Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Bmi1 on olennainen osa Polycomb- Sortavat Complex 1 (PRC1) ja osallistuu patogeneesiin useita syöpiä. Se on myös keskeinen rooli toiminnan endogeenisten kantasolujen ja syövän kantasoluja. Aikaisempi työ sekaantunut rooli syövän kantasoluja patogeneesissä haimasyövän. Oletimme, että Bmi1 tärkeä osuus parantamisessa haiman kasvainten muodostumiseen ja toiminta syövän kantasolujen haiman adenokarsinooma.

Methods

mitataan endogeenisten Bmi1 tasoilla ensisijainen ihmisen haimatiehyen adenokarsinoomat, haiman intraepiteeliset neoplasioihin (PanINs) ja normaali haima immunohistokemiallisesti ja Western blottauksella. Toiminta Bmi1 haimasyövän arvioitiin muuttamalla Bmi1 ilmentymisen useissa solun mallijärjestelmissä mittaamalla solujen proliferaatiota ja apoptoosia in vitro invaasio, kemoterapian resistenssin, ja in vivo kasvun ja metastasoitumisen ortotooppisten mallin haimasyöpä. Olemme myös arvioinut syövän kantasolujen taajuus, tumorsphere muodostumista ja kasvua in vivo ihmisen haimasyövän ksenograftien jälkeen Bmi1 hiljentäminen.

Tulokset

Bmi1 yliekspressoitui ihmisen PanINs, haiman syöpiä, ja useita haimasyövän solulinjoissa. N yli-ilmentyminen Bmi1 vuonna MiaPaCa2 soluissa johti lisääntynyt leviäminen, in vitro invaasio, suurempi in vivo kasvaimia, enemmän etäpesäkkeitä, ja gemsitabiinin vastus taas vastakkainen tuloksia saatiin, kun Bmi1 hiljennettiin in Pancin-1-soluissa. Bmi1 oli yli-ilmentynyt syövän kantasolujen primaaristen ihmisen haimasyövän ksenografteja. Haiman tumorspheres myös osoittaneet korkeita Bmi1. Hiljentäminen Bmi1 esti toisen ja kolmannen asteen tumorsphere muodostumista, laski ensisijainen haiman ksenografti kasvua, ja alensi osuus syövän kantasolujen ksenograftikudoksesta.

Johtopäätökset

tulokset osoittavat Bmi1 vuonna invasiivisuus ja kasvu haimasyövän ja osoittaa sen keskeinen rooli sääntelyn haimasyövän kantasolujen.

Citation: Proctor E, Waghray M, Lee CJ, Heidt DG, Yalamanchili M, Li C, et al. (2013) Bmi1 Parantaa tuumorigeenisyyteen ja Cancer Stem Cell Tehtävä Haiman adenokarsinooma. PLoS ONE 8 (2): e55820. doi: 10,1371 /journal.pone.0055820

Editor: Klaus Roemer, University of Saarland Medical School, Saksa

vastaanotettu: 31 elokuu 2012; Hyväksytty: 02 tammikuu 2013; Julkaistu: 20 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Proctor et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitus oli tarjoamia National Institutes of Health R01 CA131045 ja Rich Rogel Family rahaston Haimasyöpä Research. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haiman adenokarsinooma (PDA) on erittäin aggressiivinen epiteelin syövän kanssa pahin ennuste merkittävistä pahanlaatuisen raportoitu 5 vuoden pysyvyys on noin 5%. Se on neljänneksi suurin syy syövän kuolemaan vuodessa Yhdysvalloissa ja kahdeksas maailmanlaajuisesti odotettu esiintyvyys 43920 tapauksista vuonna 2012 pelkästään Yhdysvalloissa [1]. Huolimatta edistysaskeleet ymmärrystämme tämän taudin, molekyyli tapahtumia taustalla kehittymistä ja etenemistä haimasyövän ovat vielä suurelta osin tuntemattomia ja saattavat olla avain kehittää entistä tehokkaampia ja uusia hoitostrategioita.

B-solu- erityiset Moloneyn pistokohtaan 1 (Bmi1) on jäsen Polycomb- ryhmän perheen proteiineja, jotka oli alun perin havaittiin indusoivan hiiren lymfooma iden muodostumiseen yhteistyö c-Myc [2], [3]. Kasvaimia synnyttävän modulaatio Bmi1 on edelleen selvitetty useissa näkökohtia solujen lisääntymisen ja kehitystä. Bmi1 on osoitettu olevan keskeinen rooli solukierron säätelyssä toimimalla transkription repressori on INK4a /ARF lokuksen [4], [5]. Säätelyhäiriötä by Bmi1 kautta vakaa inaktivointi p16INK4a-pRb ja p14ARF-MDM2-p53 reittejä on osallisena synnyssä hematopoieettisen järjestelmän [6], [7] ja kehitetään pieniä cell carcinoma keuhkoissa [8]. Bmi1 on myös kyky kohdistaa muita näkökohtia solun vanhenemista, sillä yli-ilmentyminen Bmi1 on osoitettu kuolemattomiksi normaalien fibroblastien ja maitorauhasen epiteelisoluissa aktivoituminen ihmisen telomeraasin käänteistranskriptaasin geenin näissä soluissa [9]. Lisäksi vankka todisteet viittaavat siihen, että Bmi1 on kriittinen invasiivisia potentiaalia ja edistää tuumorigeenisia kapasiteettia paksusuolensyöpä [10], medulloblastoma [11], kurkunpään syöpä [12], rintasyövän [13], ja eturauhassyövän [14]. Viimeaikaiset tutkimukset myös sotkea Bmi1 ratkaisevana proteiini ylläpidosta ja itseuudistumisen normaalien kantasolujen, kuten hematopoieettiset, hermo-, myelooinen ja squamous kantasolujen [15], [16], [17], [18] sekä syöpä kantasoluja useissa kasvaintyypeissä [14], [19], [20], [21]. Bmi1 on todettu yllä syövän kantasolujen uudistumisen glioblastoma multiforme ja määritellä proliferatiivista kapasiteettia leukemiasolujen kantasolujen [22], [23]. Lisäksi menetys Bmi1 on havaittu estää etenemistä keuhkotuumoreiden onkogeenisessä K-ras-aloitetaan hiirimallissa keuhkosyöpä estämällä bronchiolalveolar kantasolujen [24].

Bmi1 on äskettäin liitetty monilta osin haiman biologia. Asetukseksi INK4a lokukseen Bmi1 ja MLL1 on liitetty ylläpitoon haiman β-solujen lisääntymisen ja kapasiteettia p solujen toipua jälkeen haiman saarekesolujen vahinko [25]. Bmi1 ilmentävät acinar ja saarekesolujen on löydetty hiiren haimassa ja Bmi1 on keskeinen rooli elpyminen asinussolujen osaston jälkeen seruleiini aiheuttamaan haimatulehdukseen ja difteriatoksiinin välittämä rauhasrakkulasolujen solun ablaatio hiirissä [26], [27]. Yliekspressio Bmi1 on havaittu ihmisen haimasyövän näytteitä verrattuna normaaliin haiman [28], [29], [30]. Bmi1 oli yläreguloituja haiman kasvaimia, joita esiintyy Ela-TTA TetO-Cre, KrasG12V geneettisesti hiirimallissa haimasyövän [28]. Samanlaisia ​​havaintoja tehtiin aikana seruleiini aiheuttama haimatulehdus [28]. Yliekspressio Bmi1 on korreloinut huonompi ennuste pienessä kohortin haiman syöpäpotilaiden [29]. Vaikka nämä tiedot mahdollisesti sotkea Bmi1 haiman kasvainten synnyssä, meillä on hyvin rajallinen käsitys taustalla olevien mekanismien Bmi1 toiminto. Tässä tutkimuksessa tarkastellaan toiminnallista merkitystä Bmi1 ilmaisun haiman adenokarsinooma käyttämällä ensisijaista ihmisen ksenograftimalleja ja haimasyövän solulinjoissa. Työmme osoittaa, että Bmi1 tukee ihmisen haimasyövän kasvua säätelemällä solukierron etenemistä ja ylläpitää haimasyövän kantasolujen.

Tulokset

Bmi1 ilmenee vahvasti Panin vaurioita, haiman adenokarsinooman ja valitse haimasyövän solulinjoissa

ensin pyrittiin määrittämään ilmentymisen Bmi1 näytteissä ihmisen ensisijainen haiman syövät ja verrattuna ekspressiotasoja näytteisiin normaalin haiman. Kudososat 10 eri ensisijainen ihmisen haiman adenokarsinooman, 10 normaali haima näytteitä, ja 16 esineoplastiset Panin vaurioita vaihtelevalla epiteelin dysplasiaa (Panin 1 PanIN3) tutkittiin Bmi1 ilmaisun seuraavista immunohistokemiallisella värjäyksellä. Kun mikroskooppinen arviointi, olemme huomanneet, että PANIN vaurioita ja osa ihmisen haiman adenokarsinooma osoitti merkitty: n ilmennyksen ylössäätely Bmi1 verrattuna normaaliin haiman kudoksista (kuvio 1A). Merkittävä osa Panin vaurioita (kohtalaista tai vaikeaa dysplasia) ja adenokarsinooman leikkeet oli värjätty sekä sytoplasman ja ydinvoiman Bmi1 (nuolet kuviossa 1A paneelissa vi). Mielenkiintoista on, Bmi1 värjäys vallitsevasti ilmentyy dysplastic rauhaskudoksen sekä PANIN ja adenokarsinooma näytteitä, paljon vähemmän korostunut värjäytymistä havaitaan osajoukko soluja strooman osa neoplastisten näytteitä. Kaikkiaan Bmi1 ilmentyi 10/16 Panin vaurion kohdat ja 8/10 ensisijainen haiman adenokarsinooman. RT-PCR: llä (dataa ei esitetty) ja Western blot -analyysi normaaleissa ja syöpäkudoksissa (kuvio 1 B) toisteta havainnot nähdään myös immunohistokemiallinen analyysi. Tutkimme myös viisi haimasyövän solulinjoissa, MiaPaCa2, Panc-1, AsPC-1, BxPC-3 ja Capan2 ekspressiota varten Bmi1 käyttäen Western-blot-analyysillä (kuvio 1C). Korkeita Bmi1 ilmentymisen havaittiin BxPC3, Panc-1, AsPC-1, ja Capan2 ihmisen haimasyövän solulinjoissa, kun taas ekspressio oli alhainen MiaPaCa2 haimasyövän solulinja. Nämä tiedot osoittavat, että Bmi1 ilmentyminen on yleinen neoplastisen haimakudoksessa ja haimasyövän solulinjoissa. Korkeaa tasoa Bmi1 ilmaisun nähdään esiasteleesioita haimasyövän (PanINs) myös, että ilmaus Bmi1 tapahtuu aikaisessa vaiheessa haiman onkogeneesiin ja saattavat olla rooli haimasyövän etenemiseen.

. Immunohistokemiaa Bmi1 ekspressio suoritettiin haima kudosnäytteiden vaihtelevalla dysplasia vaihtelee normaalista (n = 10) kautta PANIN (n = 16) ja invasiivisia haiman adenokarsinooman (n = 10). Negatiivisina kontrolleina me altistetaan kudosnäytteet sen värjäyksen menettelyn puuttuessa tietyn Bmi1 vasta-ainetta (1:100, Soluviestintä). Kuvat tallennettiin 10x, 40x ja 60x suurennus. Edustavia kuvat osoittavat muutamia soluja, jotka ilmentävät Bmi1in normaalin haiman kudos (i, ii, iii), korkeita ilmentymisen Panin vaurioita (iv, v, vi), ja merkittävä yli-ilmentymisen adenokarsinooma (vii, viii, ix). B. Western blot-analyysi Bmi1 ilmentymisen normaalissa haimassa lysaateissa (n = 10) ja haimasyövän kudoksen lysaatit (n = 10) eri potilailla suoritettiin. Bmi1 yliekspressoituu kasvaimen lysaateissa verrattuna normaaliin haiman kudosta valvontaa. Beeta-aktiini käytettiin lastaus ohjaus. C. Endogeeninen Bmi1 ilmentymistä haimasyövän solulinjoissa määritettiin Western blot -analyysillä. β-aktiini toimi latauskontrollina.

Bmi1 vaikuttaa haimasyövän soluproliferaatiota in vitro

Koska tehostetun ilmentymisen Bmi1 haiman epiteelisolujen kasvainkudoksessa ja sen tunnetun solusyklin säätelevä tehtävä, me seuraavaksi kysytään sen yliekspressio näyttelee toiminnallista roolia haiman syöpäsoluja. Valitsimme Pancin-1 ja MiPaCa2 solulinjoja näissä kokeissa, koska niiden ero tasojen Bmi1 ilmaisun (kuvio 1 C). Olemme yli-ilmentynyt Bmi1 vuonna MiaPaCa2 soluissa ja vaiennettu Bmi1 in Pancin-1-solujen lentivirus konstruktioita. Yliekspressio tai knockdovvn Bmi1 näissä solulinjoissa vahvistettiin Western blot -analyysillä (kuvio 2A). Transfektio ohjaus lentivirus–GFP-vektorilla yksinään ei vaikuta Bmi1 ilmentymistä joko solulinjassa (kuvio 2A). Lisääntynyt ilmentyminen Bmi1 in MiaPaCa2-soluissa lisäsi merkittävästi solujen lisääntymistä verrattuna ohjata MiaPaCa2-soluissa (235 ± 11% vs. 333 ± 9% 72 tuntia, p 0,0001, n = 6 kokeissa, kuvio 2B). Hiljentäminen Bmi1 ilmaisun Pancin-1 solulinjasta inhiboi solujen lisääntymistä verrattuna lentiviraalinen ohjaus shRNA tartunnan saaneita soluja, vaikka tuloksemme eivät saavuttaneet tilastollista merkittävyyttä (177 ± 12% vs. 141 ± 16% päivänä 4, p = 0,11, n = 6 kokeissa, kuvio 2B). Nämä tiedot osoittavat, että lisääntynyt ekspressiotasoja Bmi1 haimasyövän solulinjoissa parantaa solujen lisääntymistä.

. Bmi1 proteiinin ilmentyminen analysoitiin seuraavat transfektion MiaPaCa2 (ylhäällä) ja Panc-1 (alhaalla) haimasyövän soluja lentivirusvektoria (Bmi1), joka koodaa Bmi1 tai Bmi1 shRNA (Bmi1 shRNA) kuten aiemmin on kuvattu [40]. Lentivirusvektoria ilmentävät GFP (GFP) tai kontrolli shRNA käytettiin negatiivisena kontrollina. B.

In vitro

soluproliferaatiota MiaPaCa2-soluissa (vasen) ja Panc-1-soluja (oikealla) seuraavasti modulaatio Bmi1 ilmentymisen arvioitiin MTS-määritys (Promega, Madison, WI). Solunjakautumista kirjattiin laskettiin prosenttia leviämisen kasvu peräisin reagenssista oton ajankohtana (t) miinus pohjapinta reagenssin otto vuorokautena 0. Bottom paneelit esittävät havaitut muutokset leviämisen 72 tunnin kuluttua pinnoitus. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM. * P 0,05, ** p 0,0001, n = 6 itsenäisestä kokeesta. C. Edustavia solusyklin histogrammit seuraavat virtaussytometria-analyysi propidiumjodidilla (PI) värjättiin Panc-1-solut osoittavat prosenttiosuuden pienentäminen solujen pääsy S-vaiheeseen, kun Bmi1 ilmentymisen inhibition.

Muutokset Bmi1 ilmaisun tuloksena muuttuneessa etenemistä solusyklin läpi, mutta ei koron muutokset apoptoosin

havaitut muutokset solujen lisääntymisen jälkeen Bmi1 ilmaisu muutokset voivat johtua muutoksista solusyklin etenemisen kanssa tai ilman muutosta apoptoosin . Käytimme virtaussytometrianalyysiä propidiumjodidilla tutkia jakelun Panc-1 ja MiaPaCa2 solulinjoja, joilla on muuttunut taso Bmi-1 eri vaiheissa solusyklin käsitellä tässä vaiheessa. Vuonna MiaPaCa2-soluissa, induktio Bmi1 ilmentymisen havaittiin lievä, mutta ei merkittävä lisäys solujen prosenttiosuus tulevien S-vaiheen (44,7 ± 1,7%: sta 50,7% ± 2,3%, p = 0,63, n = 3 kokeita, tietoja ei ole esitetty ). Muutos Bmi1 ilmaisun johti selvempi vaikutus Pancin-1-soluissa, koska menetys Bmi1 näissä soluissa aiheutti merkittävän laskun prosenttiosuus aktiivisesti jakamalla S-vaiheen solut 54,9 ± 2,5%: sta 42,0 ± 1,4% ( * p 0,05, n = 3 kokeita, kuvio 2C). Muutos ilmaus Bmi1 ei aiheuttanut merkittäviä muutoksia apoptoosin mitattuna osa-G0 /G1 osa ja TUNEL värjäys sekä MiaPaCa2 ja Panc-1-solulinjoja (tietoja ei esitetty).

Bmi1 parantaa haiman syöpäsoluinvaasiota kapasiteetti

Bmi1 yli-ilmentyminen on aiemmin yhteydessä heikompaan ennusteeseen ja entistä invasiivisia fenotyypin muiden pahanlaatuisten kasvainten. Kysyimme Bmi1 lauseke olisi tällainen vaikutus haiman syöpäsoluissa käyttämällä matrigeelin in vitro invaasiomääritys. MiaPaCa2 solujen kohonnut Bmi1 ilme näytti lähes 2-kertainen kapasiteetti (149 ± 26 vs. 363 ± 30, * p 0,0003) ja invaasio verrattuna villityypin kontrollivektorille soluja (kuvio 3A, vasemmalla). Hiljentäminen Bmi1 in Pancin-1-soluissa johti selvästi heikentynyt kyky soluille tehdään invaasiota (61 ± 12 vs. 14 ± 4, p 0,004, kuvio 3A, oikealla). Nämä tiedot viittaavat siihen, että Bmi1 ilmentyminen ei ainoastaan ​​lisää proliferaatiota, vaan myös invasiivisia kapasiteetti haimasyövän soluja. Koska Bmi1 ilmentyminen parantaa solujen invaasiota, testasimme kykyä Bmi1 moduloida säätelijöitä epiteelin mesenkymaalitransitioon (EMT), joka on prosessi, joka liittyy invasiivinen fenotyyppi. Löysimme lisääntynyt Bmi1 ilmentymistä MiaPaca-2 solut eivät korreloineet lisääntyneen ekspression EMT merkkiaineiden vimentiinista ja ZEB1, vaikka knockdovvn Bmi1 in Pancin-1-soluissa johtaa downregulation näistä merkeistä ja Snail (kuvio 3B), mikä osoittaa selkeä suhde Bmi1 ja ilmentyminen EMT merkkiaineiden haiman syöpäsoluja.

. N yli-ilmentyminen Bmi1 vuonna MiaPaCa2 soluissa parantaa niiden invasiivisuus in vitro Matrigel invaasiota määritykset (vasen paneeli). Sen sijaan Bmi1 downregulation in Pancin-1-soluissa johtaa alentuneeseen kasvainsolun invaasiota (oikea paneeli). Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM. * P 0,0003, ** p 0,004, n = 6 itsenäisestä kokeesta. B. yliekspressio Bmi1 vuonna MiaPaCa2 soluissa johtaa säätelyä EMT markkereita vimentiinista, ja ZEB1, vaikka downregulation Bmi1 in Pancin-1-soluissa johtaa alentunut ilmentyminen EMT markkereita. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM kontrollisoluihin verrattuna (* p 0,005). C. Solujen eloonjäämistä GFP tai Bmi1 transfektoiduista MiaPaCa2 soluja (vasemmalla) seuraava gemsitabiinihoidon 48 tuntia. Tiedot kirjattiin kertaluokkamuutos haltuunsa käsittelemättömässä ryhmässä ja ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM (* p 0,05 vs. kontrolli). q-RT-PCR-analyysi MRP5 ilmaisun GFP tai Bmi1 transfektoiduista MiaPaCa2 soluja (oikealla) seuraava gemsitabiinihoidon. Aineisto on normalisoitu GAPDH ja ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM (* p 0,05 kontrolliryhmään verrattuna).

Bmi1 lisää gemsitabiinin vastus

EMT-fenotyyppi on kuvattu edistää ei vain haimasyövän invaasio mutta myös hoitoa resistenssin haimasyöpäsoluissa [31], [32]. Siksi arveltu, että BMI-1 saattaa säännellä vastustuskyky kemoterapeuttisia aineita haiman syöpäsoluja. Tämän hypoteesin testaamiseksi, MiaPaCa2 soluja, jotka ekspressoivat GFP: tä yksinään tai Bmi1 jätettiin käsittelemättä tai niitä käsiteltiin 100 uM gemsitabiinin 48 tuntia ja määritykset suoritettiin arvioimaan solujen eloonjäämistä. Kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin mittaamiseksi ilmentymisen muutosten ABC transporter geenin MRP5. Jäsenet MRP perhe ovat tärkeitä välittämisessä lääkeresistenssin ja MRP5 on osoitettu ilmaistaan ​​huomattavalla haimasyövän vertailuryhmän haiman kudoksiin, mikä viittaa siihen, se voisi olla rooli lääkeresistenssin [33]. MiaPaCa2-solujen kohonnut ekspressio Bmi1 oli kasvanut vastustuskyky solukuolemaa vasteena gemsitabiinin ja lisääntyneen ekspression lääkeaineen resistenssigeenin MRP5 kontrollisoluihin verrattuna. Nämä tiedot viittaavat siihen Bmi1 osallistuu terapeuttinen resistenssin haimasyöpäsoluissa ja että MRP5 voivat edistää tämän fenotyypin.

Bmi1 lisää haimasyövän solujen kasvainten muodostumiseen in vivo

Koska meidän in vitro viittasivat siihen, että Bmi1 näytelmiä sääntely rooli haimasyövän solujen lisääntymisen ja invaasio, halusimme käsitellä biologista merkitystä nämä tulokset in vivo potilaalle tehdä mallin haimasyövän. Tilanteen korjaamiseksi Tässä vaiheessa meidän pistetään lentivirus- transdusoitiin solulinjojen osaksi haiman hännät vastaanottajan NOD /SCID-hiiriin ja mitataan tuloksena kasvaimen kasvua ja kehitystä Ekstrapankreaattisia etäpesäkkeiden näissä hiirissä. Sen jälkeen induktion Bmi1 ilmaisun MiaPaCa2 solut osoittivat merkitsevästi enemmän

in vivo

kasvaimen kasvua. Bmi1 indusoi MiaPaCa2-soluissa osoitti parannettu siirteen toimiminen, 100% (5/5) ortotooppisten kasvaimen muodostumisen, kun taas vain 3/5 hiiriä, joihin injektoitiin villityypin MiaPaCa2-solut osoittivat haimakasvaimesta juurtumista (taulukko 1). Lisäksi suuntaus suurempaa kasvaimen koon havaittiin kasvainten muodostettu Bmi1 ilmentäviä soluja verrattuna ohjata MiaPaCa2-soluissa (0,27 ± 0,17 cm3 vs. 0,98 ± 0,41 cm3, p = NS, kuvio 4A). Kaikki hiiret injektoitiin joko ohjattu Panc-1-soluja (5/5) tai Bmi1 vaiennettu Panc-1-soluja (5/5) osoitti kasvainten muodostumista haimassa, mutta Bmi1 vaiennetaan Panc-1-soluissa muodostaa kasvaimia, jotka olivat 2,5 kertaa pienempi keskimäärin kuin kasvaimet johdettu ohjaus Bmi1 ilmentävien Pancin-1-soluissa (1,21 ± 0,23 cm3 vs. 0,42 ± 0,09 cm

3, * p 0,05, kuvio 4A, alapaneeli). Lisäksi suurempien kasvaimen kokoa, Bmi1 ilmentävät solut tehostunut metastaattista potentiaalia

in vivo

. Ruumiinavauksen tehty eläimillä 28 päivän kuluttua injektion Bmi1 ilmentävien MiaPaCa2 solut paljasti brutto etäpesäke kasvaimen ulkopuolisiin haiman sivustoja, kuten vatsakalvon, maksa ja suolisto in (3/5 eläimissä, kuva 4B), kun taas mitään brutto metastaattinen talletukset (0 /5) havaittiin hiirissä, joihin injektoitiin villityypin MiaPaCa2 solut 28 päivää (taulukko 1). Nämä tiedot vahvistavat meidän in vitro havainnot ja tukevat käsitystä, että Bmi1 koordinoi proliferatiivisia ja invasiivisia ohjelmia haiman syöpäsoluja.

. Kuvat ovat osoittaneet osoittaa suhteellinen kasvaimen koon ero 28 päivän kuluttua potilaalle tehdä haima istuttaminen MiaPaCa2 (ylhäällä) ja Panc-1-solut (alhaalla) NOD-SCID-hiirissä jälkeen moduloi Bmi1 ilme. Kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen kaavaa tilavuuden ellipsoidin rakenne (4/3 * π * leveys /2 * pituus /2 * korkeus /2). Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM (* p 0,05, n = 5 itsenäisestä kokeesta). B. Kuva näytetään on tyypillinen parannettu metastaattisen potentiaalin MiaPaCa2 soluissa indusoima Bmi1. * Merkityt sivustot osoittavat kokonaispaino etäpesäkkeiden MiaPaCa2 kasvaimen Ekstrapankreaattisia sivustoja NOD-SCID-hiirissä 28 päivää seuraavan ortotooppisten solujen injektointia.

Bmi1 ilmentyy voimakkaasti haiman syövän kantasoluja ja valvoo niiden itsensä -renewal

laboratorio on aiemmin tunnistettu asukkaan erittäin tuumorigeenisen solujen ala- populaation, joka näyttää ominaisuudet itseuudistumisen ja eriyttäminen haimasyövän [34]. Oletimme, että Bmi1 voi olla toiminnallinen rooli näissä haimasyövän kantasolut (CSCS) annetaan osallistumisensa muissa kantasolujen järjestelmiin. Me kääntyi varhainen ensisijainen ihmisen haimasyövän ksenograftien käsitellä tätä kysymystä. Hyödyntämällä fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS), olemme eristäneet CSCS yhdistämällä CD44, CD24, ja ESA (tunnetaan myös EpCAM tai epiteelin soluadheesiomolekyyli) ilmentyminen solun pinnalla [34]. Kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin mittaamiseksi Bmi1 tasoa CSCS (solun pinnalla CD44

+ CD24

+ ESA

+) ja verrattiin jäljellä suurin kasvainsolut kerättiin ihmisen haimasyövän ksenografteja kasvatettiin NOD-SCID-hiirissä. Normaali haima otteita toimi ylimääräisenä kontrolli. Erityisesti, haiman CSCS on huomattavasti korkeampi ilmentyminen Bmi1 mRNA: ta (noin 9-kertaisesti, * p 0,05) verrattuna normaaleihin soluihin ja merkki negatiivinen bulk kasvainsolujen (jopa 3-kertaiseksi, p 0,05, kuvio 5A).

. CD44

+ /CD24

+ /ESA

+ solut eristettiin käyttäen virtaussytometriaa haiman syöpäsoluissa, kuten aiemmin on kuvattu [34]. Kokonais-RNA eristettiin ja mRNA kvantitoitiin q- RT-PCR normaalissa haima-, bulk CD44

– /CD24

– /ESA- haimasyöpäsoluissa ja CD44

+ /CD24

+ /ESA

+ haiman syöpäsoluja. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM (* p 0,05, n = 3 itsenäisestä kokeesta, kussakin suoritettiin kolmena rinnakkaisena). B. Immunofluoresoivat värjäytymistä Bmi1 sisään tumorspheres muodostettu CD44

+ /CD24

+ /ESA

+ soluja. C. hiljentäminen Bmi1 estää kyky CD44

+ /CD24

+ /ESA

+ solujen muodostaa palloja jonka sarjanumero johtamisella. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM (* p 0,05, n = 3 itsenäisestä kokeesta, kussakin suoritettiin kolmena rinnakkaisena).

Lajittelu CSCS testattiin myös

in vitro

in tumorsphere määrityksissä jos Bmi1 osallistuu CSC uusimisen yhteydessä serial johtamisella. Expression of Bmi1 in tumorspheres arvioitiin kautta immunofluoresenssimikroskoopilla (kuvio 5B). Korkeita Bmi1 ilmentymisen nähtiin tumorspheres rikastettu syövän kantasoluja, jotka vastasivat havaittiin nousua Bmi1 mRNA: n ilmentymisen tasoja RT-PCR: llä. Sitten transduktoi tumorspheres kanssa Bmi1 shRNA sisältävien tai ohjaus lentivirus ja sarjoittain siirrostettiin pallojen. Ensimmäinen kulku pallo muodostumista ei merkitsevää eroa Bmi1 vaiennetaan CSCS ja lentiviraalinen tartunnan ehkäiseminen (34 ± 6 yksikköä /HPF vs. 30 ± 6 yksikköä /HPF, p = NS, kuvio 5C). Kuitenkin kun myöhempi johtamisella, Bmi1 vaiennetaan soluilla vähentämällä kykyä muodostaa uusia tumorspheres. Tällä passage kolme, Bmi1 vaiennetaan solut osoittivat noin 7-kertaisesti alentunut kykyä muodostaa uusia tumorspheres verrattuna villityypin kontrolleihin (34 ± 7 yksikköä /HPF vs. 6 ± 1 yksikköä /HPF, p 0,05, kuvio 5C) . Nämä kokeet sotkea Bmi1 säätelyssä haiman CSC uusimista.

Bmi1 hiljentämisen CSCS johtaa pienempiin kasvaimia ja laski CSCS itseuudistumisen in vivo

testaamiseksi in vivo merkitystä tumorsphere kokeiluja olemme istutettu yhtä paljon Bmi1 vaiennettu ja ohjaus lentiviraalinen transfektoidut CD44

+ CD24

+ ESA

+ CSCS johdetut ihmisen haimasyövän vierassiirrännäiset subcutaneum NOD /SCID-hiirten ja mitataan tuloksena kasvaimen kasvua. Bmi1 vaiennetaan kasvaimet olivat merkittävästi pienempiä kuin kontrollien tuumoreiden, kun analysoitiin 30 päivää istutuksen jälkeen (0,4 ± 0,2 cm

3 vs. 1,3 ± 0,2 cm

3, * p 0,05, kuvio 6A). Kun kasvaimet analysoitiin niiden CSC sisällön kautta virtaussytometrialla, Bmi1 vaiennetaan kasvaimia osoitti merkittävää vähenemistä CD44

+ CD24

+ ESA

+ CSC väestö verrattuna niiden ohjaus kollegansa (0,20 ± 0,04% vs. 1,2 ± 0,1%, * p = 0,0007, kuvio 6B). Tämä in vivo -tiedot, yhdessä in vitro tumorsphere tuloksia, tukee roolia Bmi1 ylläpidossa haiman CSC osastoon säätelemällä niiden itseuudistumisen.

. Hiljentäminen Bmi1 estää kasvaimen leviämisen. Edustava valokuva (ylhäällä) tuumoriksenograftien esitetty. Vasen – ohjaus kasvain, oikealle – Bmi1 vaiennetaan kasvain. Pylväsdiagrammi osoittaa kasvaimen eroa 28 päivää. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM (* p 0,05, n = 4 itsenäisestä kokeesta). B. vaiennettu Bmi1 vaikuttaa suoraan CSC numero tuumoriksenograftien. Edustavia virtaussytometrillä tontit (yläreuna) CD44

+ /CD24

+ /ESA

+ solumäärät ohjaus (vasemmalla) ja Bmi1 vaiennettu (oikealla) ksenografteissa 28 päivää. Pylväsdiagrammi (alhaalla) määrällisesti CSC numerot ksenografteissa 28 päivän kuluttua vaiennettu Bmi1. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM (* p = 0,0007, n = 4 itsenäisestä kokeesta).

Keskustelu

Tämä tutkimus antaa selkeitä todisteita kiinteä osallistuminen Bmi1 vuonna patogeneesissä haimasyöpä. Yliekspressio Bmi1 havaittiin yhdenmukaisesti haimasyövän kudoksissa verrattuna normaaliin valvontaa. Suurin osa ihmisen haimasyövän solulinjoissa havaittiin myös on suuri endogeeninen ilmentyminen Bmi1. Tärkeää on, Bmi1 yliekspressio havaittiin enemmistö (10/16) on esineoplastiset Panin vaurioita kohtalaista tai vaikeaa astetta epiteelin dysplasiaa. Nämä tiedot viittaavat siihen, että Bmi1 ilmaisu tapahtuu suhteellisen varhaisessa vaiheessa haiman syövän synnyn ja saatiin vahvistus aiemmin julkaistu havaintoja ihmisen ja hiiren haimasyövän mallit [28], [29], [30]. Huolimatta näistä tuloksista, toiminnallinen rooli Bmi1 ei ole aiemmin selvitetty ihmisen tai hiiren haimasyövän.

toiminnallisesti validoitu tärkeyden Bmi1 ilmentymisen haimasyövän avulla haimasyövän solulinjoissa ja ensisijainen ihmisen tuumoriksenografteja. Bmi1 yliekspressio MiaPaCa2 haimasyöpäsoluissa lisännyt leviämisen ja tehostettu hyökkäys in vitro Matrigel määrityksissä. Käänteisesti Bmi1 Knockdown in Pancin-1-soluissa esti niiden leviäminen. Nämä havainnot vahvistettiin lisäksi istutettavien NOD-SCID-hiirissä, joissa Bmi1 yli-ilmentymisen MiaPaCa2 soluissa johti lisääntynyt kasvaimen koon ja metastaattisen kyvyn solujen. Sitä vastoin, vaikka Panc-1-soluja oli yhtä siirteen toimiminen riippumatta Bmi1 tilan, tuumorit johtuvat Panc-1 soluja, joista puuttuu Bmi1 olivat merkittävästi pienempiä kuin valvonnan Panc-1-soluja. Lisääntynyt Bmi1 ilme on liittynyt lisääntynyt aggressiivisuus muihin syöpätyyppeihin [6], [10], [35], [36] ja korreloi kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden rintasyövässä [10], [13]. Meidän havainnot ihmisen haimasyövän solulinjoissa ja ensisijainen ihmisen ksenografteissa edelleen laajentaa näitä havaintoja ja sotkea Bmi1 indusoimisessa EMT ja lääkeresistensseihin säädeltyä haimasyövän kasvua ja aggressiivisuus.

Kasvain aloittamista tai syövän kantasoluja on eristetty ihmisen haimasyöpä [34]. Kuten normaalissa kantasoluja, Bmi1 ajatellaan olevan kriittinen osa koneen, joka ylläpitää itseuudistumisen in CSCS. Tämä on osoitettu olevan tapauksessa hematopoieettisen järjestelmän sekä rinta-, aivo-, ja eturauhasen [14], [17], [19], [20]. Tutkimuksessamme kun Bmi1 ilmentyminen hiljennettiin että CD44

+ CD24

+ ESA

+ haiman CSC väestöstä, sekä

in vitro

CSC leviämistä ja

in vivo

kasvaimen kasvu oli merkittävästi estynyt. Lisäksi merkittävä lasku määrä CSCS todettiin, kun Bmi1 vaiennetaan kasvaimet analysoitiin niiden CSC sisältöä. Nämä tiedot ensimmäisen kerran kokeellisesti sotkea Bmi1 tärkeänä säätelijänä haiman CSC huolto- ja haiman kasvain aloittamista. Edelleen tutkimus on käynnissä roolista Bmi1 monimutkainen sääntely transkription ohjelmat ohjaamalla uudistaminen ja kunnossapitoon kantasolujen tilassa. Bmi1 on liitetty varren solujen uusiutumista ja lisääntymistä monissa normaaleissa sekä syöpäkudokset lukien hematopoieesijärjestelmän, hermosto, rinta, eturauhanen, keuhkot, suoli, ja normaali haima. Kriittinen havainto, kun tarkastellaan Useimmissa näistä tutkimuksista, on se, että Bmi1 funktio on pääasiassa ollut mukana näissä elinjärjestelmissä käyttäen geneettisesti hiiren mallia. Käytettävissä on vain vähän tietoa, joka tutkii Bmi1 funktio ihmisen kudoksissa suoraan. Tutkimuksemme syytöksiä Bmi1 suorana säätelijänä haiman tumorigeneesin käyttämällä ensisijaista ihmisen potilaasta peräisin matalan passage ksenografteissa ja haiman solulinjoissa. Se täydentää havaintoja muiden tutkimusten ja edelleen sementit rooli Bmi1 keskeisenä säätelijänä syövän kantasoluja uudistamista, mikä vaikuttaa suoraan kasvaimen aloittamista ja kasvua in vivo. Se on ensimmäinen tutkimus sotkea Bmi1 suoraan haiman kasvainten synnyssä. On vaikeaa arvioida, kuinka Bmi1 ilmentymistä haimasyövän kantasoluja liittyy normaaliin haiman homeostaasin ainoana paperin käsitellään Bmi1 toiminto eikä vain ilmentymistä aikuisen haimassa keskittyy hiirimallissa eikä ihmisen haiman [27]. On huomattava, että kyseisessä paperi Bmi1 ei ilmentää soluissa, jotka ilmentävät normaalisti hyväksytty haiman progenitorimerkkiaineiden kuten Pdx-1, nestiinifenotyypin, ja Sox9, mutta oli sen sijaan läsnä mikä näytti olevan täysin eriytetty asinussolut. Siksi on vaikea spekuloida roolista Bmi1 normaalissa haima homeostaasin ihmisen, mutta työmme selvästi syytöksiä Bmi1 ihmisen haiman kasvaimien syntyyn.

taustalla molekyylitason mekanismeja Bmi1 funktion syöpä ei täysin ymmärretä. Bmi1 säätelee solusyklin etenemistä ainakin osittain transkription säätelyn INK4a lokuksen, joka sisältää p16Ink4a ja p14Arf (p16 ja P19 hiirillä) sykliiniriippuvaisen estäjät [4], [5]. INK4a lokus häiriintyy monissa haimasyöpä ja mutaatioiden tai vaiennettu p16 /p14 ilmentymistä on sekaantunut keskeisenä tapahtuma haimasyövän etenemisessä [37]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että poikkeava Bmi1 ilmentyminen ei välttämättä liittyä downregulation p16INK4A ilmaisun [38], [39], [40].