Krooninen sairaus

tiivistelmä

andrografolidin (Andro) hillitsee ja laukaisee apoptoosin monissa syöpäsolujen. Taxifolin (taksi) on ehdotettu estämään syövän kehittymisen samanlainen kuin muista ravintolähteistä flavonoideja. Esillä olevassa tutkimuksessa, sytotoksisia ja apoptoottisen vaikutusten lisäämisen Andro yksin Andro ja taksi yhdessä ihmisen eturauhasen syöpä DU145-solut arvioitiin. Andro esti eturauhasen syöpäsolun lisääntymisen mitoosi pidätyksestä ja aktivointi luontaisia ​​apoptoottisen reitin. Vaikka vaikutus taksi yksin DU145 soluproliferaation ei ollut merkittävä, yhdistetty käyttö taksi kanssa Andro merkittävästi voimisti anti-proliferatiivista vaikutusta kasvoi mitoottisen pysähtymiseen ja apoptoosiin lisäämällä pilkkomalla poly (ADP-riboosi) polymeraasin, ja caspases- 7 ja -9. Andro yhdessä taksi tehostettu mikrotubulusten polymeroitumisen

in vitro

, ja ne indusoi muodostumista kierretty ja pitkänomainen karat syöpäsoluissa, mikä johtaa mitoottisiin pidätykseen. Lisäksi osoitimme, että ehtyminen MAD2, komponentin karan kokoonpano tarkistuspisteen (SAC), helpotti mitoosi lohko aiheuttama kaksi yhdisteitä, mikä viittaa siihen, että ne käynnistävät mitoosi pidättäneet SAC aktivointia. Tämä tutkimus viittaa siihen, että syövän vastainen aktiivisuus Andro voidaan tehostaa merkittävästi yhdessä Taxi hajottamalla mikrotubulusdynamiikan ja aktivoimalla SAC.

Citation: Zhang ZR, Al Zaharna M, Wong MM-K, Chiu SK , Cheung HY (2013) Taxifolin Parantaa andrografolidin aiheuttama Mitoottista pysähtymiseen ja apoptoosiin Human eturauhassyöpäsoluissa kautta Karan Assembly Checkpoint aktivointi. PLoS ONE 8 (1): e54577. doi: 10,1371 /journal.pone.0054577

Editor: Jean-Marc Vanacker, Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon, Ranska

vastaanotettu: May 1, 2011; Hyväksytty: 13 joulukuu 2012; Julkaistu: 28 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tässä asiakirjassa kuvatuin tavoin osittain tuettu kahdella avustuksia City University of Hong Kong (Hanke nro 7002714 ja 7002872). Kiitos annetaan Department of Health, Hong Kong hallitus SAR, heidän taloudellisen tuen kautta HKCMMS projekti. Kirjoittajat myös tunnustavat stipendi alkaen School of Graduate Studies, City University of Hong Kong Miss Z. R. Zhang. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

andrografolidin (Andro) on diterpenoidinen laktoni eristetään toiminnallisen yrtti

Andrographis paniculata

, jota on käytetty kansanlääkinnässä hoitoon ylähengitysteiden infektiot, kipeä kurkku ja monet muut tartuntataudit. Tämä yhdiste on arveltu olevan suuria mahdollisuuksia syövän hoidossa, koska se osoittaa syövän vastaisen toiminnan sekä suoria ja epäsuoria keinoja [1] – [5]. Andro voi suoraan estää kasvainsolujen kasvua läpi solusyklin pidätyksen, apoptoosin ja erilaistumisen, ja se voi epäsuorasti estää syövän kehitystä Immunostimuloivien, tulehdusta, anti-angiogeeninen ja chemoprotective ominaisuudet [4]. Andro voi muuttaa p50-alayksikköä NF-kB in antagonistinen tavalla, ja tämä mekanismi saattaa olla syynä sen Sivuelinkeinoja [6]. Sen lääkkeen toiminta riippuu sen konsentraatio, koska se voi estää apoptoosia monissa solutyypeissä tiettyinä pitoisuuksina [7], [8], [9], mutta se voi myös indusoida apoptoosia suurina pitoisuuksina [10], [11], [ ,,,0],12]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että Andro tehokkaasti indusoi solusyklin pysähtymisen useiden syöpätyyppien solut G0 /G1 vaiheessa [10], [13], [14] ja ihmisen hepatooma HepG2 solut G2 /M vaiheessa [15]. Meidän tuore tutkimus osoittaa, että vaikutukset Andro ovat riippuvaisia ​​solutyypistä. Esimerkiksi, se pidättää solusyklin G2 /M useissa hepatosellulaarinen syöpäsolulinjoissa, mutta se johtaa apoptoosin HeLa-soluissa [16]. Aiempien tutkimusten Andro aktivoi ulkoista kuolema reseptorin reitin ja indusoi apoptoottista solukuolemaa erilaisissa syöpäsoluissa. Useimmissa solutyypeissä, efektori kaspaasin aktivaatio edellyttää myös signaalin vahvistuksen kautta mitokondrioiden riippuvaisen apoptoottisen reitin [11], [17]. Pro-apoptoottiset Bcl-2-perheen jäseniä (Bid ja Bax) uskotaan avainasemassa välittäjinä rele on solukuoleman signaalia kannustanut Andro [11], [12].

ravinnosta flavonoidit syövän ehkäisyyn on myös keskusteltu laajalti. Vakuuttava tiedot laboratoriotutkimuksissa ja ihmisen kliiniset kokeet osoittavat, että flavonoidit tärkeä rooli syövän ehkäisyssä ja hoidossa [18] – [20]. Huomattava Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että flavonoidit voivat voimistaa antituumorivaikutuksen muiden aineiden useisiin syöpiin [21] – [24]. Taxifolin (taksi), joka tunnetaan myös nimellä dihydroquercetin, on vahva antioksidantti vaikutus ja hänellä samankaltaista toimintaa kversetiini, mikä parantaa indusoiman apoptoosin erilaisia ​​syöpälääkkeet sekä solu- ja eläinmalleissa [25] – [28]. Kuitenkin yhdistetty käyttö taksi muiden syöpälääkkeiden ei ole raportoitu.

Vaikka Andro on raportoitu aiheuttavan anti-proliferatiivinen vaikutus monenlaisia ​​syöpäsolujen [29], yksityiskohtainen molekyyli tutkimukset sen vaikutus androgeenireseptorin tulenkestävä syöpäsolujen ei vielä ole. Oletimme, että usean kohde käsittely on lupaava menetelmä hyödyntää syövän vastaisen toiminnan luonnossa esiintyviä yhdisteitä. Tässä tutkimuksessa tehtiin selvittää yksilön ja yhdessä vaikutukset Andro ja taksi solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin androgeenista riippumaton eturauhassyöpä DU145 soluja. Apoptoottisen vaikutukset Andro annetun solut huomattavasti korkeampia, kun sitä käytetään yhdessä Taxi parantamalla apoptoottisen reitin ja asiakkuutta aktivoinnista kehräkokoonpanon tarkistuspisteen (SAC).

Materiaalit ja menetelmät

soluviljely ja kemikaalien

ihmisen androgeeni-riippumaton eturauhassyöpä solujen DU145, kuolemattomiksi ihmisen eturauhasen solujen PNT2, ja normaaleihin ihmisen esinahan fibroblasteja HS27 saatiin American Type Culture Collection (MD, USA). Nämä solulinjat rutiininomaisesti yllä DMEM: ssa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Invitrogen, CA, USA), 0,37% natriumbikarbonaattia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä, 37 ° C: ssa kostutetussa 5 % CO

2 ilmaa inkubaattorissa. Puhdistettu Andro (97%) saatiin Indofine Chemical Company (New Jersey, USA). Taksi, joka oli 85% puhdasta ostettiin Sigma-Aldrich Corporation (MO, USA) ja 98% puhdasta taksi valmisteen hankittiin BioBioPha (Yunnan, P.R.C.). Molempien valmisteiden oli sama vaikutus solujen elinkelpoisuuteen, kun sitä annetaan yksinään tai yhdessä Andro. Molemmat kemikaalit liuotettiin ensin DMSO: hon (alle 0,1%) ja sitten laimennettiin täydellinen kasvualusta lopullinen haluttu pitoisuus ennen hoitoa. Näytteitä käsiteltiin pelkästään DMSO toimi vehikkelikontrollit. Kaikki muut reagenssit saatiin Sigma-Aldrich, ellei toisin mainita.

MTT solujen lisääntymistä /elinkyvyn

Solujen proliferaatio ja elinkelpoisuus arvioitiin 3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli ) -2, 5-difenyyli-tetratsolium (MTT) (Invitrogen, CA, USA) määritys. DU145-solut, PNT2, ja HS27-solut ympättiin 5000 ja 1000 solua /kuoppa, vastaavasti, 96-kuoppaiselle levylle. Soluja inkuboitiin 24 tuntia, ja sitten altistettiin eri pitoisuuksia Andro, taksi tai seosta, jossa on kaksi ennalta määrätyn ajanjakson ajan. Lopussa hoidon, lääkkeen sisältävä väliaine poistettiin ja 0,5 mg /ml MTT liuotetaan samaan alustaa lisättiin kuhunkin kuoppaan. Levyä inkuboidaan edelleen vielä 3 tuntia. Supernatantin poistamisen jälkeen lopussa inkubaation, 100 ui DMSO: ta lisättiin kuhunkin kuoppaan liuottamiseksi formatsaanikiteet, että oli muodostunut. Absorbanssi 570 nm: ssä mitattiin usean hyvin pyyhkäisyspektrofotometrillä (Model 550, Bio-Rad, USA). Solujen lisääntyminen ilmaistiin prosentteina valvonnan vertaamalla elävien solujen lukumäärä hoitoryhmässä numeroon vehikkeliryhmässä.

tarkkailu solu- ja ydinvoiman morfologia

Solut ympättiin steriloitu peitelaseja tapahtuu noin 30% konfluenssiin, jonka jälkeen 24 h inkubaation ja kemiallisen käsittelyn. Solut pestiin lyhyesti PBS: llä ja värjättiin 5 ug /ml Hoechst 33342 (Invitrogen, CA, USA) ei-FBS DMEM 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Morfologisia muutoksia soluissa tutkittiin käyttäen vaihekontrasti ja loisteputki mikroskoopit (Mikron Instruments, NY, USA).

Solusyklianalyysiä käyttämällä virtaussytometria

Ohjaus ja käsitellyt solut kerättiin ja kiinnitettiin 70 % jääkylmällä etanolilla yön yli 4 ° C: ssa. Poistamisen jälkeen etanolia ja PBS: llä pesun, kiinteän solut suspendoitiin uudelleen DNA-värjäys, joka sisälsi 50 ug /ml propidiumjodidilla (PI) ja 100 ug /ml RNaasi A: ta PBS: ssä, jonka tiheys on noin 1 x 10

6 solua /ml. Ne myöhemmin inkuboitiin vielä 30 minuuttia 37 ° C: ssa himmennetyssä valossa. Värjättyjen solujen suspensio analysoitiin virtaussytometrillä (Becton Dickinson, CA, USA). DNA pitoisuus 10000 solua näytettä käytettiin analysoimaan solusyklin DNA-histogrammeja. DNA pitoisuus solusyklin analysoitujen solujen laskettiin MODFIT 3.0 ohjelmisto (Verity Software House, ME, USA).

kvantifiointi mitoosi-indeksi virtaussytometrialla

Ohjaus- ja Käsitellyt solut otettiin talteen ja kiinnitettiin 4% formaldehydiä 10 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Sitten solut läpäiseviksi lisäämällä hitaasti jääkylmää metanolia loppukonsentraatioon 90% ja inkuboitiin jäillä 30 min. Noin 1 x 10

6 solut suspendoitiin uudelleen 100 ul: ssa inkubaatiopuskuria (0,5% BSA: ta PBS: ssä) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten soluja inkuboitiin phosphohistone H3 (Ser10) vasta-aineella (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) 1 tunnin ajan ja sitten FITC-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) vielä 30 min pimeässä huonelämpötila. Immunovärjättiin solut suspendoitiin uudelleen 0,5 ml: aan propidiumjodidia (5 ug /ml) PBS: ssä ja pidettiin pimeässä ennen analyysiä virtaussytometrillä 24 tunnin sisällä. Signaali 10000 soluista mitattiin tuottaa sirontakuvaajan.

kvantifiointi apoptoottisten korko virtaussytometrialla

Apoptoosi arvioitiin käyttäen anneksiini V-FITC Apoptosis Detection Kit (Sigma-Aldrich) kanssa määrätyn menettelyn valmistajan. Lyhyesti, solujen viljelymaljoihin otettiin talteen ja pestiin, ja noin 5 x 10

5-solut suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan 1 x Binding Buffer (10 mM HEPE /NaOH, pH 7,5, 0,14 M NaCl: a ja 2,5 mM CaCl

2). Sitten 5 ui 50 ug /ml anneksiiniV FITC-konjugaattia (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl) ja 10 ui 100 ug /ml PI Solution (10 mM kaliumfosfaattipuskuria, pH 7,4, 150 mM NaCl) lisättiin solususpensioon. 10 minuutin kuluttua inkubaation pimeässä huoneenlämpötilassa, fluoresenssisignaali soluista mitattiin välittömästi virtaussytometrillä.

Immunofluoresenssimikroskopia

Solut ympättiin 60% konfluenssiin steriloitu kannessa luistaa ja altistuvat kemikaaleille kiinnostavaan 24 tunnin kuluttua inkubaation. Sen jälkeen, kun ennalta määrätty aika hoidon kemikaalien, solut kiinnitettiin 4% formaldehydillä PBS: ssä 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, pestiin PBS: llä ja permeabilisoitiin 0,25% Triton X-100 PBS: ssa 10 min. Permeabilisoitujen solut pestiin sen jälkeen ja niitä inkuboitiin inkubaatiopuskuria (3% BSA: ta PBS: ssä) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa estää ei-spesifisen vasta-aineen sitoutumista. β-tubuliinia-vasta-ainetta (Cell Signaling Technology) inkuboitiin solujen kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, ja sitten FITC-konjugoitua vuohen anti-kani-IgG: tä (Santa Cruz), ja DNA-värjäys väriaine Hoechst lisättiin 1 h himmennetyssä valossa. Lopussa reaktio, kansi liukuu huuhdottiin PBS: llä, ennen kuin se on asennettu objektilaseille fluoresenssi kiinnitysväliaine (Dako, Tanska). Suljettuja jälkeen objektilasit tutkittiin Leica SP5 -konfokaalimikroskoopilla (viritys 488 nm FITC ja 365 nm Hoechstin).

Western blot-analyysi

kokosolulysaattia valmistettiin hajottamalla solut RIPA-lyysipuskuria (150 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,5% natriumdeoksikolaatti, 1% NP-40, ja 50 mM Tris-Cl, pH 7,5), johon oli lisätty proteaasi-inhibiittorit Cocktail Set III (Calbiochem, CA, USA) ja 1 mM PMSF, jonka tiheys on 1-2 x 10

7 solua /ml puskuria. Solususpensio sekoitettiin 30 minuuttia ja sitten sentrifugoitiin 14000 rpm 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantti kerättiin, kuten solu-uutteista. Seuraavaksi 50 ug proteiineja solulysaateista erotettiin 12% SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE) ja siirrettiin sähkön nitroselluloosamembraaneille (Bio-Rad, CA, USA). Membraani tukittiin 3% BSA tai rasvatonta maitoa PBS: ssa, jossa oli 0,05% Tween-20. Tätä seurasi inkubointi yön yli laimennettua liuosta primaarisen vasta-aineen vasten α-tubuliinin, kaspaasi-3, kaspaasi-7, kaspaasi-9, p-Cdc2 (Tyr15), sykliini A, sykliini B1, sykliini E2, MYT-1, p21, PARP (Cell Signaling), Bcl-2 (Santa Cruz), Bcl-x L (Invitrogen, CA, USA), tai Cdc2 (BD) 4 ° C: ssa. Tätä seurasi inkubointi huoneenlämpötilassa HRP-konjugoitu vasta-aine (anti-hiiri-IgG- tai anti-kani-IgG) 1 h. Kolme itsenäistä koetta suoritettiin. Täplät visualisoitiin parannetun kemiluminesenssi (ECL) käyttäen Western blotting Luminol Reagent (Santa Cruz). Kuvat kehitetty otettiin kiinni kanssa LAS-4000 geeli asiakirjajärjestelmä (Fuji Film, Tokio, Japani).

In vitro

tubuliinin sameusmääritykseen

vaikutus huumeiden mikrotubulusten polymeroitumisen seurattiin CytoDYNAMIX ™ Screen 01 kit (Cytoskeleton Inc., CO, USA). Lyhyesti, lääkkeet eri pitoisuuksina valmistettiin DMSO 10 × vahvuus G-PEM puskurissa, joka sisältää 80 mM PIPES (pH 6,9), 2 mM MgCI

2, 0,5 mM EGTA, 1 mM GTP ja 5% glyserolia . DMSO toimi ajoneuvon ohjaus. Sen jälkeen, 10 ui 10 x G-PEM puskurissa lisättiin kuhunkin kuoppaan esilämmitettyä 96-kuoppalevylle, ja annettiin inkuboitua 2-5 min. Tubuliinia proteiinia ( puhtaus 97%) sekoitettiin G-PEM puskurissa konsentraatiossa noin 4 mg /ml, ja sitten 90 ui tubuliinia lisättiin kuhunkin kuoppaan, joka sisälsi 10 ui puskuriliuosta. Ravistelun jälkeen absorbanssi 340 nm: ssä mitattiin minuutin välein 60 minuutin ajan 37 ° C: ssa.

RNAi ehtyminen MAD2

DU145-soluja siirrostettiin 60 mm: n maljoille antamaan konfluenssi 50 -70% 24 h. Solut transfektoitiin joko toinen Mad2L1 siRNA (Origene, MD, USA) tai kontrolli-siRNA: n läsnä ollessa Sitran transfektioreagenssia (Origene) Opti-MEM-alustassa (Invitrogen, CA, USA) 24 tuntia. Transfektoidut solut huuhdeltiin kerran PBS: llä ja inkuboitiin DMEM (Invitrogen, CA, USA) väliaine 24 tuntia ja inkuboitiin edelleen vielä 24 h elatusaineessa, joka sisälsi 20 uM Andro ja 100 uM taksi. Sitten solut huuhdeltiin kerran PBS: llä, trypsinoitiin, ja kiinnitettiin 70% etanolilla ja varastoitiin -20 ° C: ssa yön yli. Mitoosi indeksin jälkeen solut kvantifioitiin virtaussytometrialla perustuen signaalien vasta-ainetta fosfo-histoni H3 (at S10) ja propidiumjodidia.

Tilastollinen

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen alkuperä 7.5 ohjelmistot (Originlab Corporation, MA, USA) ja Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA). Kaikki tiedot analysoitiin 3 tai 4 itsenäistä koetta. Tulokset ilmaistiin keskiarvona ± S.D. Erot analysoitiin käyttämällä kahden otoksen Studentin t-testejä. P-arvo on alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä.

Tulokset

Andro on paljon sytotoksinen kuin taksi kasvun estämisessä eturauhassyöpäsolujen

Ihmisen eturauhasen syöpä DU145-soluja altistettiin 0-50 uM Andro 24, 48 ja 72 h, ja solujen lisääntyminen määritettiin käyttäen MTT-määritystä, joka on yhteinen tapa mitata metabolista aktiivisuutta solujen vastaamaan solujen määrä tai proliferaatiota. Andro inhiboivat DU145 solujen ajasta ja pitoisuudesta riippuvalla tavalla verrattuna hoitamattomiin lisääntyviä soluja (kuvio 1A). Laskennallinen IC

50-arvot Andro on DU145 soluja 42,76 ± 3,29 (24 h), 13,70 ± 1,45 (48 h) ja 8,36 ± 0,77 uM (72 h). IC

50-arvo 48 h Tässä tutkimuksessa saadut oli vain hieman suurempi kuin arvo (12 uM) on aiemmin raportoitu Nanduri

et al.

[29]. Pitoisuuksina suurempi kuin IC

50-arvo, Andro aiheuttamiin muutoksiin solumorfologialtaan käsiteltyjen DU145 soluja, joka ilmestyi pyöreä ja kutistunut ja osoitti kupliminen (Kuva S1). Nämä solut oli myös kromatiinin kondensaatio ja hajanainen ytimet (kuva S2).

soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla (A) Andro ja (B) taksi annetun ajanjakson ajan ja solujen lisääntyminen tarkkailtiin MTT: llä. Tiedot kolmesta itsenäisestä kokeesta ilmaistiin prosentteina elinkelpoisuuden verrattuna vehikkelikontrolliin (DMSO). Arvot ovat keskiarvo ± S.D.

arvioitiin myös sytotoksisuutta taksi on DU145 soluihin käyttäen MTT-määritystä. Tulokset osoittivat, että taksi on paljon vähemmän sytotoksinen DU145-soluja kuin Andro ja että pitoisuus 500 uM taksi tarvittiin inhiboimaan solun kasvua 52% 48 tunnin kuluttua altistuksen (kuvio 1 B). Tuloksena Tämän tutkimuksen on yhdenmukainen aiemman raportin koskien sytotoksisuutta taksi nisäkkäiden syöpäsolujen [30].

Andro indusoi mitoosi pysähtymiseen ja apoptoosiin

Solusyklianalyysiä osoitti, että hoitoon DU145 solut jossa Andro pitoisuuksina välillä 0-40 uM johti kertyminen solujen G2 /M, mutta lasku solujen G0 /G1 pitoisuudesta riippuvaa (kuvio 2A) ja ajasta riippuvaisella tavalla (kuvio 2B). Olemme myös päättäneet, onko kasvu G2 /M väestö johtui kasvusta mitoosi soluissa 24 tunnin kuluttua Andro hoidon. Olemme seuranneet mitoosi-indeksi (suhde mitoosi solujen muuhun solupopulaation) virtaussytometrialla käyttämällä immunovärjäys fosfo-histoni H3, mitoottisen markkeri, ja havaitsimme, että Andro indusoi merkittävää kerääntymistä mitoottisten solujen annoksesta riippuvaisella tavalla (kuvio 2C). 11-kertainen nousu mitoosi soluissa hoidon jälkeen 40 uM Andro 24 tuntia havaittiin verrattuna ajoneuvon ohjaus (solun väestön suorakulmioita merkitty M kuvissa 2C ja 2D). Välinen vertailu mitoosi-indeksi ja prosenttiosuus G2 /M-solujen populaatiossa ehdotti, että kertyminen G2 /M-soluissa johtui pääasiassa mitoottisiin pidätys (kuvio 2D). Tämä koesarja osoitti, että 24 tunnin kuluttua hoidon Andro, solut olivat pääasiassa mitoosi pidätykseen.

(A) Soluja altistettiin 0-40 uM Andro 48 tuntia; (B) solut altistettiin 40 uM Andro varten 0-72 tuntia. Solujen DNA värjättiin propidiumjodidilla (PI) ja analysoitiin virtaussytometrialla. Solujen prosenttiosuus kussakin yksittäisessä vaiheessa solusyklin on laskettu ModFit ohjelman ja ilmaistiin keskiarvona ± S.D. (N = 3 tai 4). (C 0,01).

tutkittiin myös tilanteet aiheuttivat Andro apoptoosin. Andro-käsitellyt solut värjättiin anneksiini V-FITC: llä ja analysoitiin virtaussytometrialla. Aika-kurssi tutkiminen apoptoottisten hinnat käsittelyn jälkeen Andro osoittivat, että eniten varhainen apoptoottinen korko (9,38%) ilmeni 48 h; kuitenkin, 72 h, varhainen apoptoottiset laski, ja solukuolemaa nousi (kuvio 3C). Lisäksi kasvavia pitoisuuksia Andro vaikutti sekä varhaisen ja myöhäisen apoptoosin annoksesta riippuvalla tavalla (kuviot 3A ja 3B). Olemme päätellä, että hoito Andro inhiboivat DU145 solut G2 /M vaiheessa ja että enemmän näitä soluja eteni kohti apoptoosin aikana pidempiaikaista hoitoa, pitkittyneen mitoosi pidätys johtaa apoptoosin.

(A B) käsittelyn jälkeen 48 h 0-80 uM Andro, solut kerättiin ja kaksinkertaisesti värjättiin anneksiini V-FITC-vasta-ainetta ja PI ennen analysoitiin virtaussytometrialla. (A) Yksi joukko edustavia pistekuvioita ilmaisee prosenttiosuuden varhaisen apoptoottisten solujen (anneksiini V-FITC

+ /PI

-, alempi oikeanpuoleinen paneeli) ja prosenttiosuus myöhään apoptoottisten ja kuolleet solut (anneksiini V- FITC

+ /PI

+, oikea yläpaneeli). (B) Juoni prosenttiosuus varhaisen apoptoottisten ja myöhään apoptoottisten ja kuolleet solut eri Andro pitoisuudet ilmoitetaan keskiarvona ± S.D. (N = 4). (C) Soluja altistettiin 40 uM Andro varten 0-72 tuntia. Juoni prosenttia varhaisen apoptoottisen ja myöhään apoptoottisten ja kuolleita soluja vastaan ​​aika hoidon ilmoitetaan keskiarvona ± S.D. (N = 4).

vaikutus Andro ilmentymistä koskevat solusyklin sääntelyviranomaisten kaspaaseiksi ja Bcl-2-perheen proteiinien

tutkia molekyylitason mekanismeja mitoosi pidätyksen aiheuttama Andro ekspressiotasot useita solun tärkeitä-lukiertosäätelijöistä analysoitiin western-blottauksella. Analyysi immunoblot osoittivat, että 24 tuntia käsittelyn jälkeen, joka on 5,7-kertainen, 3,2-kertainen, ja 3-kertainen nousu sykliini B1, p21, ja fosforyloidun (Tyr15) Cdc25c proteiinin tasot, vastaavasti, havaittiin (kuviot 4A-D) , kun taas proteiinin tasot sykliini A: n ja sykliini E2 vähentynyt kasvavien pitoisuuksien kanssa Andro. Selvä rinnakkainen liikkuvuuden siirtyy johtuen fosforylaation Cdc25c, Myt1 ja p21 oli läsnä 24 h (kuvio 4A). On huomattava, että ilmaus sykliini B1 oli riippuvainen pitoisuudesta Andro. Esimerkiksi sen ilme oli korkeimmillaan 40 uM, mutta laski 80 uM. Samoin fosforylaation tasoja Cdc25c ja Myt1 oli voimakkain hoidon jälkeen 40 uM Andro.

(A) Soluja inkuboitiin 0-80 uM Andro 24 tai 48 tuntia. 40 ug solulysaatti erotettiin elektroforeesilla 12% polyakryyliamidigeelissä, siirrettiin nitroselluloosamembraanille ja immunoblotattiin vastaan ​​osoitetun solusyklin säädin vasta-aineita. Tiedot ovat määrällisesti Länsi-täplien kolmen erillisen kokeen. (B) muutos sykliini B1 tasolla kontrolliin verrattuna (0 uM) päässä kvantifiointiin western blotit piirrettiin pitoisuuden Andro 24 ja 48 tuntia. (C) muutos tasot fosforyloitua Cdc25c piirrettiin konsentraation Andro. (D) muutos tasojen p21 piirrettiin konsentraation Andro. Standardipoikkeamat kolmesta itsenäisestä kokeesta on esitetty.

tarkasteltiin myös ekspressiotasot proteiinien, jotka liittyvät apoptoosin, kaspaasien ja Bcl-2-perheen jäsenten immunoblottauksella niiden spesifisten vasta-aineiden. Pitoisuudesta ja ajasta riippuvaa lohkaisu PARP (poly (ADP-riboosi) polymeraasi), kaspaasi 7, 9 ja 3 havaittiin (kuvio 5A). Pro-apoptoottinen proteiini Bax ei havaittu joko valvonnasta tai käsitellyt solut; kuitenkin, pro-selviytymisen jäsen Bcl-2 oli heikosti ilmaistu. Ilmaus Bcl-XL, anti-apoptoottisen proteiinin, havaittiin selvästi, mutta hitaammin vaeltavat muodossa havaittiin käsitellyissä soluissa 48 h altistamisen jälkeen 80 uM Andro (kuvio 5B). Nämä tiedot viittaavat siihen, että apoptoosi selvimmin indusoitui 48 h hoidon 80 uM Andro.

Soluja inkuboitiin 0-80 uM Andro 24 tai 48 h, otettiin talteen ja hajotettiin. 40 ug solulysaattia erotettiin 12% polyakryyliamidigeelillä, siirrettiin nitroselluloosakalvolle ja immunoblotattiin vasta-aineiden (A) kaspaasi-7, -9, ja -3 ja alustan PARP; ja (B) Bcl-2-perheen proteiinien, mukaan lukien Bcl-XL, Bcl-2, ja Bax. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen.

taksi voimistaa kasvua estävää vaikutusta Andro

ehdotetaan, että taksi voi vaikuttaa sytotoksista vaikutusta Andro on syöpäsolujen; Siksi arvioimme kombinatoorista vaikutus Andro ja taksi soluproliferaatioon käyttämällä MTT-määritystä. Kuten on esitetty kuviossa 6A, kun se altistetaan 100 uM taksi ilman Andro, suhteellinen osuus lisääntyvien solujen oli 93,33 ± 6,27% (keskiarvo ± SD, n = 4), joka ei ollut merkittävästi pienempi kuin ajoneuvon ohjaus (käsittelemättömät solut) . Sitä vastoin merkittävä lasku prosenttiosuus lisääntyvien solujen (% valvonnan solujen lukumäärän = 65,6%) havaittiin, kun läsnä oli 10 uM Andro yksin, mutta lisää lisäksi 100 uM taksi johti hieman alhaisempi lisääntyvien solujen (54,78%). Kuitenkin kasvua estävää vaikutusta 20 uM Andro yhdessä 100 uM Taxi (% valvonnan = 20,92 ± 1,89%) oli noin kaksinkertainen vaikutus hoidon Taxi yksinään (% valvonnan = 39.58 ± 1,79%, n = 4) , ja ero soluproliferaatioon tapahtui, kun määrä taksi nostettiin yhdistettynä korkeamman Andro pitoisuuksilla. Samanlainen suuntaus havaittiin myös, kun 200pM taksi lisättiin yhdessä suurempia määriä Andro; kuitenkin, oli 14,7%: n lasku solujen määrä, kun läsnä on taksi yksinään (85,27%), joka oli merkittävästi alhaisempi kuin käsiteltyjen solujen ajoneuvon ohjaus. Siksi kaikissa myöhemmissä tutkimuksissa, 100 uM taksi on käytetty yhdessä eri pitoisuuksien Andro. Saadut tulokset morfologinen analyysi käsiteltyjen solujen avulla ero häiriöitä sijaan mikroskopia korreloivat hyvin koskevat tiedot solujen lisääntymistä (kuvio 6B). Soluja käsiteltiin kahdella yhdisteet osoittivat lisää kutistumista, alempi solutiheys, suurempi määrä kelluvat solut ja ydin- tiivistyminen ja pirstoutumista (ei esitetty) kuin soluja käsiteltiin Andro yksin.

(A) solut käsiteltiin 0-40 uM Andro ja 0, 100 tai 200 uM taksi 48 tuntia, ja solujen lisääntyminen määritettiin MTT-määrityksellä. Data neljästä itsenäisestä kokeesta ilmaistiin prosentteina elinkelpoisuuden verrattuna vehikkelikontrolliin (DMSO) ja keskihajonta (keskiarvo ± S.D., n = 4). * Tarkoittaa merkittävästi eroa ohjaus (

p

0,01). (B) Soluja käsiteltiin 20 uM Andro 48 h: n läsnä tai poissa ollessa 100 uM taksi, ja tarkasteltiin ero häiriöitä kontrasti mikroskopia. Bar = 50 pm. (C) vertailu elinkelpoisuuden MTT: llä on DU145, PNT2 ja Hs-27-solujen käsittelyn jälkeen 20 uM Andro ja 100 uM taksi. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja keskihajonnat on merkitty.

Olimme kiinnostuneita testataan onko dual-lääkehoito oli spesifinen syöpäsoluja verrattuna kuolemattomaksi mutta ei-syöpäsoluja. MTT-määritystä käytettiin verrata leviämisen DU145 solujen PNT2 soluja, ihmisen eturauhasen solulinja kuolemattomiksi SV40-viruksen, ja Hs-27-solut, ihmisen esinahka fibroblastisolulinjan, käsiteltiin 20 uM Andro ja 100gM Taxi . Samoissa olosuhteissa, vain 30,3% ja DU145 soluista oli elinkelpoinen, kun taas 48,6% ja 62,4% sekä PNT2 ja Hs-27-soluissa, vastaavasti, olivat elinkelpoisia (kuvio 6C). Tuloksena viittaa siihen, että DU145 solut olivat herkempiä kaksi lääkettä kuin kaksi muuta kuolemattomiksi ihmisen solulinjoja.

taksi ja Andro aiheuttama mitoosi pidätys johti kertyminen sykliini B, Cdc25c, ja p21

sen tutkimiseksi, yhdistetyn estävää vaikutusta kasvuun DU145 johtui solusyklin pysähtymiseen, solusyklin tapahtumia ja mitoosi-indeksi arvioitiin Andro käsiteltyjä soluja tai ilman taksi. Kun Andro ei ollut läsnä, prosenttiosuus solujen G2 /M molemmissa ryhmissä ei ollut merkittävästi erilainen. Kuitenkin, kun pitoisuus Andro nostettiin 10 uM 40 uM, prosentuaalinen solujen G2 /M yhdistettyyn hoitoryhmissä oli huomattavasti korkeampi kuin prosenttiosuus solujen Andro yksin ryhmä (kuvio 7A). Lisäksi merkittäviä eroja havaittiin viljelmän käsiteltiin 24 tuntia 20 uM Andro yhdessä 100 uM Taxi (kuvio 7B). Osuus käsiteltyjen solujen M vaiheessa mitattiin myös anti-fosfo-histoni H3 (S10) vasta-aine. Mitoottisten indeksi yhdistetyn ryhmän oli noin kaksinkertainen taso käsiteltyjen solujen Andro yksinään (23,67 ± 4,21% vs. 10,65 ± 0,22%, n = 4), kun taas mitoosi indeksit sekä vertailu- eivät eronneet toisistaan (kuvio 7C), mikä viittaa siihen, että taksi ei yksinään indusoi M vaiheen pysähtymisen. Immunoblottaus käytettiin analysoimaan vaikutuksia huumeita ekspressiotasot ja muuttaminen Cdc25c, sykliini B1, ja p21-proteiineja (kuvio 7D). Pitoisuuden lisäämistä Andro kasvoi fosforyloidun muotoja Cdc25c 2-kertainen, p21-proteiinin lähes 5-kertaisesti, ja sykliini B1 4,1-kertainen (kuviot 7E-G). Kun 100 uM taksi lisättiin 20 uM Andro, fosforylaatio Cdc25c ja proteiinin taso sykliini B1 olivat koholla lähes 2-kertaiseksi ja 3,5-kertaiseksi. Sitä vastoin ilmaus taso p21 ei muuttunut merkittävästi yhdistetyssä hoitoryhmässä. Kuitenkin 40 uM Andro yhdessä 100 uM taksi vähensi sykliini B1 ja Cdc25c tasoilla, mutta lisäsi p21 taso 1,8-kertaiseksi verrattuna 20 uM Andro ja 100pM Taxi hoitoa. Nämä kokeet osoittavat, että yhdistetty hoito johti kertymistä mitoottisten pidätettiin soluja.

soluja käsiteltiin (A) 0-40 uM Andro 48 h (B) 20 uM Andro varten 0-48 h läsnä ollessa tai poissa ollessa 100 uM taksi. Solujen DNA värjättiin PI ja analysoitiin virtaussytometrialla. Jakelu solusyklin on laskettu ModFit ohjelman. Keskiarvo ± S.D. (N = 4) prosenttiosuuden G2 /M-solun läsnä ollessa taksi (100 uM) ja ilman taksi (Taxi-) verrattiin. * Tarkoittaa merkitsevää eroa kahden ryhmän, * p 0,01, **

p

0,05. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen.