Krooninen sairaus

tiivistelmä

Proteasomi on keskeinen säätelijä solun homeostaasin ja on kliinisesti validoitu syövän vastaisen tavoite. Immunoproteasome, alatyyppi proteasomin ilmaistu pääasiassa hematopoieettisten solujen, alun perin kirjattu sen roolista antigeeniesittelyn immuunivasteen aikana. Viime aikoina immunoproteasome on ollut mukana useissa tautitiloissa kuten syöpä ja autoimmuunisairaudet, mutta monet tekijät nämä patologisten prosessien eivät ole tiedossa. Erityisesti kodonin 60 polymorfismin

PSMB9

koodaavan geenin β1i immunoproteasome katalyyttinen alayksikkö on tutkittu yhteydessä erilaisia ​​sairauksia. Tästä huolimatta aiemmat tutkimukset ovat tähän mennessä raportoitu epäjohdonmukainen toteamuksia vaikutuksista tämän polymorfismin vaikutus proteasomiaktiivisuus. Niinpä ryhdyimme tutkimaan vaikutusta

PSMB9

kodonissa 60 polymorfia ilmenemistä ja aktiivisuutta β1i immunoproteasome alayksikköä paneelissa ihmisen syöpäsolujen linjat. Β1i-selektiivinen fluorogeenisen substraatin asetyyli-Pro-Ala-Leu-7-amino-4-metyylikumariini käytettiin mittaamiseksi spesifisesti β1i katalyyttinen aktiivisuus. Tuloksemme osoittavat, että kodoni 60 Arg /His polymorfismi ei merkittävästi muuta ilmaisua ja toimintaa β1i joukossa testatuissa solulinjoissa. Lisäksi tutkimme myös ilmentymisen β1i kliinisissä näytteissä paksusuolen ja haiman syöpäpotilailla. Meidän immunohistokemiallinen analyysit osoittivat, että -70% kliinisistä paksusuolensyöpä näytteitä ja ~53% haimasyövän näytteet on havaittavissa β1i ilme. Yhdessä tuloksemme osoittavat, että β1i alayksikköä immunoproteasome usein ilmaistaan ​​paksusuolen ja haiman syöpiä mutta kodonin 60 geneettisiä variantteja β1i esiintyä vastaavia katalyyttinen toiminta ja todennäköisesti edistää merkittävää solujen välisen-line ja kansainvälisten yksittäisiä variabilities että immunoproteasome toimintaan.

Citation: Park JE, Ao L, Miller Z, Kim K, Wu Y, Jang ER, et al. (2013)

PSMB9

Kodonissa 60 polymorfismit eivät vaikuta aktiivisuuteen Immunoproteasome katalyyttinen alayksikkö b1 i Ilmaistuna erilaatuisia Solid Cancer. PLoS ONE 8 (9): e73732. doi: 10,1371 /journal.pone.0073732

Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 10, 2013; Hyväksytty: 20 heinäkuu 2013; Julkaistu: 09 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Park et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Cancer Institute apurahat, R15CA156601 ja R01CA128903 ja Kentucky Lung Cancer Research Program. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

proteasomi vastaa hajoamista kohdennettuja proteiineja ja on keskeinen toimija ylläpito solun homeostaasin ja säätelyyn solujen prosesseja, jotka ovat välttämättömiä syövän kehittymisessä ja etenemisessä [1], [2]. Immunoproteasome, vaihtoehtoinen muoto proteasomin, löytyy hematopoieettista alkuperää olevien solujen, mutta sen ilmentymistä voidaan myös indusoida mukaisesti tulehdus- ja stressiolosuhteissa muissa solutyypeissä [3]. Immunoproteasome muodostuu, kun kolmenlaisia ​​katalyyttisen alayksikön löytyy konstitutiivisen proteasomin, β1 (Y,

PSMB6

), β2 (Z,

PSMB7

) ja β5 (X,

PSMB5

), korvataan kolmella homologisella immuno-alayksiköt: β1i (lmp2,

PSMB9

), β2i (MECL-1,

PSMB10

) ja β5i (LMP7,

PSMB8

). Verrattuna konstitutiivisen proteasomin, The immunoproteasome on todettu hieman muuttunut proteolyyttinen erityispiirteet, jotka pystyvät tuottamaan peptidien sopii paremmin sitoutumaan major histocompatibility complex I molekyylien mikä helpottaa antigeenin esittelyä [4]. Kuitenkin viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että immunoproteasome voi olla tärkeitä tehtäviä kuin adaptiivisen immuunivasteen. Esimerkiksi immunoproteasome havaitaan ilmaistaan ​​ei-tulehtuneeseen, immuuni-previleged kudoksissa (esim verkkokalvo ja aivot [5], [6]) ja yhteydessä useiden sairaustilojen (esimerkiksi syöpä, hermostoa rappeuttavien sairauksien, autoimmuunisairauksien, [3], [7] ja viitteet). Vaikka näiden havaintojen biologinen merkitys immunoproteasome tällaisissa tautitiloissa ei ole täysin ymmärretty.

β1i alayksikköä immunoproteasome koodaa

PSMB9

geeni sijaitsee kromosomissa 6. Tämä geeni satamiin yleisesti esiintyvä geneettinen R /H-polymorfismi kodonissa 60 (p.60R H; c.179G A; rs17587), jossa H-alleeli taajuuksilla 1,1%: sta 34%, vaihdellen yli etnisten ryhmien ([8], ja siinä olevat viitteet) . Useissa tutkimuksissa on raportoitu mahdollisia assosiaatioita kodonin 60

PSMB9

polymorfismi tilan ja lisääntynyt alttius eri sairauksien, kuten insuliinista riippuvainen diabetes mellitus, nivelreuma ja multippeliskleroosi [8] – [16]. On kuitenkin vaikea tulkita aikaisemmista tutkimuksista, onko havaittu yhdistysten liittyvät suoraan muuttuneen toiminnan β1i alayksikön seurauksena R /H aminohappovariaation. Tämä johtuu osittain toisistaan ​​riippuvaisilla luonne proteasomin alayksiköiden ja puute sopiva molekyylinäytteitä. Aiemman tutkimuksen Mishto et al. [17] tarkasteltiin lähemmin vaikutusta tämän polymorfismin vaikutus proteasomiaktiivisuus vuotiaiden aivojen käyttäen fluorogeenistä peptidisubstraattia N-sukkinyyli-Leu- Leu-Val-Tyr-AMC (Suc-LLVY-AMC). Tulokset Tämän tutkimuksen ehdotti, että H alleeli johtaa vähentynyt proteasomiaktiivisuus vuotiaiden aivojen [17]. Kuitenkin, koska Suc-LLVY-AMC tavanomaisesti käytetään mittaamaan yleisen kymotrypsiininkaltainen (CT-l) proteolyyttinen aktiivisuus proteasomin ja siten voidaan hydrolysoida useiden alayksiköiden sekä immunoproteasome ja konstitutiivisen proteasomin, tämä lasku hydrolyysissä Suc-LLVY-AMC eivät välttämättä ilmoittaa muutoksista β1i toiminto. Lisäksi myöhemmässä tutkimuksessa sama ryhmä yhdistelmä-peptidejä jäljitteleviä endogeenisia substraatteja ei osoittanut eroja alustaan ​​hydrolyysi profiilien välillä kodonin 60 genotyypit [18].

Suuri osa ristiriita koskien toiminnallista vaikutusta PSMB9 kodonin 60 polymorfia syntyy puute työkalu erityisesti tarkkailla funktio β1i alayksikön. Tässä suhteessa, Lin et ai. [19] ja Blackburn et al. [20] raportoi hiljattain kehittämistä ja soveltamista fluorogeenisen substraatin asetyyli-Pro-Ala-Leu-7-amino-4-metyylikumariini (Ac-PAL-AMC), joka hydrolysoidaan selektiivisesti β1i. Tämä uusi työkalu on tehnyt mahdolliseksi arvioida välitön toiminnallinen vaikutus

PSMB9

kodonissa 60 polymorfia on β1i alayksikköön. Nykyisissä tutkimuksessa tutkimme ilmentymistä β1i kliinisissä paksusuolen ja haiman syövän kudoksissa sekä vakiintunut ihmisen syöpäsolulinjoissa. Käyttämällä β1i-selektiivinen fluorogeenisen substraatin Ac-PAL-AMC, me arvioi myös katalyyttisen aktiivisuuden β1i useita syöpäsolulinjoissa kuljettaa eri genotyyppiä kodonissa 60. Tuloksemme osoittivat, että β1i usein ilmaistaan ​​paksusuolen ja haiman syövät, mutta kodoni 60

PSMB9

polymorfismi ei ole merkittävää vaikutusta katalyyttisen aktiivisuuden β1i ilmaistuna erilaatuisia syöpäsolulinjoja.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja reagenssit

Pysyvät solulinjat, jotka ovat peräisin eri ihmisen syöpiä (paksusuolen, HCT-8, DLD-1, HCT-116, SW480, keuhko-, H23, H358, H460, H727, H1299, eturauhasen, PC-3, DU145, haima, BxPC-3, PANC-1, AsPC1, rinta, MCF-7, Hs578T, MDA-MB-231) hankittiin American Type Culture Collection (ATCC) ja pidetään suositeltavat. Fluorogeenisen substraatit Suc-LLVY-AMC ja Ac-PAL-AMC oli yksilölliseen syntetisoitiin seuraamalla standardin peptidisynteesin strategiaa. Proteasomiestäjät UK-101 ja epoxomicin syntetisoitiin ja puhdistettiin kuten on raportoitu aiemmin [21], [22]. Puhdistettu 20 S konstitutiiviset proteasomin ja immunoproteasome ostettiin Boston Biochem.

immunohistokemiallinen analyysi

kudossiruina sisältävä irrotettava tunnistettu, arkistointi tapauksia ihmisen paksusuolen ja haimasyövän kudosnäytteet saatiin Yhdysvaltain Biomax. Käyttö de-tunnistaa kudoksen array näytteitä kaupallisesta lähteestä nykyisen tutkimuksen katsottiin vapautetaan Human Subject asetuksen Institutional Review Board. Streptavidiini-biotiini-immunoperoksidaasitesti koe suoritettiin sen jälkeen, kun antigeeni hakuproseduuri (sitraattipuskuria, pH 6) käyttäen monoklonaalinen vasta-aine β1i (1:100 laimennus, Enzo Life Sciences) mukaan aiemmin raportoitu protokollaa [23]. Immuuni reaktio visualisoitiin käyttämällä 3,3′-diaminobentsidiiniä (DAB), ja tumat vastavärjättiin hematoksyliinillä. Spesifisyys immunoreaktiivisen signaaleja varmistettiin jättämällä joko ensisijainen tai toissijainen vasta-aine. Immunovärjättiin kudos microarray osat analysoitiin kokenut patologi (Dr. Eun Y. Lee). Intensiteetti immunovärjäyksellä annettiin asteikolla 0-2 tai 3

määritys

PSMB9

Polymorphic Status kodonissa 60

PSMB9

genotyypit kodonissa 60 alun perin määritettiin käyttäen standardeja PCR-menetelmillä ja DNA entsymaattista pilkkomista varten kuten aiemmin raportoitu [24]. Amplikoni, joka kattaa koko avoin lukukehys kloonattiin sen jälkeen ja analysoitiin suoralla sekvensoinnilla sen varmistamiseksi, että solulinjat eivät sisällä geneettisiä vaihteluita PSMB9 geenin.

Immunoblottaus analyysi

Kun vastaava summa kudosten tai solujen uutteet ratkaistu polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin PVDF-kalvoille. Membraanit blokattiin kuoritun maidon 5% ja tutkittiin anti-β1i (1:1000, Abcam) ja anti-β-aktiini (1:1000, Novus) vasta-aineita. Pesun jälkeen blotteja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineita. Sitoutuneet vasta-aineet detektoitiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssin alustan (Pierce Biotechnology). Jotta vertailla suhteellisen ekspressiotasot β1i jakamiseen useiden solulinjojen, laimennettiin sarjassa H23 solu-uutteita käytettiin Kalibrointistandardeihin ja bändi intensiteetit kvantitoidaan densitometrisesti käyttämällä Määrä Yksi ohjelmisto (Bio-Rad).

Proteasome aktiviteetti Analyysit

katalyyttinen aktiivisuus β1i määritettiin seuraamalla hydrolyysinopeus fluoresoivan 7-amino-4-methylcoumarine (AMC) Ac-PAL-AMC [20]. Lyhyesti, puhdistettiin proteasomaalisten valmisteet tai solu-uutteet, jotka sisältävät yhtä kokonaisproteiinin määrä (10 ug) lisättiin 96-kuoppalevyille, ja säädettiin lopulliseen tilavuuteen 50 ui käyttäen määrityspuskurissa (20 mM Tris /Cl, 0,5 mM EDTA, pH 8,0). Reaktio aloitettiin lisäämällä Ac-PAL-AMC (100 uM) ja fluoresenssi vapautuneen AMC seurattiin 90 minuutin ajan käyttäen SpectraMax M5 levylukijaa (Molecular Devices, eksitaatio 360 nm ja emissio 460 nm). Sen varmistamiseksi, että substraatti hydrolyysi välittyy β1i, lisäksi sarjaa solu- uutteita tai puhdistettuja proteasomaalisten valmisteet esikäsitelty proteasomiestäjät UK101 tai epoxomicin 1 h, jonka jälkeen fluoresoivat signaalit seurattiin. Erillisissä kokeissa hydrolyysi Suc-LLVY-AMC (100 uM) seurattiin kokonaisriskitason CT-L proteolyyttistä aktiivisuutta.

Tilastollinen analyysi

Arvot datasta ilmaistiin tarkoittaa kanssa standardipoikkeamat. Vertailu ryhmien välillä suoritettiin käyttäen Studentin

t

-testin ja p 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Usein ilmentäminen β1i Colon ja Haimasyöpä kudokset

arvioidessaan ilmaus β1i paksusuolen syöpä, ensin hyödyntää neljä paria paksusuolen syövän ja pahanlaatuisten viereisten paksusuolen kudokset vastaavia luovuttajia. Meidän immunoblottauksella analyysit osoittivat, että β1i tasot olivat erittäin kohonnut kaikissa neljässä kliinisessä paksusuolensyöpä kudoksiin verrattuna pariksi ei-pahanlaatuisten koolonin kudoksissa (kuvio 1A). Arvioida tarkemmin taajuutta β1i ilmaisun paksusuolensyöpä, suoritimme immunohistokemiallinen analyysit kasvaimen array, joka sisältää 153 arvioitavissa paksusuolensyöpä yksilöitä kaikkien kliinisten vaiheissa. Intensiteetti β1i värjäytymisen arvioitiin asteikolla 0-3 ja tuloksemme osoittivat, että suurin osa (noin 70%, n = 107 joukosta 153 yhteensä yksilöt) paksusuolisyövän kudosten olivat positiivisia (värjäytymisintensiteettiä ≥1) varten β1i värjäytymistä (kuvio 1 B). Samanlaisia ​​analyysit suoritettiin käyttäen kasvaimen array, joka sisältää 43 arvioitavissa haimasyöpä yksilöitä kaikkien kliinisten vaiheissa. Rajallisen otoksen koko, intensiteetti β1i värjäytymisen arvioitiin asteikolla 0-2 ja tuloksemme osoittivat, että noin 53% (n = 23 ulos 43 yhteensä yksilöt) haimasyövän kudosten oli positiivinen (värjäytymisintensiteettiä ≥ 1) β1i värjäytymistä (kuvio 1C). Sekä kudosmatriisien, arvioimme onko assosiaatio β1i ilmaisun ja käytettävissä ennusteeseen viittaavia tekijöitä (esim. Sukupuolen ja kasvaimen). Kuitenkin tulokset eivät paljasta mitään ilmeisiä yhdistysten.

(a) Immunoblottausmääritys analyysi β1i käyttäen proteiinilysaattien valmistettu pahanlaatuisissa (N) ja syöpä (T) paksusuolessa kudoksiin samasta luovuttajien (n = 4 paria) . β-aktiini käytettiin latauskontrollina. Bändi intensiteetit β1i ja β-aktiini oli densitometrisesti analysoitu ja käyttää saamaan suhteellisen β1i ilmaus normalisoida p-aktiini tasot. (B) immunohistokemiallinen värjäys β1i käyttäen kasvain array, joka sisältää 153 arvioitavissa kasvain paksusuolen kudosnäytteet. Intensiteetit β1i positiivista värjäytymistä arvioitiin asteikolla 0 3 Noin 70% (46 yksilöt oli intensiteetti asteen 1, 38 arvosanalla 2 ja 8 arvosanalla 3, pois 153 koko kasvain yksilöt) peräsuolen kudoksiin on positiivinen (värjäytymisintensiteettiä ≥1) β1i värjäystä. (C) immunohistokemiallinen värjäys β1i käyttäen kasvain array, joka sisältää 43 arvioitavissa kasvain haiman kudosnäytteet. Intensiteetit β1i positiivista värjäytymistä arvioitiin asteikolla 0 2. Noin 53% (9 yksilöt intensiteetillä luokan 1 ja 14 arvosanalla 2, ulos 43 koko kasvain yksilöt) haimasyövän kudosten oli ≥1 β1i värjäytymisen intensiteetti .

katalyyttinen aktiivisuus β1i on Panel of Human Cancer Cell Lines kantavat eri Kodonissa 60 polymorfisia variantteja

Aiemmin Blackburn et al. [20] on raportoitu, että Ac-PAL-AMC (kuvio 2A) voidaan käyttää valikoivasti mittapäätä katalyyttistä aktiivisuutta β1i. Ennen käyttöä Ac-PAL-AMC Tutkimuksessamme olemme edelleen vahvisti, että hydrolyysi Ac-PAL-AMC: tä selektiivisesti välittämä β1i käyttämällä puhdistettuja immunoproteasome ja konstitutiivisen proteasomin. Todellakin, Ac-PAL-AMC: tä helposti hydrolysoitiin immunoproteasome, mutta ei konstitutiivinen proteasomin (kuvio 2B). Esikäsittely UK101, joka on β1i-selektiivinen proteasomin inhibiittoria [21], estivät täysin Ac-PAL-AMC hydrolyysiä edelleen validointi Ac-PAL-AMC: tä β1i-selecitve koetin (kuvio 2B). Vastaavasti, noin 90% hydrolyysin Ac-PAL-AMC estyi Panc-1 solu-uutteiden UK-101 esikäsittelyn (kuvio 2C). Sen sijaan, hydrolyysi Suc-LLVY-AMC: tä vain osittain estetty UK101 esikäsittelyä Panc-1 uutteita, viittaa siihen, että Suc-LLVY-AMC hydrolysoidaan proteasomin alayksiköstä muu kuin β1i (eli β5 tai β5i) (kuvio 2C).

(a) kemiallinen rakenne Ac-PAL-AMC. (B) Ac-PAL-AMC hydrolyysin ajan puhdistettu konstitutiivisen proteasomin (cross), puhdistettua immunoproteasome (suljettu ympyrä), tai puhdistettuja immunoproteasome esikäsitelty UK101 (avoin neliö). Lineaarinen kasvu nähtiin immunoproteasome sisältäviä kaivoja vain. (C) hydrolyysinopeus Ac-PAL-AMC tai Suc-LLVY-AMC: n läsnä ollessa Panc-1 solu-uutetta (10 ug). Hydrolyysi Ac-PAL-AMC: tä lähes täydellisesti inhiboi UK101 esikäsittelyn (10 uM). Hydrolyysi Suc-LLVY-AMC osittain inhiboitui UK-101 esikäsittelyä. Epoxomicin (EPX, 10 uM), laaja-toimiva proteasomin inhibiittoria, käytettiin positiivisena kontrollina.

jälkeen validointi Ac-PAL-AMC: tä β1i-selektiivinen koetin, me sitten arvioidaan β1i aktiivisuuden paneelissa ihmisen syöpäsolulinjoja. Nämä solulinjat seulottiin niiden

PSMB9

genotyypit kodonissa 60 (n = 6 niille kuljettavien HH tai HR genotyypin; n = 11 niille kuljettavien RR genotyyppi) ja tarkasti eikä mitään ylimääräisiä vaihteluita

PSMB9

geenin suoralla sekvensoinnilla (taulukko S1). Tuloksemme osoittivat, että katalyyttinen toiminta β1i arvioi hydrolyysivakion Ac-PAL-AMC merkittävästi vaihtelevat näiden solulinjojen, mutta nämä erot eivät näytä liittyvän kodonin 60 polymorfisen aseman (kuva 3).

(a) katalyyttinen aktiivisuus β1i mitattuna hydrolyysinopeus Ac-PAL-AMC ihmisen syöpäsolujen linjat H /H tai R /H-genotyyppi (tyhjä palkit) ja R /R-genotyyppi (täydet pylväät). Muuttuvat vaikutus havaittiin keskuudessa solulinjoissa. (B) Valuuttakurssi Ac-PAL-AMC hydrolyysi solulinjoissa H /H tai R /H-genotyyppi (avoimet ympyrät) tai R /R-genotyyppi (umpinaiset neliöt). Hydrolyysinopeus eivät osoittaneet mitään tilastollisesti merkitsevää eroa H + ja H- solulinjat.

β1i Expression in Human Cancer Cell Lines, joilla on erilaiset kodo- 60 polymorfisia variantteja

Seuraavassa vaiheessa , tutkimme onko β1i ilmaisun tasoihin vaikuttaa kodoni 60 Monimuotoinen asema testattu syöpäsolun linjat. Jotta määrällisesti β1i proteiinin tasoja, mikä näyttää vaihtelee huomattavasti eri solulinjoissa, käytimme laimennettiin sarjassa H23 solu-uutteet kalibrointi standardien (kuvio 4). Vertailu solulinjojen kanssa H-alleelin niille, jotka ei ole H-alleeli ei osoittanut tilastollisesti merkittäviä eroja β1i ilmentyminen (kuvio 5A). Sen sijaan löysimme erittäin merkittävä korrelaatio katalyyttinen aktiivisuus β1i ja sen ekspressiotason (kuvio 5B, r

2 = 0,86, p 0,0001, yksittäiset arvot sisältyvät taulukkoon S1). Nämä havainnot ehdottivat, että erilaiset ekspressiotasot β1i todennäköisesti huomioon, että suurin osa erot olivat β1i aktiivisuus eri solulinjoja.

Kun vastaava summa (10 ug) solu-uutteita alistettiin immunoblottaus vasta-aineen jotta β1i yhdessä sarjalaimennetun H23 solu-uutteita (kalibrointistandardit). Densitomet- analyysit kaistaintensiteettejä tehtiin määrällisesti suhteellisen ekspressiotasoja β1i. Solulinjat ilmentymisen korkeita β1i on esitetty (A), ja solulinjat, joilla on alhainen ilmentyminen β1i on esitetty (B).

(a) β1i ilmentyminen solulinjoissa H /H tai R /H (avoin ympyrä) ja R /R genotyyppien (suljettu neliö). β1i ilmaus ei osoittanut tilastollisesti merkitsevää eroa H + ja H- solulinjoissa. (B) Korrelaatio Ac-PAL-AMC hydrolyysi β1i ilme kaikissa testatuissa solulinjoissa. Yksi merkittävä korrelaatio todettiin välillä ekspressiotasot β1i ja sen katalyyttinen aktiivisuus (R

2 = 0,86, p 0,0001).

Keskustelu

Meidän nykyisessä tutkimuksessa olemme tutkineet vaikutusta

PSMB9

kodoni 60 polymorfismien on β1i alayksikköä immunoproteasome ilmaistu useita syöpäsolulinjoissa käyttämällä raportoi äskettäin β1i aktiivisuus koetin, Ac-PAL-AMC. Tuloksemme osoittivat, että kodoni 60 polymorfismi ei ole suurta vaikutusta ekspressiotasoja tai katalyyttistä toimintaa β1i paneelissa ihmisen syövän solulinjoista testataan. Nämä tulokset eroavat aikaisempia havaintoja, joka osoitti, että aivokudoksen ikäisten kuljettaa kodonin 60 H alleeli oli laskenut proteasomiaktiivisuus verrattuna kudokseen niiltä, ​​jotka eivät kanna kodoni 60 H alleeli [17]. Mahdollinen syy näihin ilmeisiä eroavaisuuksia voi liittyä erilaisia ​​alustoja käytetään arvioitaessa proteolyyttistä aktiivisuutta. Fluorogeenisen substraatin Suc-LLVY-AMC käyttää Mishto et al. [17] käytetään yleisesti mittaamaan yleisen kymotrypsiinin kaltainen aktiivisuus proteasomin. Kuitenkin, koska tämä substraatti voidaan hydrolysoida sekä immunoproteasome (β1i ja β5i) ja konstitutiivinen proteasomin (β5) [25], käyttäen saadut tulokset Suc-LLVY-AMC voi harjata pois suoraan panos β1i geneettistä polymorfismia. Nykyinen tulokset saatiin käyttämällä raportoi äskettäin substraatin Ac-PAL-AMC, joka on selektiivisesti lohkaistaan ​​β1i alayksikön (kuvio 2) [20]. Meidän havainnot ovat sopusoinnussa edellisen raportin, että

PSMB9

kodonin 60 polymorfismin ollut vaikutusta hajoamiseen profiilit 28-meerinen peptidi (Kloe 258) ja rekombinantti IkBα keskeinen säätelijä klassisen NF -κB polku ja tunnettujen proteasomin alustan [18]. Vaikka emme voi täysin sulkea pois mahdollisuutta, että vaikutukset kodonin 60 polymorfismi voi vaihdella alustan ja sairauksissa, tulokset nykyisestä tutkimuksen ja toiset taas näkevät kodonin 60 polymorfismi ei todennäköisesti osaltaan yksilöiden välistä vaihtelua β1i katalyyttinen aktiivisuus tasot.

kun merkittävä kliininen onnistumisia bortetsomibin ja carfilzomib hoidettaessa multippelin myelooman ja muiden hematologisten maligniteettien, proteasomin on nyt tunnustettu tärkeäksi kemoterapia-kohde. Kuitenkin toivottuja toksisuuksia rajoittaa laajaa käyttöä tällä hetkellä saatavilla proteasomin kohdistaminen huumeita. Voittamiseksi Näistä rajoituksista immunoproteasome, vaihtoehtoinen konstitutiivisen proteasomin, on tutkittava vaihtoehto terapeuttinen kohde. Tällaiset ponnistelut ovat tuottaneet lupaavia immunoproteasome kohdistamisen yhdisteet syövän vastaisen tehon ja parantaa toksisuusprofiilit [7], [23], [26], [27]. Tutkimaan immunoproteasome-kohdentamismenetelmiä syöpähoitoa varten, on tärkeää ottaa huomioon immunoproteasome ilmaisun eri syöpätyyppejä. Vaikka immunoproteasome tiedetään voimistuvan hematologisissa pahanlaatuisissa ekspressiota immunoproteasome kiinteässä syöpä ei ole tutkittu perusteellisesti. Nykyisessä tutkimuksessa raportoimme, että β1i alayksikkö ilmennetään usein kliinisissä kudosnäytteiden paksusuolen ja haiman syövät sekä paneelin ihmisen syövän solulinjat, jotka ovat peräisin paksusuoli-, keuhko-, eturauhas- ja rintasyövän kudoksissa. Vaikka samanlaisia ​​havaintoja on raportoitu ryhmämme ym [21], [23], [28], [29], nykyinen tutkimus tarjoaa vakaampi tietoja ilmaus β1i useimmissa kliinisen paksusuolen ja haimasyöpä testatuissa kudoksissa . On huomattava, että downregulation immunoproteasome alayksiköitä on myös raportoitu joidenkin syöpien [30] – [34], ja on mahdollista, että ilmaisu asema immunoproteasome voi riippua taudin tyypit ja niiden patogeeniset mekanismit. Toisaalta, on huomattava, että tuloksia taajuudet β1i polymorfismien syöpäsolulinjojen peräisin eri elimiä ei ole välttämättä heijastava näistä näistä syövän tyypit. Tämä johtuu osittain pienen otoksen koosta ja koesuunnitelma nykyiseen tutkimuksen. Erityisesti kokeellinen suunnittelu mukana lukuun useiden solulinjojen kätkeminen lisäksi polymorfismit geeneissä, jotka koodaavat β1i ja /tai muiden immunoproteasome alayksiköiden kuten β5i minimoimiseksi mahdollisten pahentaa tekijöitä. Tuloksemme viittaavat siihen, että kodoni 60 polymorfismien eivät todennäköisesti vastaa havaitusta vaihtelua β1i ilmaisun /harjoittaneiden testatuilla solulinjoilla. Edelleen validointi havaintomme, voi olla tärkeää käyttää suurempi näyte koko syöpäsolulinjojen tai kliinisissä näytteissä, jotka ovat peräisin saman elimet, ehkä vertailu näytteiden vertailukelpoisia β1i ekspressiotasoja. Lisäksi geneettiset yhdistys tutkimukset, joissa tutkitaan β1i polymorfismin kodonissa 60 yhteydessä syövän kehittymisen ja etenemisen myös perusteltua.

Lopuksi todettakoon, että tulokset osoittavat, että β1i alayksikköä immunoproteasome ilmennetään usein paksusuolen ja haiman syöpien ja mahdollisesti muun tyyppisiä kiinteitä syöpiä. Lisäksi geneettistä vaihtelua kodonissa 60 ei näytä olevan merkittävää vaikutusta ilmaisun ja katalyyttinen aktiivisuus β1i syöpäsoluissa. Yhdessä nämä havainnot voivat tarjota hyödyllistä tietoa kehittämisen immunoproteasome kohdistaminen syöpälääkkeet. Lisäksi nämä tulokset sulje pois kodonissa 60 polymorfinen aseman mahdollisena tekijä vaihteleva herkkyys immunoproteasome estäjien kohdistamista β1i.

tukeminen Information

Taulukko S1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0073732.s001

(DOCX) B