Krooninen sairaus

tiivistelmä

transkriptiotekijä, Sinkki sormi pikkuaivot (ZIC1), on keskeinen merkitys selkärankaisten kehityksessä. Viime aikoina ZIC1 on myös todettu osallistua etenemistä ihmisen syövissä, mukaan lukien medulloblastoomien, kohdun limakalvon syöpä, ja mesenkymaaliset kasvaimet. Kuitenkin toiminta ZIC1 paksusuolen syövän etenemisessä ei ole määritelty. Tässä tutkimuksessa osoitamme, ZIC1 on vaiennettu tai merkittävästi vaimentua paksusuolen syöpäsolulinjoissa. Nämä vaikutukset olivat päinvastaiset demetyloimalla käsittelemällä 5-atsa-2′-deoksisytidiini (atsa). ZIC1 ilmentyminen myös merkittävästi vaimentua perusterveydenhuollossa peräsuolen syövän kudoksissa suhteessa viereisiin ei-tuumorikudoksista (

p

= 0,0001). Lisäksi metylaatio ZIC1 geenin promoottori on usein havaitaan ensisijaisen kasvaimen kudoksissa (85%, 34/40), mutta ei viereisen ei-kasvainkudoksia. Ektooppinen ilmentyminen ZIC1 estää solun proliferaatiota ja indusoi apoptoosin, joka liittyy MAPK ja PI

3K /Akt polkuja, sekä Bcl-xl /Bad /Caspase3 cascade. Voidaan tunnistaa kohde ehdokkaita ZIC1 käytimme cDNA microarray ja havaitsi, että 337 geenit vaimentua ja 95 geenit voimistuvan ektooppinen ilmentyminen ZIC1, jotka tarkastettiin 10 valitun geenin ilmaisuja qRT-PCR. Yhdessä tulokset viittaavat siihen, että ZIC1 saattavat toimia kasvaimia estävä geeni, joka on vaimentua läpi promoottorin hypermetylaatio peräsuolen syöpiä.

Citation: Gan L, Chen S, Zhong J, Wang X, Lam EKY, Liu X, et al. (2011) ZIC1 Onko vaimentua kautta Promoottori hypermetylaation, ja se toimii tuumorisuppressorigeeniä sisään peräsuolen syövän. PLoS ONE 6 (2): e16916. doi: 10,1371 /journal.pone.0016916

Editor: Irina Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 10 lokakuu 2010; Hyväksytty: 03 tammikuu 2011; Julkaistu: 15 helmikuu 2011

Copyright: © 2011 Gan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat National Natural Tiedesäätiö of China (30900676), Natural Tiedesäätiö Zhejiangin maakunnassa Kiinassa (Y206280), ja Department of Science and Technology Zhejiangin maakunnassa Kiinassa (2009C03012-3). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on kolmanneksi yleisin syöpä, samoin kuin kolmas johtava syy syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti [1]. Peräkkäinen kertyminen geneettisiä ja epigeneettiset muutokset johtaa muutosta normaalin paksusuolen epiteelin peräsuolen syöpä [2]. Nämä epigeneettisiä muutoksia, mukaan lukien promoottori-DNA: n metylaation ja histonimodifikaation, voi aiheuttaa inaktivoitumista tuumorisuppressorigeeneille (APT) [3] – [5]. DNA-alueet rikastettu CpG dinukleotideissä, kutsutaan CpG-saarekkeiden, voi tulla hypermetyloitunut syöpäsoluissa ja johtaa vaiennettaisi APT [5]. Osajoukko CRC näytön metylaation useita geenejä, joita kutsutaan CpG-saarekkeen methylator fenotyyppi (CIMP) [2], [5]. Me ja muut ovat aikaisemmin havainneet, että yhä useammat APT kuten APC, CDKN2A /p16, UCHL1, ja TBX5 usein vaimennettu kautta promoottori hypermetylaation in CRC [2], [6] – [9]. Näitä tapahtumia voi esiintyä alkuvaiheessa CRC [9], [10], jossa korostetaan promoottorin hypermetylaatio että kasvainten synnyssä on CRC.

sijaitsee kromosomissa 3q24, ZIC1 koodaa C

2 H

2-tyypin sinkkisormipolypeptidiin transkriptiotekijä että on keskeisessä asemassa kehittämisessä hermostopienasta ja pikkuaivot selkärankaisten [11] – [15]. Sinkki sormi transkriptiotekijöitä, Žic proteiinit voivat sitoutua GC-rikas sekvenssi kohdegeenien [15]. Huolimatta sen rooli hermoston kehittymistä, ZIC1 havaittiin myös osallistua etenemistä ihmisen syöpien, kuten medulloblastooma, kohdun limakalvon syöpä, ja mesenkymaaliset kasvaimet [16] – [18]. Olemme tunnistaneet ZIC1 uutena ehdokkaana TSG mahasyövän [19]. Tukeakseen sen rooli syövän, ZIC1 voi toimia repressori alavirran kohde sonic hedgehog (Shh), BMP (luun morfogeneettinen proteiini), ja sekä oma roolinsa Notch signalointireitillä aikana hermostoputken kehittäminen [14], [15]. Kuitenkin biologinen merkitys DNA: n metylaatio, ja molekyylimekanismin taustalla ZIC1 joka toimii TSG in CRC ole tiedossa. Täällä me raportoimme että ZIC1 promoottori usein metyloitu CRC kudoksissa ja koolonsyöpäsolulinjaa. Ektooppinen ilmentyminen ZIC1 johtaa solun kasvun esto, ja muuttaa ilmentymistä mahdollisten kohdegeenien, että voi olla tärkeä rooli kolorektaalisen syövän synnyssä. Tuloksemme viittaavat siihen, että ZIC1 voi mahdollisesti toiminnon uutena toiminnallinen tuumorisuppressori CRC.

Tulokset

Transcriptional vaiennettu ZIC1 liittyy sen promoottorin hypermetylaatio paksusuolen syöpäsoluissa

Voit selvittää ZIC1 on vaiennetaan promoottori hypermetylaation paksusuolen syöpä, tutkimme ilmaus ZIC1 mRNA kuudessa koolonsyöpäsolulinjaa. Semikvantitatiivinen RT-PCR osoitti, että ZIC1 transkripti vaiennettu tai vaimentua kaikissa koolonsyöpäsolulinjoissa verrattuna normaaliin paksusuolen kudosta (kuvio 1A). Demetylaatiota käsittely Aza dramaattisesti palautti ilmentymistä ZIC1 mRNA osajoukko koolonsyöpäsoluja (HCT116, HT29 ja SW620) (kuvio 1 B), syytetään, että DNA metylaatio saattaa olla osallisena säätelyssä ZIC1 ilmaisua. Lisäksi käytimme metylaatiospesifisen PCR (MSP), ja havaitsivat, että kolme koolonsyöpäsolulinjoissa (HCT116, DLD1 ja SW620), havaittiin täysin metylointi. Muut kolme solulinjat (HT29, LS180 ja SW480) havaittiin osittaisella metylaatio. Ei metylaatio havaittiin normaalissa paksusuolen kudoksiin (kuvio 1C). Näin ollen, nämä tulokset osoittavat, että transkription hiljaisuus ZIC1 paksusuolen syövän solulinjoja voidaan välittämä DNA-promoottorin hypermetylaatio.

(A): n ilmentyminen ZIC1 on vaiennettu tai vaimentua paksusuolen syöpäsolulinjoissa, verrattuna normaaliin paksusuolen kudosta RT-PCR: llä. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. Normaali paksusuolen: Normaali paksusuolen kudoksiin. (B) ZIC1 ilmentyminen on palautettu koolonsyöpäsoluja (HCT116, HT29 ja SW620), hoidon jälkeen demetylaatio aineella 5-atsa RT-PCR: llä. AZA: 5-atsa-2′-deoksisytidiini. (C) metylaatiostatuksen ZIC1 CpG-promoottorin on havaittu metylaatiospesifinen PCR (MSP) paksusuolen syöpäsolulinjoissa. M: metyloitu; U: metyloitumaton.

alassäätely ja promoottori hypermetylaatiota ZIC1 perusterveydenhuollossa Kolorektaalituumorien

Jotta voitaisiin edelleen tutkia suhdetta ZIC1 ilmaisun ja promoottori hypermetylaation, analysoimme ZIC1 mRNA ilmaisun ja CpG metylaatio tilaansa ensisijainen peräsuolen kasvain ja viereisen ei-tuumorikudoksista by qRT-PCR ja MSP, vastaavasti. Taso ZIC1 mRNA oli merkittävästi vähentynyt useimmissa tuumorikudoksissa suhteessa viereisiin ei-tuumorikudoksissa (

p

= 0,0001, n = 24) (kuvio 2A). Lisäksi, promoottori metylaatio havaittiin 85% (34/40) ja peräsuolen kasvaimen kudokset, mutta ei viereisen ei-tuumorikudoksissa MSP-analyysi (edustaja data esitetään kuviossa 2B), mikä merkitsee kasvaimen tietyn hypermetylaatiota ZIC1 promoottorin in CRC. Emme kuitenkaan ei löytänyt merkittävää korrelaatiota ZIC1 promoottorin metylaation ja kliinisiä tekijöitä, kuten ikä, sukupuoli, kasvaimen erilaistumiseen, ja TNM-luokitus (taulukko 1).

(A) ZIC1 mRNA ilmentyminen määritettiin kvantitatiivisen real-time PCR kaksikymmentäneljä paria ensisijaisen kolorektaalisen kasvaimen ja mukaan viereisen ei-kasvainkudoksia. Aineisto analysoitiin Wilcoxonin pareittain testi. (B) metylaatiostatuksen ZIC1 promoottorin ensisijainen peräsuolen syöpä ja viereisen ei-tuumorikudoksissa määritettiin MSP. Edustavia kuva näytetään. T: tuumorikudoksia; N: viereisen ei-tuumorikudoksia; M: metyloitu; U: metyloitumaton.

ZIC1 estää leviämisen koolonkarsinoomasoluissa

tutkia vaikutuksen ZIC1 soluproliferaatioon paksusuolen syöpä, suoritimme solujen elävyyden ja pesäkkeenmuodostusta määrityksissä CRC solulinjoissa. Ensinnäkin transfektion tehokkuuteen ZIC1 konstruktin varmistettiin RT-PCR: llä ja western blot kasvainsolulinjoissa (HCT116 ja HT29) (kuvio 3A). Seuraavaksi arvioitiin estävä vaikutus on ZIC1 ilmentymisen vaikutus soluproliferaation solunelinkykyisyysmääritys. Kuten kuviossa 3B on esitetty, ektooppinen ilmentyminen ZIC1 esti merkitsevästi solujen elinkelpoisuutta HCT116 ja HT29 (

p

0,05). Havaitsimme myös, että elossa olevien pesäkkeiden määrä muodostettu levyihin väheni huomattavasti verrattuna kontrollivektorilla transfektanteilla (

p

0,01) (kuvio 3C). Lisäksi olemme paljasti, että ektooppinen ilmentyminen ZIC1 esti fosforylaatiota Erk1 /2 ja Akt kinaasien (kuva 3D), kaksi keskeistä solun proliferaatioreitillä sääntelyviranomaisten. Nämä tulokset vahvistivat estävä vaikutus on ZIC1 soluproliferaatioon.

(A) Re-ilmentymisen Žic on stabiilit transfektantit paksusuolen syöpäsoluissa (HCT116 ja HT29) vahvistettiin RT-PCR: llä (ylempi kaista) ja Länsi- blot (matala kaista), GAPDH ja β-aktiini käytetään sisäisenä kontrollina. (B) solunelinkykyisyysmääritys jälkeen ZIC1 uudelleen ilmentymisen paksusuolen solulinjoissa (HCT116 ja HT29). Lukumäärä eläviä soluja mitattiin MTS-määrityksellä sen jälkeen, kun transfektoitiin väliaikaisesti pCDNA3.1-ZIC1 tai pCDNA3.1 vektori. Määritys suoritettiin kolmena kappaleena. Tähti osoittaa tilastollista merkittävyyttä (

p

0,05). (C) vaikutus soluproliferaation inhibition ektooppinen ilmentyminen ZIC1 määritettiin pesäkemuodostusta paksusuolen syöpäsoluissa. Kvantitatiivinen analyysi pesäkemäärät muodostettu pCDNA3.1-ZIC1 tai pCDNA3.1 vektorin transfektantit näkyvät oikealla pylväsdiagrammi kolmessa erillisessä kokeissa HCT116 ja HT29. Tähti osoittaa tilastollista merkittävyyttä (

p

0,05). (D) Ilmaisu phos-Akt ja phos-Erk1 /2, sekä yhteensä Akt ja Erk1 /2 analysoitiin western blot. Band tiheydet olivat määrällisesti ja proteiinin tasot (p-Akt, p-Erk1 /2) normalisoitiin P-aktiini. Densitometria arvot (ZIC1 transfektantit) ilmaistaan ​​kertainen muutos verrattuna vektori transfektanteista arvot normalisoidaan 1.

ektooppinen ilmentyminen ZIC1 indusoi apoptoosin

tutkia mekanismit eston soluproliferaatiota ektooppinen ilmentyminen ZIC1, analysoimme apoptoosia ja solusyklin virtaussytometrialla määrityksessä. Kuten kuviossa 4A on esitetty, transfektoidut solut ZIC1 indusoi solujen apoptoosia. Lisäksi tuloksemme osoittivat, että uudelleen ilmentyminen ZIC1 johti aktivoivan apoptoosin liittyvät kaskadissa, kuten lohkaisu caspase3, downregulation Bcl-xl, ja Bad dephosporylation (kuvio 4B). Nämä tulokset osoittavat, että induktio-solujen apoptoosin kautta yliekspressio ZIC1 välittyy Bcl-xl /Bad /Caspase3 cascade. Kuitenkin uudelleen ilmentyminen ZIC1 ei vaikuttanut solusyklin etenemisen (tuloksia ei ole esitetty).

(A) Cell apoptoosin havaita Annuexin V-PI virtaussytometrialla määrityksessä. Edustaja luvut esitetään jälkeen transfektoitu tilapäisesti ZIC1 tai kontrollivektorilla jälkeen 48 tuntia HT29 ja HCT116-soluissa. Alue A1 ilmaisee aikaisin apoptoottisia soluja, A2 osoittaa myöhään apoptoottisia soluja. (B) Western blot analyysi apoptoottisten säänneltyjen proteiinien. Ekspression fosfo-Bad ja Bad, Bcl-xl, pilkotaan-caspase3, ja Caspase3 havaittiin sen jälkeen, kun transfektoitu ZIC1 tai kontrollivektorilla paksusuolen syöpäsolulinjoissa (HT29 ja HCT116). Band tiheydet määrällisesti ja proteiinin tasot (p-Bad, Bad, Bcl-xl, ja halkaistut-caspase3) normalisoitiin P-aktiini. Densitometria arvot (ZIC1 transfektantit) ilmaistaan ​​kertainen muutos verrattuna vektori transfektanteista arvot normalisoidaan 1.

geeniekspressioprofiili muuttuu kohdunulkoinen eksogeeninen ZIC1 ilmaisu

Jos haluat etsiä kohdegeenien ZIC1 paksusuolen syöpäsoluissa, käytimme cDNA microarray analysoida geeniekspressioprofiili aiheuttamien muutosten ektooppinen ilmaus ZIC1. Tämä analyysi paljasti, että 337-geenit vaimentua ja 95 geenit voimistuvan täytteen ilmentymistä ZIC1 käytettäessä 2-kertainen muutos ilmaisun kuin kynnys (edustaja geenit esitetään kuviossa 5A). Kuten on esitetty taulukossa 2, ja monet näistä geeneistä on raportoitu tärkeitä rooleja solujen lisääntymisen ja apoptoosin. Vahvista ilmentymismalliin havaittu microarray, me validoitu ilmentymisen 10 valittujen geenien koolonkarsinoomasoluissa transfektoitu ZIC1 by qRT-PCR. Tulokset osoittivat, että

CCNA2

(sylinteririvin A2) ja

IGFBP3

(insuliinin kaltainen kasvutekijää sitova proteiini 3) olivat merkittävästi voimistunut ( 2 kertainen muutos), kun taas

ANGPT2

(angiopoietiiniterapia 2),

GADD45B

(kasvua pidätys ja DNA-vaurioita indusoituvat, beeta),

LAMB2

(laminiini, beta 2),

LAMB3

(laminiini , beta 3),

MALAT1

(etäpesäke liittyy keuhkoadenokarsinooma transkriptio 1),

PNMA2

(paraneoplastic antigeeni MA2),

RPA4

(replikointi proteiini A4), ja

TACSTD2

(kasvaimeen liittyvät kalsiumin signaalin muuntimen 2) ( -2 kertainen muutos) on vaimentua yliekspressiolla ZIC1 on HCT116 ja HT29-soluja (kuvio 5B ja taulukko S1). Nämä tiedot olivat yhdenmukaisia ​​kanssa saadut mikrosiruanalyysi.

(EN) ero ilmentymistä geenin profiileista ZIC1 tai kontrollivektorille vakaa transfektanteissa visualisoitiin Java Puunäkymäikkuna in HCT116 solulinjoissa. Edustavia geenejä yli kaksinkertaiseksi muutos on merkitty oikealla puolella tämän kuvan. (B) Genes transkriptio määrä 10 valittujen geenien mitattiin qRT-PCR ja lasketaan arvo 2

– △△ CT. Suhteellinen geeniekspression ZIC1 transfektanteissa verrattiin tyhjä ohjaus vektori, joka normalisoitui viitearvona 1,0. Valkoiset palkit osoittavat tulos mikrosiruanalyysi, ja mustat palkit edustaja qRT-PCR datan HCT116 solulinjassa.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme huomanneet, että ZIC1 on vaiennettu tai vaimentua paksusuolen syöpäsolulinjoissa, sekä primaarisissa tuumorikudoksissa suhteessa viereisiin ei-tuumorikudoksissa (

p

0,05). Lisäksi havaintojemme tunnistaa, että promoottori DNA hypermetylaation myötävaikuttaa ZIC1 hiljentäminen tai downregulation in CRC. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimus ZIC1 mahasyövän [19], mikä osoittaa, että promoottori CpG methlyation on tärkein tapa ZIC1 downregulation. Emme kuitenkaan voi sulkea pois ulkonäköä muiden mekanismien vaiennettu ZIC1, kuten histoni tai nukleosomin remodeling. Esimerkiksi ZIC1 ilmaisua ei voida palauttaa, kun Aza hoidon LS180 ja SW480 solulinjoissa (tietoja ei esitetty). Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että metylaatio histoni H

3 lysiinin 27 liittyy ZIC1 hiljentämisen alkion kantasoluja [18]. Kromatiinin immunopresipitaatiomäärityksiä osoittavat, että ilmentyminen ZIC1 liittyy histoni H

3 dimetylaatio lysiini 4 desmoids ja MEF-solut [18].

Huolimatta esimerkki kriittisen roolin ZIC1 selkärankaisten kehitykseen [ ,,,0],13], [15], toiminnallinen luonnehdinta ZIC1 karsinogeneesis- edelleen suurelta osin tuntemattomia. Tässä, tuloksemme osoittavat, että eksogeeninen ZIC1 inhiboi soluproliferaatiota kautta p-Akt ja p-Erk1 /2 inaktivaatio paksusuolen syöpäsoluja. PI

3K /Akt ja MAPK (Mitogeenillä aktivoitu proteiinikinaasi) signalointi reitit ovat hyvin tunnettuja toimia keskeisiin osiin solujen lisääntymistä tuumorisoluissa [20], [21]. Akt ja Erk1 /2, kun aktivoidaan fosforylaation, voi toimia keskeinen efektoreita PI

3 K ja MAPK signalointireittejä edistää solujen eloonjäämistä ja lisääntymistä [20] – [24]. Siten ZIC1 voivat välittää solujen lisääntymisen kautta PI

3K /Akt ja MAPK reittejä koolonkarsinoomasoluissa. Lisäksi olemme havainneet, että ektooppinen ekspressio ZIC1 voi indusoida apoptoosia paksusuolen syöpäsoluja. Niistä laaja kirjo proteiinien ja geenien mukana apoptoosin jäsenet Bcl-2-perheen keskeinen rooli tässä prosessissa [25], [26]. Kaspaasi-3: n on tunnistettu olevan tärkeä välittäjä nisäkässolujen apoptoosia, ja fosforylaatiota Bad voi estää sen apoptoottisen funktion [22], [25], [26]. Tässä suhteessa olemme havainneet, että ilmentyminen pilkotaan-caspase3 ja Bad indusoitiin, kun taas fosfo-Bad: n ja Bcl-xl tukahdutettiin uudelleen ilmentymisen ZIC1. Tuloksemme viittaavat siihen, että apoptoosin induktio ZIC1 voi liittyä Bcl-xl /Bad /Caspase3 kaskadin paksusuolen syöpäsoluissa.

pyritään tunnistamaan alavirtaan kohteet ZIC1 on CRC, olemme analysoineet geeniekspressioprofiilit paksusuolisyövän soluja tai ilman ZIC1 yliekspressio. Tulokset osoittivat, että 337-geenit vaimentua ja 95 geenit voimistuvan ZIC1 (edustaja uusien geenien esitetty taulukossa 2). Monet näistä geeneistä on yhdistetty solujen kasvun, apoptoosin, tarttuvuus, angiogeneesi, ja signaalitransduktion tuumorigeneesiin [27] – [33]. Esimerkiksi ZIC1 tukahdutettu ilmaus

GADD45B

.

GADD45B

indusoi aktivointi p38 /JNK (c-Jun N-terminaalinen kinaasi) reitti [27], ja tärkeä välittäjä NF-KB-JNK ylikuulumisen ja apoptoosin [28]. JNK on toinen merkittävä alavirtaan komponenttia MAPK cascades, ja liittyy solujen kasvuun ja soluvastetta DNA vaurioita [21], [23], [24]. Lisäksi olemme havainneet, että ZIC1 lisääntynyt ilmentyminen

RSU1

(Ras soriproteiini 1), joka on raportoitu nostaa tasoja p21

CIP CDK-estäjä, sekä inaktivoivat Jun ja Rho-riippuvaisen kinaasit alle EGF stimulaatio [29]. Meidän toteaminen Žic tukahduttaminen p-Erk1 /2, ehdotamme, että ZIC1 voi säädellä MAPK teille, joita välittävät ERK ja JNK kinaasien. Jatkotutkimuksia tarvitaan kuvaamaan mekanismeja, joilla ZIC1 säätelee näitä mahdollisia reittejä syövän etenemiseen. Lisäksi osoitimme, että ZIC1 voi tukahduttaa ilmaisun muiden uusien geenien (

TACSTD2

,

ANGPT2

,

LAMB2, LAMB3

ja

MALAT1

jne ) liittyvät kasvaimen angiogeneesiin ja etäpesäke.

TACSTD2

on todettu liittyvän kasvaimen aggressiivisuus ja huonon ennusteen epiteelin kasvaimet, mukaan lukien paksusuolen syöpä ja mahasyöpä [30], [31].

ANGPT2

on nousemassa keskeiseksi säätelijänä verisuonten remontin aikana tuumoriangiogeneesissa [32], [33].

Koska sinkki sormi transkriptiotekijöitä, Zic perheen proteiinit voivat sitoutua GC-rikas sekvenssit kohdegeenien [13], [15]. ZIC1 voi säädellä kohdegeenien sekä sekvenssin erityisiä ja sekvenssi-riippumaton tavoin [15]. Riippuen sen vuorovaikutusta kumppaneiden Žic proteiinit voivat aktivoida tai estää kohdegeenien transkription. Kuten odotettua, havaitsimme, että ZIC1 säännellä ilmaus tärkeitä transkriptiotekijöiden kuten

RPS2

,

NTF3

,

PRDM16

,

KLF15

,

SHC2

ja

FOXJ1

(taulukko S2). ZIC1 on osoitettu torjumiseksi kanssa Gli (gliooma liittyvä onkogeenin homologi 1), joka toimii alavirran Sonic hedgehog (Shh) signalointireitin ja osallistua etenemisen paksusuolen syöpä [34] – [36]. Samaan aikaan lukuisia alavirran tavoitteiden ZIC1 kuten Notch, sykliini D1, ja Wnt3a on tarkasteltu hermoston kehittymistä ja eläinmallien [15], [37]. Nämä geenit ovat hyvin tunnettuja elintärkeä tehtävä syövän kehittymisessä. Tutkimus ZIC1 kohdegeenien voi antaa lisää tietoa mahdollisista mekanismeista ZIC1 toimii tuumorisuppressori CRC.

Yhteenvetona paljasti, että uusi tuumorisuppressorigeenin ZIC1 inaktivoitiin läpi promoottorin metylaation paksusuolen syöpä solut. ZIC1 myös vaimentua ja usein hypermetyloitunut ensisijainen peräsuolen syöpä kudoksiin. ZIC1 estää soluproliferaatiota kautta tukahduttaminen PI

3k ja MAPK polkuja, induktio solun apoptoosin kautta Bcl-xl /Bad /Caspase3 cascade, sääntely loppupään tavoitteita ja reittejä sekaantunut peräsuolen syövän syntymistä.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja kudosnäytteiden

ihmisen koolonsyöpäsolulinjaa (HCT116, HT29, DLD1, LS180, SW480 ja SW620) saatiin riken geenipankki (Japani) ja American Type Culture Collection (ATCC, USA). HCT116-solulinjaa viljeltiin McCoyn 5A-alustassa (Invitrogen, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia, kaikki muut solulinjat viljeltiin DMEM-alustassa (Invitrogen, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia. Kaikkia solulinjoja inkuboitiin 5% CO

2, 37 ° C ja 95%: n kosteudessa.

Neljäkymmentä kirurginen toistoleikattiin peräsuolen adenokarsinomia ja viereisen ei-kasvain näytteet saatiin Sir Run Run Shaw sairaala, School of Medicine Zhejiangin yliopistossa. CRC luokiteltiin mukaan International Union syöpää vastaan ​​kriteerit ja lavastettuja kanssa kasvaimeen solmu-etäpesäke (TNM) järjestelmä. Näytteet jäädytettiin välittömästi nestemäisessä typessä ja varastoidaan -80 ° C: ssa, kunnes se jatkokäsiteltiin. Kaikki potilaat kunhan tietoisen kirjallisen suostumuksen saamiseksi tutkimuksen yksilöitä. Tutkimuksen protokolla hyväksyi Clinical Research eettiselle toimikunnalle Sir Run Run Shaw sairaala.

Farmakologiset DNA demetylaatio 5-atsa-2′-Deoksisytidiini

Soluja käsiteltiin 72 tuntia 5 uM 5-

atsa

-2 ’-

deoksisytidiinikinaasin

(atsa) (Sigma, St. Louis, MO, USA), hyvin käytetty metyylitransferaasi estäjä. Aza täydennettiin 24 tunnin välein. Vastaava pitoisuus ajoneuvon (DMSO) käytettiin kontrollina.

RT-PCR ja kvantitatiivinen PCR-analyysi

Kokonais-RNA (1 ug) uutettiin käyttäen Trizol-reagenssia (Invitrogen) ja noudattamalla valmistajan opetusta, sitten käänteistranskriptio cDNA: High kapasiteetin cDNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems). RT-PCR suoritettiin 35 sykliä (95 ° C: ssa 30 s, 55 ° C: ssa 30 s, 72 ° C 30 s). PCR-tuote tehtiin elektroforeesi 2% agaroosi ja värjättiin etidiumbromidilla. Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR (qRT-PCR) suoritettiin SYBR Green Master Mix (Takara, Japani) vuonna ABI 7500 PCR -järjestelmää. Suhteellinen Geenitranskriptikuvion taso normalisoitiin talon pitäminen geeni (GAPDH) käyttäen 2

-ΔΔCt menetelmällä. Kaikki alukkeet sekvenssit taulukossa S3.

bisulfiittikäsittelyn DNA ja metylaatiospesifisen PCR (MSP) B

Perimän DNA (1 ug) bisulfiitti-käsiteltiin Zymo DNA muutos Kit (Zymo Research , USA). Metylaatiostatuksen ZIC1 havaittiin metylaatiospesifinen PCR (MSP) käyttäen bisulfiitti käsitelty genomista DNA: ta templaattina. MSP suoritettiin 40 sykliä, joissa hehkutus lämpötila 60 ° C: ssa, kuten aikaisemmin on kuvattu [38], [39]. Metylaatio (M) alukkeet olivat: F 5′-GGATTTTTTGTTTCGTAATC, R 5′-CCCGTTAACCACGTTAAACG, ja Unmethylation (U) alukkeet olivat: F 5′-GGGATTTTTTGTTTTGTAATT, R 5′-CCCATTAACCACATTAAACA.

Solun transfektio ja solujen elinkelpoisuuden määritys

rakentamiseksi ZIC1 ekspressioplasmidin, täyspitkä ZIC1 avoimen lukukehyksen, kloonattiin nisäkkään ekspressiovektoriin pCDNA3.1 kuin edellinen on kuvattu [19]. Tuottavat vakaita transfektio soluihin, HCT116 ja HT29-solut transfektoitiin pCDNA3.1-ZIC1 tai pCDNA3.1-vektorin kanssa käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen), ja valitaan G418 (400 ug /ml) ja 14 päivää on 12-kuoppalevylle. Yli-ilmentyminen ZIC1 varmistettiin RT-PCR: llä ja Western blot elossa pesäkkeet. Sitten nämä vakaa heterogeenisia solut siirrettiin 6-kuoppaiselle levylle ja jatkuva valinta G418 lisätutkimuksia varten.

Solujen elinkelpoisuus määritettiin 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2- (4-sulfofenyyli) -2H -tetrazolium (MTS) reagenssit (Promega, Madison, USA). Lyhyesti, HCT116 ja HT29 viljeltiin 24 tunnin ajan 12-kuoppalevylle ja transfektoitiin väliaikaisesti pCDNA3.1-ZIC1 tai pCDNA3.1. Sitten nämä solut maljattiin 96-kuoppaisille (2000-4000 solua /kuoppa) 48 tuntia. Inkubaation jälkeen CellTiter 96 Aqueous One Solution reagenssia 1 tunti, absorbanssi mitattiin 490 nm: ssä ohjeen mukaan MTS.

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä

HCT116 ja HT29-soluja viljeltiin 12 – kuoppalevylle (1,0 x 10

5 solua /kuoppa) 24 tuntia ja transfektoitu pCDNA3.1-ZIC1 tai pCDNA3.1 vektorin. 48 tunnin jälkeen, transfektantit valittiin uudelleen maljattiin 6-kuoppaiselle levylle ja viljeltiin 12-20 päivää viljelmässä alustassa, joka sisälsi G418: aa (400 ug /ml). Elossa pesäkkeet värjättiin Gentian Violer jälkeen metanolia kiinnitys ja näkyviä pesäkkeitä (≥50 solut) laskettiin. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Cell apoptoosin ja solusyklin analyysi

Cell apoptoosin analyysit suoritettiin käyttämällä anneksiini V /PI (Invitrogen) virtaussytometrialla analyysi (FCA). Lyhyesti, lyhytaikaisesti transfektoidut solut (HCT116, HT29) suspendoitiin anneksiini-sitomispuskurissa, Alexa Fluor 488 anneksiini V: n ja PI-työliuosta lisättiin peräkkäin. Värjätyt solut lopulta analysoitiin virtaussytometrialla FACScan-virtaussytometrillä (Becton Dickinson, USA) 560 nm: ssä. Samaan aikaan, 2 x 10

5 siirrostettiin soluja altistettiin UV apoptoosin indusoimiseksi positiivisena kontrollina.

Cell cycle jakautuminen havaittiin, että Cycletest Plus DNA Reagent Kit (Becton Dickinson, USA). Lyhyesti, transfektoidut solut kerättiin ja pestiin PBS: ssä, solujen DNA värjättiin 125 ug /ml propidiumjodidia 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa pimeässä. Sitten solut lajiteltiin FACS Calibur ja solusyklin jakautuminen määritettiin käyttäen ModFit LT-ohjelmisto (Phoenix, USA).

Western blot-analyysi

Yhteensä proteiinit uutettiin stabiilisti transfektoiduista soluista käyttäen RIPA lyysipuskuria. Lysaatit (20-60 ug) erotettiin SDS-PAGE-geelissä ja siirrettiin PVDF-kalvoille (Millipore, Bedford, MA). Blotit tutkittiin ZIC1 (1:500, Abcam), Caspase3 (1:500; Sigma-Aldrich), Bcl-xl (1:500; Sigma), Bad (1:500, Abnova), fosfo-Bad (1 :1000; Cell Signaling), Akt (1:500; Abcam), fosfo-Akt (1:2000; Cell Signaling), Erk1 /2 (p44 /42) (1:1000; Cell Signaling), fosfori-Erk1 /2 (P44 /42) (1:2000; Cell Signaling) ja β-aktiini (1:2500, Multisciences Biotech) vasta-aineita. Täplät kehitettiin käyttäen kemiluminesenssi Las-4000 Imaging System (Fujifilm, Japani).

cDNA mikrosiruanalyysi ja validointi

Microarray tutkimuksia suodatettiin tunnistaa ne, jotka profiloitu geeniekspressiota ZIC1 tai kontrollivektorille stabiilisti transfektoitu solulinja (HCT116), joka perustuu Affymetrix alustalla. cDNA transkriptoidaan cRNA kanssa aaUTP sitova, joiden avulla liittäminen fluoresoivan väriaineen Cy3 (pCDNA3.1-ZIC1) tai Cy5 (pCDNA3.1). Lopuksi leimattu näytteet hybridisoitiin Agilent koko ihmisen genomin sisältävien 41,000 antureista ja selostukset. Monista kokeet suoritettiin. Valitsimme log

2 suhde ≥1 tai ≤-1 kynnyksenä säätelyä tai alisäätely geenin ilmentymisen.

Ehdokas ZIC1 kohdegeenien luokiteltiin eri alaryhmiin niiden biologisiin toimintoihin (solujen lisääntymistä, muuttoliike, ja angiogeneesi, jne.). Kymmenen edustajat kohdegeenien:

ANGPT2

,

CCNA2

,

GADD45B

,

IGFBP3

,

LAMB2

,

LAMB3

,

MALAT1

,

PNMA2

,

RPA4

ja

TACSTD2

todennettiin kanssa qRT-PCR ZIC1 tai kontrollivektorille tranfectants vuonna HCT116 ja HT29.

tilastollinen

Opiskelijan

t

ja Wilcoxonin pareittain suoritettiin verrata kahden riippumattoman tietoja, kun taas Chi-square tai Fisherin tarkkaa testausmenetelmät analyysi kategorinen muuttujia.

p

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

tukeminen Information

Taulukko S1.

Taita muutos (FC) valittujen geenien ZIC1 transfecants havaittiin cDNA microarray ja qRT-PCR. Kertainen muutos (FC): ZIC1 versus kontrollivektorille.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0016916.s001

(DOC) B Taulukko S2.

Expression profiilia edustavan liittyvän geenin transkription säädin ja signaalitransduktion ZIC1 transfektanteissa verrattuna tyhjä vektorisäädön (fold change) cDNA microarray sisään HCT116-soluissa. Kertainen muutos: ZIC1 vs. kontrollivektorille.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0016916.s002

(DOC) B Taulukko S3.

Alukesekvenssit käytetään kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: llä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0016916.s003

(DOC) B

Kiitokset

Kiitämme tohtori Lei Guo varten hyödyllisiä ehdotuksia; Dr. Yan Shan, Xiaotong Hu ja Fubiao Zhang erinomaisen teknistä tukea; ja Dr. Manish Gala varten kriittinen tarkastelu käsikirjoituksen.