD Biosciences). Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena, ja kolme sarjaa 50000 Solut kerättiin jokaisen kunnossa. Tiedot hankittiin ja analysoitiin BD FACSDiva 6.0 -ohjelmisto (BD Biosciences). Jokainen koe toistettiin ainakin kolme kertaa.

apoptoosimäärityksessä

Apoptoosi mitattiin havaitseminen sytoplasmisen liukoisen nukleosomien käyttäen kalorimetristä määritystä, Cell Death Detection ELISAPLUS kit (Roche Molecular Diagnostic) mukaisesti valmistajan ohjeita. Absorbanssiarvot mitattiin 405-490 nm: ssä kahdella aallonpituudella. Absorbanssi saatu valvonnan oli normalisoitu arvoon 1, kuten aiemmin on kuvattu [7]. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja toistettiin ainakin kolme kertaa.

Tilastollinen

Tilastollinen merkittävyys määritettiin yksisuuntaisella Varianssien (ANOVA), jossa StatView 5.0 ohjelmisto (Abacus Concepts ).

P

arvojen 0,05 pidettiin merkittävinä. Mean ja SEM-arvot saatiin vähintään 3 itsenäisen kokeen.

Tulokset

peräsuolen syövän solulinjat ilmentävät TrkB ja p75

NTR mutta ei TrkA tai TrkC reseptoreihin

TrkB ja p75

NTR ilmaisuja havaittiin CRC solulinjoissa alle pohjapinta (10% FCS) viljelyolosuhteet, sekä mRNA (kuvio 1A) ja proteiini (kuvio 1 D) tasot joitakin eroja riippuen solulinjoissa. Kun taas täyspitkä TrkB (TrkB145) ja p75

NTR transkriptien olivat hallitseva ensisijaisen (SW480) ja etäpesäkkeiden (SW620) viiva (Kuva 1A) (kaksi solulinjaa eristetty samalta potilaalta), voimakkaimmin ilmaisi selostukset olivat katkaistun isomuodon (TrkB95) kaikissa solulinjoissa (kuvio 1A), lukuun ottamatta WiDr-solut, jotka ilmensivät TrkB95 ja p75

NTR vasta 48-h seerumideprivaatiolle (kuvio 1 B). TrkB ja p75

NTR sekvensoinnin jälkeen aga- eluoinnin geelit validoitu nämä tulokset. Kuitenkin TrkA ja TrkC transkriptit (kuvio 1C) samoin kuin proteiinien reseptorit (kuvio 1 D) ei havaittu, mikä Viljelyolosuhteet, toisin kuin erythromyeloblastoid leukemia K562-solulinja tunnetaan ilmaista nämä neurotrofiinireseptoreiden [36].

(A): RT-PCR: BDNF, sen korkea (TrkB) ja matalan (p75

NTR) affiniteetti reseptoreihin, TrkA, ja TrkC viljeltyjen solujen in pohjapinta (10% FCS), WiDr (kaista: 1 ), SW480 (kaista 2), SW620 (kaista 3), COLO 205 (kaista 4). GAPDH mRNA-tasot käytettiin sisäisenä kontrollina. Positiivinen kontrolli (kaista 5) oli neuroblastoomasolulinjasta (IMR32) varten BDNF, TrkB ja p75

NTR; ja erythromyeloblastoid leukemiasolujen (K562) ja TrkA: ta ja C. edustaja tulos vähintään kolmen tai viiden itsenäisen kokeissa. (B) vertailu TrkB95 ja p75

NTR kokonaismäärään RNA: sta WiDr soluista viljeltiin 10% FCS tai 24 72 tuntiin seerumideprivaatiolle (0% FCS). TrkB95 ja p75

NTR mRNA /GAPDH mRNA kvantifiointiin kaistaintensiteettejä arvioitiin densitometrisesti yläpuolella näkyvät kaistat ja ilmaistaan ​​mielivaltaisina yksikköinä (keskiarvo kolmesta itsenäisestä kokeesta). (C) Sama koe: RT-PCR-TrkA ja TrkC on kokonais-RNA uutettiin WiDr-solut viljeltiin pohjapinta viljelyolosuhteissa (10% FCS), ja sen jälkeen 24-72 h seerumistarvaatio verrattuna positiiviseen kontrolliin (K562) (D) Expression of pro-BDNF ja BDNF, täyspitkät TrkB 145 ja katkaistun TrkB 95 ja p75

NTR proteiineja CRC solulinjoja viljeltiin 10% FCS. TrkA ja TrkC ei havaittu. Aktiini käytettiin lastaus proteiinin valvontaa. WiDr (kaista 1), SW480 (kaista 2), SW620 (kaista 3), COLO 205 (kaista 4). Positiivinen kontrolli (kaista 5) olivat IMR32 solujen BDNF, pro-BDNF, TrkB ja p75

NTR ja K562-solujen tai TrkA ja TrkC. Edustava tulos vähintään kolmen itsenäisen kokeen.

CRC solut tuottavat endogeenistä BDNF

Koska CRC ilmaisi TrkB reseptoreita, etsittiin endogeeninen tuotanto BDNF, joka on TrkB ligandi. BDNF mRNA havaittiin kaikissa tutkituissa solulinjoissa alle pohjapinta (10% FCS) olosuhteet, pääasiassa kaksi ensisijaista CRC riviä (WiDr- ja SW480). Mielenkiintoista on, että seuraavat seerumin nälkään 24-72 h, BDNF mRNA-tasot (kuvio 2A), sekä kypsän BDNF-proteiinia (17 kDa) havaittiin Western blot solulysaateista, kehitettiin neljässä CRC-soluja (kuvio 2B), kun osoittaneet densitometrialla arvot (BDNF /GAPDH suhteet mRNA ja BDNF /Actin suhteet proteiinit) (kuvio 2A, B). Lisäksi BDNF eritys havaittiin ELISA: lla viljelmän supernatantista CRC solulinjoissa. BDNF vapautuminen lisääntyi merkitsevästi seerumin nälkään kaksi ensisijaista WiDr- ja SW480 CRC solulinjoissa (kuvio 2C ja taulukko 2), kun taas, se ei merkittävästi parannettu metastaattisessa SW620 ja COLO 205 CRC solulinjoja (taulukko 3). Seerumideprivaatiolle lisännyt BDNF solulimassa näiden neljän solulinjojen kuten on esitetty SW480 kuviossa 2D. Määrällisesti vihreän fluoresenssin intensiteetti jokaisessa viljelyolosuhteet vahvisti havainnot fluoresenssi kuvien (kuvio 2D) ja vahvisti saatuja tuloksia Western-blottauksella.

(A) BDNF tuotanto määritettiin RT-PCR kokonais- RNA: sta soluja viljellään perustilan (10% FCS) ja 24 72 tuntiin seerumideprivaation. Kvantifiointi kaistaintensiteettejä näkyy yllä (keskiarvo kolmesta itsenäisestä kokeesta). (B) BDNF ilmentymistä western blotting (viitaten aktiini) in totaalisoluproteiinia uutettu solulinjoista viljeltynä perustilan (10% FCS) ja sen jälkeen 24-72 h Seerumideprivaation (0% FCS). Mukaan densitometristä analyysien, kvantifiointiin osoitti merkittävää voimistunutta ilmentymistä BDNF viljellyissä soluissa. Histogrammit ovat keskiarvoja ± SEM vähintään kolmen itsenäisen kokeen. **,

p

0,01; ***,

p

0,001, verrattuna perus viljelyolosuhteet. (C) eritys BDNF arvioitiin ELISA supernatanttiin WiDr- ja SW480 solulinjojen perustilan (10% FCS) ja sen jälkeen 24-72 h Seerumideprivaation (0% FCS). Tulokset on ilmaistu keskiarvona ± SEM kolmen rinnakkaisen kolmesta eri kokeesta. ***,

p

0,001, verrattuna perus kulttuurin kunnossa. (D) vertailu BDNF ilmentymistä SW480 soluja viljeltiin 10% FCS ja jälkeen 72-h seerumideprivaation. Konfokaalimikroskopia anti-BDNF Ab ja Alexa fluor-488-konjugaattia (vihreä) ja ytimet laskuri värjättiin sinistä fluoresoivaa DNA tahra DAPI. Suhteellinen kvantitointi arvioitiin vihreän fluoresenssin pinta juoni. Kuvat olivat edustavia vähintään kolmen itsenäisen kokeen. Mittaviivat 10 pm. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin kolmen muiden linjojen (tuloksia ei ole esitetty).

seerumistarvaatio indusoi membranous ilmaus TrkB ja sen rinnakkaispaikantumisen BDNF

Havainto että endogeeninen BDNF erittyy alle seerumistarvaatio olosuhteissa johti meidät etsimään ilmaus on voimakkaasti reseptoriin. Tyvi- (FCS sisältävät) viljelmät (kuvio 3A, C), korkean affiniteetin reseptorin TrkB ja sen ligandin BDNF olivat erottautuvat kaikissa CRC solulinjoissa. 24-h seerumistarvaatio indusoi siirtäminen TrkB: n solukalvoon (kuvio 3B, D). On kiinnostavaa, että rinnakkais- TrkB: n ja BDNF kalvon havaittiin kaikissa tutkituissa solulinjoissa ja saavutti maksimin 72 tunnin puutetta, kuten on esitetty WiDr ja COLO 205-solut (kuvio 3B, D). Samanlaisia ​​värjäyskuviot saatiin SW480 ja SW620 (tietoja ei ole esitetty). -parin At kalvo sekä TrkB ja endogeenisten BDNF ehdottaa, että BDNF ja TrkB voitaisiin osallisena autokriini silmukan korosti CRC soluissa.

Konfokaalimikroskopia of WiDr- (A, B) ja COLO 205 (C, D -solut), värjättiin anti-BDNF Ab (punainen), anti-TrkB mAb (vihreä) tai molemmat (overlay), viljeltiin 10% FCS: ää (A, C) tai sen jälkeen 24-h seerumideprivaatiolle (B, D). Under pohjapinta viljelyolosuhteet (10% FCS), TrkB ja BDNF olivat erottautuvat sytoplasmassa (nuolet) in WiDr- (A) ja COLO 205 (C) solut. Sama värjäyskuviot saatiin kahden muun solulinjat (tietoja ei esitetty). Sen jälkeen seerumistarvaatio siirtäminen solukalvon ja rinnakkaispaikantumisen TrkB: n ja BDNF (keltainen yhdistettiin, nuolet) havaittiin WiDr- (B) ja COLO 205 (D). Kuvat olivat edustavia vähintään kolme-viisi riippumatonta kokeita.

BDNF edistää proliferaatiota ja eloonjäämistä CRC solulinjojen avulla TrkB

määrittämiseksi tehtävä tämän ligandi-reseptori järjestelmä leviämisen ja selviytyminen WiDr-, SW480, SW620 ja COLO 205 CRC-solujen, lisääntymistä ja apoptoosia määritykset suoritettiin eksogeenista BDNF joko FCS-vapaassa tai 10% FCS-sisältävät kasvustot. Sen jälkeen, kun 24-tunnin kulttuuri seerumittomassa väliaineessa, eksogeenisiä BDNF huomattavasti leviämisen kaikkien tutkittujen solulinjojen, toisin kuin ilman vaikutusta, kun läsnä on 10% FCS: ää (kuvio 4A ja taulukko 2, 3). Koska TrkB ilmaistiin pinnalla korosti solujen, me arveltu, sen mahdollista roolia soluproliferaatioon tällaisissa olosuhteissa. Itse asiassa, lisäksi K252a, joka on Trk-inhibiittori [37], tukahdutti proliferatiivista vaikutusta eksogeenisen BDNF seerumittomassa viljelmien kaikissa tutkituissa solulinjoissa (kuvio 4A), mikä viittaa siihen, että endogeeninen BDNF on osallisena solujen kasvun kautta TrkB (Fig. 4A ja taulukko 2, 3). Arvioida tarkemmin roolin TrkB ja BDNF korosti CRC solujen eloonjäämistä, apoptoosin arvioitiin liukoisen nukleosomissa sytoplasman tasoilla viljelmissä ja ilman eksogeenista BDNF tai K252a. Sen jälkeen 24-h seerumistarvaatio, WiDr-, SW480, SW620 ja COLO 205 soluja stimuloidaan eksogeeniset BDNF oli merkittävästi vähentynyt apoptoottisia suhteilla, kun taas mitään merkittävää vaikutusta ei havaittu soluissa yllä normaalissa väliaineessa (kuvio 4B, C ja taulukko 2, 3 ). Lisäksi, 200 nM K252a lisääntyi apoptoottisen suhteet WiDr, SW480, SW620, ja COLO 205 (kuvio 4B, C ja taulukko 2, 3). Tulokset, jotka saatiin sen jälkeen, kun 48 ja 72 h seerumistarvaatio vahvistivat nämä tiedot (Fig. 4B, C), mikä viittaa siihen, että leviämistä CRC soluja voidaan välittää BDNF /TrkB-signalointireitin.

(A) Role endogeenisen BDNF ja sen reseptorin TrkB CRC soluproliferaatioon: ulkosyntyisten BDNF ja estää omien TrkB reseptori soluproliferaatioon. Neljä solulinjoja viljeltiin 24 h FCS-väliaineessa (FCS 10%, -), kun läsnä on eksogeenisiä BDNF (+), K252a (+) yksinään tai yhdistelmänä. Solujen proliferaatio määritettiin virtaussytometrialla analyysillä käyttäen edu Alexa Fluor 488. Tiedot esitetään histogrammien lisääntyvien solujen suhteelliset yksiköt ± SEM viidestä riippumattomasta kokeesta. *,

p

0,05; **,

p

0,01; ***

p

0,001, verrattuna seerumia. (B, C) vaikutukset eksogeenisen BDNF ja estää omien TrkB reseptoriin solujen eloonjäämistä. Apoptoottista suhteet liukoisen nukleosomeja havaittiin ELISA Cell varten WiDr-, SW480, SW620 ja COLO 205 indusoi seerumideprivaation yksin (FCS 10%, -) tai yhdessä joko eksogeenisen BDNF (+) tai K252a (+), aikana 24-72 h seerumideprivaation. Histogrammit, suhde keskiarvoon apoptoottisten solujen ± SEM vähintään kolmen itsenäisen kokeen. *,

p

0,05; **,

p

0,01; ***,

p

0,001, verrattuna seerumittomalla kunnossa yksin. (D, E) apoptoottinen suhde kuluttua 24 h seerumideprivaation yksin (0% FCS) tai yhdistelmänä neutraloivat anti-BDNF mAb (0% anti-BDNF). Histogrammit, keskimääräinen suhde apoptoottisten solujen ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. *,

p

0,05; **,

p

0,01; ***,

p

0,001, verrattuna seerumittomalla kunnossa yksin.

määrittää signaalinvälitysreitin aiheuttama BDNF /TrkB aktivointia, etsittiin Akt fosforylaatio kaksi CRC solulinjoissa seuraavat BDNF hoitoa. Todellakin, western blottaus osoitti, että altistuminen WiDr- tai SW480 ja BDNF jälkeen 16 tuntia seerumideprivaation, aiheuttama Akt-fosforylaation (Ser 473) 5 minuutin kuluttua, saavutti maksiminsa 30 minuuttia (7-8-kertainen) ja vielä havaitaan sen jälkeen 24 tuntia (3-4-kertainen lisäys) (kuvio 5).

kyky BDNF aktivoida PI3-kinaasi /Akt-signalointireitin CRC-soluissa määritettiin käyttämällä spesifisiä vasta-aineita Akt ja fosfo-Akt (Pakt ). WiDr ja SW480-soluja seerumia 16 tuntia. Sitten solut altistettiin BDNF (100 ng /ml) ja kerättiin eri aikoina, 5 minuuttia (min) 24 tuntia (h). Kolmekymmentä ug proteiinia lysaatit analysoitiin Pakt (Ser473) ja yhteensä Akt Western blot -analyysillä. Tiheys kunkin Pakt kaistan korjattiin varianssia lastaus käyttäen tiheyttä vastaavaa kokonaismäärää Akt. Kansi induktio arvioitiin suhteessa fosforyloidun Akt-proteiinia tiheydet välillä ohjaus (0 min) ja käsiteltiin soluja. Edustava tulos vähintään kolmen itsenäisen kokeen.

Näin ollen määritetään apoptoottista tasoja neljän solulinjojen läsnä ollessa neutraloivien anti-BDNF-mAb [38]. Tämä mAb todellakin lisännyt apoptoosia ensisijaisen CRC linjat: WiDr- (kuvio 4D, vasen ja taulukko 2), SW480 (kuva 4D, oikealla ja taulukko 2) ja metastaattinen linjat, SW620 (kuvio 4E, vasemmalle ja taulukko 3) ja COLO 205 ( Kuva 4E, oikealla ja taulukko 3).

Kaiken kaikkiaan nämä tiedot viittaavat siihen, että endogeeninen BDNF on sekaantunut CRC solujen selviytymistä seerumittomassa kulttuureissa kautta TrkB kautta autokriini silmukan. Tämä johti roolin tutkimiseksi sortilin BDNF liikenteessä.

Sortilin, eli BDNF ihmiskaupan proteiini, ilmentyy CRC solulinjojen

käytetyt alukkeet tutkimuksessa sortilin selostukset tunnustettu solunsisäinen osa proteiinin (sortilin IC osallistuvien neurotrophin torjumisessa) ja solunulkoisen osan (sortilin EY mukana sen reseptorin ominaisuudet). Sortilin transkripti (kuvio 6A) ja proteiini (kuvio 6B) havaittiin kaikissa tutkituissa solulinjoissa. Verrattuna solujen viljeltiin 10% FCS: ää, joka on 24-72-h seerumideprivaatiolle parannettu sortilin ilmentymisen havaitaan immunobloteista WiDr, SW480, SW620 ja COLO 205 uutteet (kuvio 6B). Sortilin tiedetään olevan olemassa kaksi eri valtioiden glykosylaatio CRC-soluissa. Itse asiassa se havaittiin kuin kaksinkertainen vuonna SW480 solulinjassa (kuvio 6B), mutta tuskin toisissa (WiDr-, Colo205) ilme vaihtelee välillä solulinjojen ja viljelmät (kuvio 6B). Sortilin todettiin kaikissa CRC solulinjoissa konfokaalimikroskopialla myös, kuten on esitetty SW620 (kuvio 6C). Double-värjäys sortilin ja BDNF osoitti silmiinpistävää rinnakkaispaikantumisen lisääntynyt fluoresenssivoimakkuudet kuluttua 24 h seerumistarvaatio (kuvio 6C). Määrällisesti vihreä (BDNF) ja punainen (sortilin) ​​fluoresenssivoimakkuudet kussakin viljelyolosuhteet vahvisti havainnot fluoresenssi kuvien (kuvio 6C). Samanlaisia ​​värjäyskuviot havaittiin WiDr, SW620, ja COLO 205 solulinjat samoissa olosuhteissa (tietoja ei ole esitetty). Kaikkiaan tuloksemme ovat yhtä mieltä hypoteesia, sortilin voisi käyttää funktio kuljetusyrityksen BDNF.

(A) Sortilin löytäminen RT-PCR kokonais-RNA soluista viljeltiin 10% FCS ja 24 -72 h seerumistarvaatio. Expression säädeltiin alukkeina sen solunulkoisen (Sortilin EY) ja solunsisäinen (Sortilin IC) osia. Edustaja tulos vähintään kolmen erillisen kokeen. (B) arviointi western blottauksella sortilin ilmaisun (viitaten aktiini) in totaalisoluproteiinia uutettu tutkittu solulinjoista viljeltynä perustilan ja sen jälkeen 24-72 h Seerumideprivaation.