PLoS ONE: HSP90 esto Parantaa mitoosia lääkkeen aiheuttamista Mitoottista pidätys ja solukuolema prekliinisissä malleissa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä

tiivistelmä

HSP90 estäjiä parhaillaan kliininen arviointi yhdistettynä antimitoottisella lääkkeitä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), mutta vähän tiedetään cellular vaikutuksista tämän uuden lääkkeen yhdistelmä. Siksi tutkimme molekyylitason vaikutusmekanismi IPI-504 (retaspimycin HCl), joka on voimakas ja selektiivinen HSP90, yhdessä mikrotubulusten kohdistaminen (MTA) doketakseli, kokeellisissa malleissa NSCLC. Olemme tunnistaneet osajoukko NSCLC solulinjojen, joissa näitä lääkkeitä toimivat synergisesti parantaa solukuolemaa. Ksenograftimalleja NSCLC osoitti kasvaimen kasvun inhibitiota, ja joissakin tapauksissa, regressio vastauksena yhdistelmähoitoon. Hoito IPI-504 tehosti antimitoottisia vaikutuksia dosetakselin johtavat siihen olettamukseen, että mitoosi tarkistuspisteen tarvitaan vastaus lääkeyhdistelmä. Tätä hypoteesia tukevat ohittaen Checkpoint Aurora estäjäksi vähentynyt solukuolemaa synergiaa IPI-504 ja doketakselin. Tutkitaan molekyyliperustan synergiaa, puolueeton stabiili isotooppi merkintöjä aminohappojen soluviljelmissä (SILAC) proteomic lähestymistapaa käytettiin. Useita mitoosi sääntelyviranomaisten, mukaan lukien osat ubikitiinipromoottori ligaasilla, Anaphase edistää kompleksi (APC /C), varta alassäädetty vastauksena yhdistelmähoitoon. Menetys APC /C RNAi herkistyneet solut dosetakselille ja tehosti antimitoottisia vaikutuksia. Hoito PLK1 estäjän (BI2536) myös herkistyneet solut IPI-504, mikä osoittaa, että yhdistelmä vaikutukset voivat olla laajalti sovellettavissa muihin luokkiin mitoosin estäjiä. Tuloksemme antavat prekliinisissä perustelut testaamiseksi yhdistelmä IPI-504 ja Doketakselin NSCLC.

Citation: O’Connell BC, O’Callaghan K, Tillotson B, Douglas M, Hafeez N, West KA, et al. (2014) HSP90 esto Parantaa mitoosia lääkkeen aiheuttamista Mitoottista pidätys ja solukuolema prekliinisissä malleissa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 9 (12): e115228. doi: 10,1371 /journal.pone.0115228

Editor: Andrei L. Gartel, University of Illinois at Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 23 heinäkuu 2014; Hyväksytty: 20 marraskuu 2014; Julkaistu: 26 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 O’Connell et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

Kilpailevat edut: Tekijät haluavat edelleen tehdä selväksi, että tällä aika työ tehtiin kirjoittajat olivat työntekijät ja osakkeenomistajat Infinity Pharmaceuticals, Inc. Tämä ei muuta niiden noudattamista PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

mitoosi, tai kehräkokoonpanon tarkastuspiste auttaa ylläpitämään genomista eheys estämällä missegregation kromosomien. Erittäin organisoidusta valvontajärjestelmä muodostuu useista proteiineista havaitsee irrallinen Kinetokori tai puutteellisesta jännityksen poikki sukkularihmaston, liipaisu niin sanottu ”Checkpoint vastaus”, joka johtaa mitoottisiin pidätykseen. Normaali solunjakautumisen edellyttää onnistunutta läpikulun mitoosi tarkastuspiste. Täyttämättä jättämisestä tarkistuspisteen vaatimusten suhteellisen lyhyessä ajassa (1-2 päivää) voi johtaa aneuploidian, mitoosi katastrofin tai mitoosi liukumista seuraa erilaisia ​​solukohtaloina kuten solukuoleman, vanhenemista, tai endoreduplikaatio [1]. Vaikka mekanismeja, joilla pitkäaikainen mitoosia johtaa solukuolemaan ovat epäselviä, rooli, anti-apoptoottisten BCL2 perheenjäsenten on raportoitu [2]. Pitkäaikaisessa mitoosi pidätys, sykliini-sykliiniriippuvaiset kinaasi (CDK) proteiinien fosfory-

BCL2

perheenjäsenet mukaan lukien BCL2, BCL-XL, ja MCL1. Fosforylaatiota BCL2 ja BCL-XL johtaa vapauttaa proapoptoottisten proteiinien BAX /BAK; kun taas fosforylaatiota MCL1 luo tunnistuskohta E3-ligaasi, APC /CDC20, kohdistaminen sitä proteasomaalisten hajoamista. Toiminnallinen redundanssi voi olla olemassa yksi

BCL2

perheenjäsenet välittämisessä solukuoleman vastausta pitkäaikainen mitoosin.

mitoosia lääkkeitä, jotka kohdistuvat mikrotubulusdynamiikan (MTA) käytetään laajalti klinikalla hoitoon laajan syöpiä. Näitä ovat mikrotubuluksia stabiloivia aineita, (taksaanit, kuten doketakseli ja paklitakseli, ja epotilonien) ja mikrotubulusten epävakautta aineet (mukaan lukien vinka-alkaloidit, kuten vinkristiini ja vinblastiini) [3]. Lisäksi, Maytansines (DM1, DM4) ja Auristatins (MMAE, MMAF) vuorovaikutuksessa vinka-sitoutumiskohdan tubuliinia ja niitä käytetään yleisesti, kun toksiini on kiinnitetty vasta-aineeseen lääkkeen konjugaattien [4]. Jakamisen aikana kasvainsolut ovat alttiita MTA, muut mikrotubulusten riippuvaisten solujen prosessit, kuten rakkula kaupan, hermosolujen liikenne, ja solun tukirangan eheys myös häiriintyy, mikä johtaa ei-toivottuja sivuvaikutuksia kuten neurotoksisuutta ja myelooinen myrkyllisyys [5]. Pyrkiessään voittamaan nämä sivuvaikutuksia, mitoosia lääkkeet, jotka kohdistuvat karamoottori proteiinit (KSP, Eg5) tai mitoosi kinaasien (PLK1, Aurora-kinaasin A, Aurora Kinase B) kehitetään, mutta ovat onnistuneet vain rajoitetusti tähän mennessä klinikalla [6]. HSP90 on molekyyli kaperoni, joka on vastuussa oikean laskostumisen lukuisia asiakkaan proteiinien, mukaan lukien monet onkogeenit ja mutatoitu tuumorisuppressoreita [7]. HSP90 estäjä IPI-504 on osoittanut antineoplastinen aktiivisuus useissa prekliinisissä syövän, joka tarjoaa perustelut sen kliinistä jatkokehitystä [7], [8], [9], [10], [11]. Mielenkiintoista, synergistinen aktiivisuus välillä HSP90 esto ja taksaanien on havaittu prekliinisissä malleissa NSCLC [12] ja HSP90 estäjien on arvioitu yhdistettynä doketakseliin kliinisissä tutkimuksissa NSCLC (NCT01646125, NCT01348126, NCT01798485, NCT01362400). Olemme tunnistaneet osajoukko NSCLC solulinjojen jossa IPI-504 ja doketakselin toimivat synergiaa parantaa solukuolemaa in vitro ja estää kasvaimen kasvua in vivo. Koska tarkkaa molekyylitason perustan tätä synergiaa ei ole määritetty, tutkimme molekyylitason vaikutusmekanismi (MOA) on IPI-504 yhdistettynä dosetakseliin ja muiden antimitotics. Tutkimuksemme paljasti MOA johon tarkastuspiste riippuvainen pidentyminen mitoosin. Lisäksi tunnistimme APC /C osia mahdollisina uusia HSP90 asiakas proteiineja, osittain vastuussa lääkesynergiaa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Tämä tutkimus suoritettiin vuonna suositusten mukaisesti oppaasta Care ja koe-eläinten käyttöä painetun National Research Council of National Academics. Protokolla hyväksyi Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) Infinity Pharmaceuticals, Inc. Eläimet tapettiin CO

2 hengitysteitse mukaan IACUC ohjeita. Jokainen pyritty minimoimaan eläinten kärsimyksiä.

Solulinjat

Ihmisen NSCLC solulinjat H292, A549, H522, H1993, H1793 saatu American Type Culture Collection ylläpidettiin useita kohtia alle 5% CO

2 37 ° C: ssa RPMI 1640-alusta täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (Sigma-Aldrich).

Eläinkokeet

Five kuuden viikon ikäisiä, koiraspuolisia NCR nu /nu kateenkorvattomia hiiriä hankittiin Taconic Farms. -ksenografteja Syntyy implantoitu ihon alle 1-5 x 10

6 solua oikeaan kylkeen hiirien, ja hoito aloitettiin, kun kasvaimet saavuttivat keskimäärin tilavuus 120 300 mm

3. IPI-504 annettiin vatsakalvonsisäisesti kahdesti viikossa annoksella 50 mg /kg. Doketakseli (McKeeson Pharmaceuticals) annosteltiin kerran viikossa 15 mg /kg (H1993, A549 ja H292 ksenograftimalleja) tai 5 mg /kg (H292 ksenograftimallia) injektiona vatsaonteloon.

Kasvaimet mitattiin kolme kertaa viikko käyttämällä digitaalista jarrusatulat ja kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen kaavaa: (pituus x leveys

2) /2. Tulokset esitetään kasvaimen keskimääräinen tilavuus ± keskivirhe keskiarvon (SEM).

Solujen lisääntyminen

Solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 5000 solua /kuoppa 24 h ennen hoidolle yhdistelmiä IPI-504 ja dosetakselia ilmoitettu. Solujen proliferaatio mitattiin Alamar Blue (Life Technologies) tai solujen tiitteri Glo (Promega). Solukuolema mitattiin prosenttiosuus 7AAD positiivisten solujen (Guava Viacount Flex) tai prosenttiosuus pilkkoa kaspaasi 3-positiivisten solujen luminenssi perustuva määritys (Promega, kaspaasi-Glo3 /7).

Synergy tutkimukset

Combination indeksit (CI) määritettiin menetelmällä Chou ja Talalay [13] käyttämällä kiinteitä ja ei-kiinteitä huumeiden suhteet ja CalcuSyn- ohjelmisto (Biosoft). Cl-arvot 1 osoittavat synergiaa, joiden arvot 0,5 osoittaa vahvaa synergiaa.

Immunoblottausmääritys /Immunosaostaminen

Immunoblottausta, solut hajotettiin RIPA lyysipuskuria (Sigma-Aldrich), jota oli täydennetty proteaasi- estäjät (Roche) ja fosfataasi estäjät (HALT; Thermo Fisher Scientific). Sillä HSP90 immunosaostukset, solujen pelletit kerättiin post lääkehoito ei-pesuainetta lyysipuskuria (50 mM Tris, pH 7,4, 20 mM NaCI, 2 mM MgCI

2, 1 mM EDTA, 10% glyserolia, proteaasi-inhibiittori tabletti (Roche) ja fosfataasi estäjät (Thermo Fisher Scientific)) seurasi kolme peräkkäisen jäädytys sulatus-jaksolla hajotukseen. Immunosaostukset suoritettiin yön yli 4 ° C: ssa käyttäen HSP90 monoklonaalinen vasta-aine (Santa Cruz) ja Sepharose GammaBind G-helmiä (GE Healthcare).

vakaa isotooppi leimaaminen aminohappojen Culture (SILAC) merkinnät ja massaspektrometrialla

metabolinen leimaus H292-soluissa suoritettiin normaali arginiini ja lysiini tai raskaampia isotooppisia muunnoksia kahden aminohapon L-lysiini-HCl: ää [

13C

6], L-arginiini-HCl: a [

13C

6,

15N

4] käyttämällä Invitrogenin SILAC-Flex Mediapaketti ja raskaat arginiini ostetaan Thermo Fisher Scientific. Jotta vähentää näytteen monimutkaisuutta, HSP90 immuunisaostukset suoritettiin lääkkeellä käsiteltyjen solujen ja proteiinit erotettiin 1D-SDS-PAGE: lla. Proteiinit geeliviipaleista pilkottiin käyttäen sian trypsiiniä ja analysoitiin LC-MS /MS: llä. Peptidit puhdistetaan ja konsentroitiin käyttämällä C18 vaiheessa vihjeitä (Proxeon) ja erotettiin käyttäen verkossa C18-faasin nanomittakaavan nestekromatografia tandem-massaspektrometrialla on Surveyor MS pumppu kytketään LTQ-Orbitrap XL (Thermo Fischer Scientific) käyttäen 2 h lineaarinen gradientti . Hajanaisuus top 10 peptidit kussakin näytteessä suoritettiin törmäyksen aiheuttama dissosiaatiota. Raw MS tiedostoja LTQ-orbitrap analysoitiin MaxQuant (versio 1.2.2.4) [14]. MS /MS-spektrit vastaavuushaku syötti IPI-ihmisen tietokanta version 3.68 avulla Andromeda hakukoneen. Väärä löytö 0,01 käytettiin sekä peptidin ja proteiinin tasot.

RNAi tutkimukset

H292-solut transfektoitiin 30 nM siRNA käyttäen RNAimax (Invitrogen). siRNA: t hankittiin Thermo Fisher Scientific kuin ON-KOHDE plus SMART altaat (sekoitus 4 yksittäisten siRNA: iden per geeni). SMART-allas siRNA sekvenssit ovat: ei-kohdistaminen (salatun) ohjaus: UGGUUUACAUGUCGACUAA, UGGUUUACAUGUUGUGUGA, UGGUUUACAUGUUUUCUGA, UGGUUUACAUGUUUUCCUA; ANAPC3: GGAAAUAGCCGAGAGGUAA, CAAAAGAGCCUUAGUUUAA, AAUGAUAGCCUGGAAAUUA, GCAUAUAGACUCUUGAAAG; ja ANAPC4: GCCAGAAAGUUUACUCAUA, GAUGAACAGUGUAGUGCUA, ACACGUAGAUUGUUCAAAU, CGCUUUAGCUCCAGAGAUA. Neljä tuntia transfektion jälkeen, solut ympättiin 96-kuoppalevyille, käsiteltiin annostitraus doketakselin ja korjattu virtaussytometrialla (pH 3) tai lisääntyminen (7AAD) 30 h tai 72 h postitse lääkehoitoa, vastaavasti.

Virtaussytometria

Solupelletit kerättiin trypsiinikäsittelyllä, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 37 ° C: ssa 15 minuutin ajan, lisätty jäillä 5 minuutin ajan, ja sitten pelletoitiin ja suspendoitiin uudelleen jääkylmään metanoliin 30 min jäätä. Seuraavaksi solupelletit pestiin 1% naudan albumiinia seerumia (BSA) PBS: ssä kaksi kertaa ja sen jälkeen inkuboimalla FITC-konjugoitua pH-arvoon 3-vasta-aineen 2 h RT: ssä. Solupelletit pestiin kaksi kertaa 1% BSA /PBS: ssä ja suspendoitiin uudelleen 2 ug /ml Hoechst (Molecular Probes) /PBS: llä 37 ° C: ssa 15 minuutin ajan. Värjätään solut analysoitiin käyttämällä BD LSRII Fortessa virtaussytometrillä. FITC-positiiviset solut mitattiin aallonpituudella 488 nm, ja DNA-pitoisuus mitattiin Hoechst-värjäys käyttäen UV-laser. Tietojen analysointi suoritettiin käyttäen FlowJo ohjelmistoa (V7.6.3).

Mikroskopia

Faasikontrasti- kuvat otettiin käyttäen Nikon Eclipse TE2000-S mikroskoopilla ja Spot ohjelmisto kuvien hankintaan (V4.7) .

mitoottista ravistaa pois

mitoottista solut kerättiin käsin napauttamalla pullon irrottaa mitoottisiin solujen suspension. Mitoottiset solut eristettiin sentrifugoinnilla (1500 rpm, 5 min), lyysattiin RIPA-puskurilla ja inkuboitiin läsnä ollessa tai ilman alkalisen fosfataasin (Sigma-Aldrich).

Vasta-aineet ja reagenssit

Vasta-aineet HSP90 (Santa Cruz), HSP70 (Santa Cruz), sykliini B (BD Biosciences), Securin (Abcam), ANAPC3 (Bethyl Laboratories), ANAPC4 (Bethyl Laboratories), Aurorakinaasi B (Bethyl Laboratories), MCL1 ( Cell Signaling Technology), GAPDH (Cell Signaling Technology), glukokortikoidireseptoriin (Cell Signaling Technology), ja FITC-S10 fosfo-histoni H3 (Cell Signaling Technology) käytettiin immunosaostukseen, immunoblotting ja virtaussytometria. Aurora A /B: n estäjä (ZM447439) hankittiin EMD Millipore ja PLK1 estäjä (BI2536) hankittiin SelleckChem. IPI-504 syntetisoitiin Infinity Pharmaceuticals, Inc.

Tulokset

IPI-504 ja doketakselia yhdistelmänä tukahduttaa kasvaimen kasvua NSCLC -tuumoriksenografti mallit

tunnistaa NSCLC solulinjoja osoittavat in vivo herkkyyttä yhdistelmä IPI-504 ja dosetakseli, hiirillä ksenograftikasvaimissa (H1993, A549, H522 ja H292) sai vehikkeliä, 50 mg /kg IPI-504 yksin, 5 tai 15 mg /kg dosetakseli yksinään, tai yhdistelmä 50 mg /kg IPI-504 ja 5 tai 15 mg /kg doketakselia. Hoito IPI-504 yksinään esti kasvaimen kasvua suhteessa ajoneuvon H1993, A549, ja H292 ksenograftit (22-48%), mutta ei ollut aktiivisuutta H522 ksenografteissa (Fig. 1). Single-agentti vaikutus havaittiin käsittelemällä dosetakselin, jolloin kasvun eston verrattuna ajoneuvon H1993, A549- ja H292 ksenograftit (56-69%) (Fig. 1A-C). Toisin kuin yhden aineen aktiivisuuden, kasvaimen taantumiseen havaittiin vasteena yhdistetyn IPI-504 ja doketakselia H1993 ja A549 ksenograftimalleissa (Fig.s. 1A ja B). Kasvaimen kasvun esto tehostettiin yhdistelmä verrattuna joko ainoana lääkkeenä yksin H292 ksenograftikasvaimissa (Fig. 1 C). Vahvan yhden aineen aktiivisuuden H522 ksenograftimallia, doketakselia annosta pienentää 15-5 mg /kg yhdistelmälle tutkimuksessa. Yhdistelmä 5 mg /kg doketakselia ja 50 mg /kg IPI-504 johti 71% kasvaimen kasvun inhibitio verrattuna ajoneuvoon (Fig. 1 D). Nämä tulokset osoittavat mahdollisia synergiavaikutuksen IPI-504 ja dosetakselilla kasvun estäminen prekliinisissä malleissa NSCLC.

NCR nu /nu homotsygoottinen uroshiiret ihon alle istutettiin (A) H1993, (B) A549, (C ) H292 ja (D) H522 soluja ja käsiteltiin DMSO ajoneuvo (mustat ympyrät), IPI-504 (vihreä neliöt), DTX (sininen ruutu), tai yhdistelmä IPI-504 ja DTX (punaiset kolmiot). IPI-504 annettiin IP-injektiona annoksena 50 mg /kg, kahdesti viikossa yhteensä 6 annosta. DTX annettiin 5 mg /kg (H522) tai 15 mg /kg (H1993, A549, H292), IP-injektiolla, viikoittain yhteensä 3 annosta. Numerot kuvaajiin edustavat keskimääräistä prosenttia kasvaimen kasvun estämistä suhteessa ajoneuvon saaneista arm. Milloin on osoitettu, * merkitsee tilastollista merkitsevyyttä (p 0,05) välillä yhdistelmä hoidon ja DTX hoitoryhmissä mitattiin päivänä 30 (H1993, H549, H522) käyttäen Studentin t-testiä.

IPI-504 ja doketakselin yhdistelmänä osoittavat in vitro yhteisvaikutusta NSCLC solulinjoissa

tutkimiseksi MOA tehostetun in vivo kasvaimen inhibitio yhdistettiin IPI-504 ja doketakseli vaikutus yhdistelmän solukuoleman ja solujen lisääntymistä määritettiin in vitro. Solukuolemaan tutkimukset H292-soluissa, yhdistelmä indeksit laskettiin irtoava lääkeaineen suhde menetelmä Chou ja Talalay, jossa on CI-arvot 1,0 osoitus synergiasta [13]. Annokset IPI-504 (75-125 nM) on tehokas kasvun esto (S1A Fig.) Olivat suurelta osin tehottomia tuottaen sytotoksisen vasteen yläpuolella valvonta H292-soluissa (kuvio. 2A, vasen paneeli). Kuitenkin yhdistämällä IPI-504 (75-125 nM) ja 50 nM doketakselin lisäsi H292 solukuoleman 24% (dosetakseli yksinään) ja 61-68% (yhdistelmä) CI-arvot ilmaisevat voimakas synergia (CI 0,2). Vastaavasti yhdistämällä dosetakselin (1-4 nM) kanssa 2 uM IPI-504 lisäsi H292 solukuoleman 37% (IPI-504 yksin) 63 71% (yhdistelmä) CI-arvot osoittavat synergiaa (CI 0,5) ( Fig. 2A, oikeanpuoleinen paneeli).

(A) solujen kuolema mitattiin 48 tunnin kuluttua hoidon kuin kiinteää lääkettä suhde yhdistelmiä IPI-504 ja doketakselin (DTX) by 7AAD in H292-soluissa. Yhdistelmä indeksit (CI) arvot laskettiin käyttäen CalcuSyn- ohjelmistoa (Biosoft) kanssa arvojen 0,5 osoittaa voimakas synergia. Virhepylväät edustavat keskihajonta (n = 4). Arvot kaikille yhdistelmähoidot olivat tilastollisesti merkitseviä verrattuna monoterapiana hoitoja määritetty Studentin T-testiä (p 0,01). (B) Solukuolemaan mitattiin 30 tunnin kuluttua huumehoidon H1993-soluissa käyttämällä kaspaasi-Glo3 /7 luminenssi määrityksessä. Edustavat tiedot näkyvät (n = 2). (C) Soluja käsiteltiin kiinteällä lääkeaineen suhde IPI-504 ja DTX: ssa 72 tuntia; soluproliferaatiota mitattiin Alamar Blue. Näkyy normalisoituvat isobologrammit. D = annos, ED

50 = annos, joka tarvitaan saavuttamaan 50%: kasvun esto. Pisteitä kaavion viittaavat suhde D /ED

50 DTX x-akselin vs D /ED

50 IPI-504 y-akselilla. Datapistettä jotka kuuluvat lävistäjä edustaa additiivisuutta; yläpuolella lävistäjä, vihamielisyys; lävistäjän alapuolella synergiaa. (D) Käsittely PLK1 estäjä (BI2436) herkistää H292 soluja IPI-504. H292-soluja käsiteltiin 72 h titrata IPI-504 yksin (sininen ruutu) tai yhdessä 5 nM BI2536 (punaiset neliöt) ja sen jälkeen solukuolema määritys (7AAD). Virhepylväät edustavat keskihajonta (n = 2).

H1993 soluissa, yhdistelmät alhainen (2 nM) tai korkea (20 nM) annoksia doketakselia annoksilla IPI-504 edustavat EY

20 (14 nM), EY

50 (59 nM), tai EY

80 (255 nM) kasvun esto (S1A Fig.) tutkittiin solukuolemaan käyttämällä kaspaasi-Glo3 /7 määrityksessä. Lisäykset 2- 4-kertaiseksi kaspaasiaktiivisuus havaittiin lääkkeen yhdistelmällä suhteessa yhteen agentti vastauksia kaikille, mutta pienimmän annoksen yhdistelmä 14 nM IPI-504 ja 2 nM doketakseli (Fig. 2B).

Soluproliferaatiomäärityksiä tutkimuksia, paneeli solulinjoja käsiteltiin lääkehottuma suhteilla. Synergistinen vaste lääkeyhdistelmä havaittiin kaikissa neljässä solulinjoissa joille yhdistelmäefektit aiemmin havaittu in vivo (Fig. 2C, A549, H1993, H292 ja H522). Ei ollut mitään viitteitä synergiavaikutuksesta lääkkeen yhdistelmän H1793 soluissa, mikä viittaa siihen, että tietyissä solulinjoissa ei ehkä reagoi tämän erityisen yhdistelmän (Fig. 2C). Valitettavasti vahvistava ksenografti-tutkimukset eivät olleet mahdollisia H1793, koska solut eivät kasva myöskään immunosuppressoiduilla NCR nu /nu tai NOD /SCID-hiirissä. H292-soluissa valittiin suurin osa myöhempien mekaaniset tutkimukset, koska ne näkyvät vahvin ja johdonmukainen synergistinen vaste lääkeyhdistelmä in vitro, kuitenkin, muita solulinjoja tutkittiin myös erityisissä tapauksissa. Kaiken kaikkiaan nämä havainnot osoittavat, että jotkut NSCLC solulinjat osoittavat huomattavaa laskua solujen lisääntymisen ja lisäykset apoptoottisen solukuoleman kanssa yhdistetyn IPI-504 ja doketakselihoidon verrattuna kerta tekijöille yksin.

inhibiittorit suunniteltu kohde mitoottisiin kinaasien kuten PLK1, edustaa vaihtoehtoista luokkaa antimitotics on MTA. PLK1 on tärkeä säätelijä mitoosin ja tunnetun HSP90 vuorovaikutuksessa proteiini [15]. PLK estäjä (BI2536) näytteille 10 kertaa suurempi selektiivisyys PLK1 verrattuna PLK2 tai PLK3 käytettiin tutkittaessa yhdistelmän vaikutuksia IPI-504. Hoito H292-soluissa, jolla on EY

50 annosta IPI-504 kasvun estäminen (175 nM) kasvoi solukuoleman 24% yhdistettynä ajoneuvon 45%, kun se yhdistetään EY

50 annosta BI2536 kasvulle esto (5 nM) (Fig. 2D ja S1B kuviossa.). Nämä tiedot ovat sopusoinnussa hypoteesin, että IPI-504 yhdistää eri luokkien antimitotics edistää solukuolemaa riippumattomien mekanismien.

IPI-504 ja doketakselin yhdistelmä hoitotuloksia kertymiseen mitoosi solujen

Kun otetaan huomioon, että antimitoottisia vaikutuksia dosetakselin ovat molekulaarisen perustan sen myrkyllisyyden, testasimme ennustaa, että IPI-504 parantaa antimitoottisia vaikutuksia doketakselia. Mitoosi väestö, joka tunnetaan myös nimellä mitoosi-indeksi, mitattiin H292-soluissa käsitelty eri ajankohtina ja annoksen yhdistelmiä IPI-504 ja doketakselin. Yhdistelmä matala annos (2 nM) dosetakselin IPI-504 johti ohimenevää mitoosi-indeksi (10% 8 h 26% 30 h) ennen paluuta perustasoille (4% 48 h) (Fig. 3A). Sen sijaan mitoosi-indeksi ei noussut yli lähtötason koko kokeen ajan käsitellyissä soluissa joko IPI-504 tai dosetakselia yksittäisinä aineina (Fig. 3A). Samanlainen ohimenevää mitoosi-indeksi seuraa lasku havaittiin upon käsittelemällä H292-soluissa, joilla on korkea dosetakseliannos (20 nM) monoterapiana (Fig. 3B, vasen paneeli). Lisäämällä IPI-504 korkean annoksen doketakselin kasvanut amplitudi ja kesto mitoottisen pidätys (Fig. 3B, vasen paneeli). Toisin kuin H292-soluissa, mikä mitoosi-indeksi ei havaittu käsiteltäessä A549-solujen pienen annoksen (2 nM) dosetakseli ja IPI-504 yhdistelmä (tuloksia ei ole esitetty), mikä osoittaa, että vastaus tähän lääkkeen yhdistelmä voi olla solu tyypistä. Kuitenkin kasvu amplitudi ja kesto mitoosi pidätys havaittiin A549-soluja käsiteltiin suurella annoksella doketakseli (20 nM) ja IPI-504 yhdistelmä suhteessa dosetakseli yksinään, verrattavissa havaittiin H292-soluissa (kuvio. 3B, oikea paneeli). Koska mitoottista havaitut vaikutukset yhdessä IPI-504 olivat yhdenmukaiset useita solutyyppejä, korkea-annos doketakselia valittiin myöhempää MOA tutkimuksiin.

EY

50 annosta varten IPI-504 määritettiin 72 h Cell titraaminen Glo (S1A Fig.). H292 (A, B vasen paneeli) ja A549 (B, oikea paneeli) soluja käsiteltiin DMSO (sininen ruutu), IPI-504 (punainen neliöt), DTX (vihreä kolmiot) tai IPI-504 /DTX yhdistelmä (violetti ympyrät) ja korjattu tällä ilmoitettuina ajankohtina läsnäolon suhteen mitoosi merkki, pH 3. Edustavat tiedot näkyvät (n = 2).

Mitoosi tarkastuspiste on osittain vastuussa solukuoleman vaikutukset IPI-504 ja doketakselin

Mitoosi pidätys edellisen solukuoleman IPI -504 ja dosetakseli käsiteltyjä soluja ehdotti, että aktivointi mitoosi tarkistuspiste on tärkeä tekijä on solukuoleman vastausta. Tämän hypoteesin testaamiseksi, selektiivinen Aurora A /Aurora B estäjä (ZM447439) käytettiin ohittaa Mitoosi tarkastusasemaa H292-soluissa käsitelty IPI-504 ja doketakselin yhdistelmä. Hoito H292-solujen ZM447439 johti kumoamisen IPI-504 ja doketakselin aiheuttama mitoottisiin tarkastuspiste pidätys joka määritetään heikkenee huomattavasti mitoosi-indeksi (Fig. 4A, vasen paneeli). Vaihekontrasti kuvia edellyttäen visuaalisen vahvistuksen pyöristettynä (mitoosi) solut, näkyvästi esillä kulttuureissa IPI-504 ja doketakselin käsiteltyjä soluja verrattuna litistyneempi morfologia IPI-504, dosetakseli, ja ZM447439 käsitellyt solut (Fig. 4A, oikealla paneeli). Vaikutuksen arvioimiseksi mitoosi tarkistuspisteen ohituksen, solukuolemaa mitattiin sen jälkeen, kun hoidon H292-solujen IPI-504 ja doketakselin läsnä ollessa tai poissa ollessa ZM447439 (Fig. 4B). Vaikka vaikutukset Aurorakinaasi estoa solukuoleman osoitti vaihtelevia vaikutuksia yhdistettynä joko IPI-504 tai dosetakselia yksittäisinä aineina (S2 kuvassa.), Hoito ZM447439 osittain pelasti solukuolemaa synergiaa IPI-504 ja dosetakseli, vähentämällä prosenttiosuus kuolleiden solujen 40%: sta 22% (Kuva. 4B). Tämä on sopusoinnussa hypoteesin, että mitoosi tarkastuspiste on osittain vastuussa tästä synergiavaikutuksesta.

H292-soluja käsiteltiin 30 h (A, C) tai 48 h (B) osoitetun annoksen yhdistelmiä IPI-504 (175 nM), DTX (20 nM) ja Aurora-kinaasin estäjä ZM447439 (9 uM). Solut kerättiin (A) virtaussytometria (pH 3) ja vaihe kontrasti kuvantaminen, (B) solukuolemaa (7AAD), ja (C) immunoblot-analyysillä. Nuoli osoittaa hidas vaeltavat, fosforyloitua muotoa Securin. Virhepalkit mitoosi-indeksi ja solukuolemaa edustavat keskihajonta Toistojen kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta.

Samanaikainen kanssa mitoosi pidätys, IPI-504 ja dosetakseliannosta yhdistelmät johtivat kertyminen mitoosi proteiinien Securin, sykliini B, ja AURKB (Fig. 4C). Ulkonäkö hitaasti vaeltavat muoto Securin, ajatellaan edustavan aktiivisen, fosforyloitu muoto [16] havaittiin erityisesti soluissa käsitelty IPI-504 ja doketakselin yhdistelmä (Fig. 4C, nuoli). Hidas vaeltavat muoto muutettiin nopeasti siirtymässä muodossa upon fosfataasikäsittely, joka vahvistaa, että hidas vaeltavat muoto edustaa fosforyloitua muotoa (S3 kuvassa.). Kumoaminen IPI-504 ja doketakselin aiheuttama ylössäätöä mitoosi proteiinien Securin, sykliini-B, ja AURKB havaittiin samanakaiseen hoidon ZM447439 (Fig. 4C). Sen sijaan yhteistyössä hoito ZM447439 ei kumota IPI-504 aiheuttama säätely ylöspäin HSP70, surrogaattimarkkerina HSP90 esto [17], mikä osoittaa, että IPI-504 on yhä aktiivinen näissä soluissa.

on raportoitu, että pitkäkestoisena mitoosi pidätys, fosforylaatio antiapoptoottinen proteiini MCL1 by Cyclin B-CDK1 aloittaa sen APC /C-riippuvaisen tuhoa, mikä johtaa solun kuolemaan mitoosin aikana [18]. Mielenkiintoista, alas-säätely MCL1 proteiinin havaittiin erityisesti H292-soluissa käsitelty IPI-504 ja doketakselin yhdistelmä, vaikutus, joka kumottiin samanakaiseen hoito Aurora estäjä (Fig. 4C).

Anaphase edistäminen kompleksi (APC /C) komponentit nimenomaan köyhdytetyn päässä HSP90 interactome in IPI-504 ja doketakselin käsiteltyjä soluja

Kun esto HSP90, väärin laskostuneen asiakas proteiinit irtoavan HSP90 ja sen jälkeen on tarkoitus antaa proteasomin välittämän hajoamisen [19]. Tunnistaa potentiaalinen asiakas proteiineja, jotka edistävät synergiaa IPI-504 ja dosetakseli, SILAC suoritettiin ja HSP90 vuorovaikutuksessa proteiinit käsittävät ”interactome” tunnistettiin olosuhteissa lääkehoidon massaspektrometrialla. HSP90 interactome varten eteenpäin kokeesta, jossa H292-soluissa leimattu raskas isotooppeja lysiini ja arginiini hoidettiin yhdistelmällä IPI-504 ja doketakselin ja H292-soluissa merkitty normaali lysiiniä ja arginiinia sai vehikkeliä yksinään tutkittiin ja verrattiin tietoihin saatu käänteisen kokeen, jossa H292-soluissa leimattu raskaan isotooppien käsiteltiin vehikkelillä ja H292-soluissa merkitty normaalin isotooppien hoidettiin yhdistelmällä IPI-504 ja doketakselin (Fig. 5A). Kuten odotettua, Hsp70 oli vahvasti säädellään ylöspäin HSP90 interactome kun IPI-504 ja dosetakselihoidon (Fig. 5B) [17]. Samoin Glucocortocoid Reseptori (GR), tunnettu HSP90 asiakas proteiinia, oli vahvasti alassäädetty päässä HSP90 interactome kun yhdistelmähoidon (Fig. 5B) [20]. Useita mahdollisia uusia HSP90 asiakas proteiineja tunnistettiin jotka alassäädetty vastauksena yhdistelmä, joista osa on rooli Mitoosi Checkpoint vastaus (S1 taulukko). Näitä olivat kaksi osaa APC /C, ANAPC3 ja ANAPC4 (Fig. 5B). Vahvista SILAC data, proteiini runsaus määritettiin western blot-analyysi lysaatit kerättiin H292-soluissa käsitelty IPI-504 ja doketakselia yhdistelmänä (Fig. 5C; S4 kuvassa.). Samanlaisia ​​GR, alas-säätely Sekä ANAPC3 ja ANAPC4 havaittiin, kun hoito H292 yhdistelmällä IPI-504 ja doketakselin verrattuna ajoneuvoon (Fig. 5C). Ylös-säätely Hsp70 vahvistettiin käsiteltäessä IPI-504 yksinään tai yhdessä doketakselin (Fig. 5C) kantavassa osuus APC /C solukuolemaan synergiaa yhdistelmä IPI-504 ja doketakselia arvioida tarkastelemalla sitä, menetys APC /C komponentit korvaisivat IPI-504 herkistävä solujen doketakselia. APC /C komponenttien ANAPC3 ja ANAPC4 tippuu alas siRNA erikseen tai yhdessä, ja vaikutukset soluproliferaatioon mitattiin dosetakselihoidossa hoitoa. Pitoisuuksilla dosetakselin suurempi kuin 5 nM, ylätasangolla solukuoleman kasvoi 63% vuonna sekoitetun siRNA ohjaus, 73% kun ANAPC4 Knockdown, ja 80%, kun ANAPC3 pudotus yksinään tai yhdessä ANAPC4 taintumisen (Fig. 5D, vasemman paneeli). Menetys APC /C komponenttien parannettu Antimitoottisten vaikutuksia dosetakselin lisääminen mitoosi-indeksi 17% dosetakselin (10 nM) yksin 33% yhdistettynä ANAPC3 /ANAPC4 tappio (Kuva. 5D, oikea paneeli). Western blot analyysi vahvisti tehokas knockdovvn APC /C komponenttien (Fig. 5E).

(A) vakaa isotooppi leimaaminen aminohappojen Culture (SILAC) kaavamainen. Leimattiin metabolisesti H292-soluja käsiteltiin 24 tuntia yhdistelmällä 300 nM IPI-504 ja 10 nM DTX tai vehikkeliä (DMSO), jota seuraa tunnistaminen HSP90 interactome massaspektrometrialla. (B) Raaka tietoja SILAC tutkimuksessa. Tietoparien oikeassa yläkulmassa ja vasemmassa alakulmassa neljännesten edustavat proteiineja, joita säädellään ylöspäin ja alassäädetty, vastaavasti HSP90 interactome käsittelemällä yhdistelmä verrattuna ajoneuvoon. Kaksi nuolet oikeassa yläkulmassa neljänneksessä edustavat itsenäinen peptidifragmenttien ainutlaatuinen sekvenssien kohdistaminen HSP70. (C) immunoblottianalyysi varmentaa ehtyminen ANAPC3 ja ANAPC4 päälle 24 h hoito H292-soluissa 300 nM IPI-504 ja 10 nM DTX yhdistelmä. GR = glukokortikoidireseptoriin. (D) menetys APC /C komponenttien RNAi herkistää H292-soluissa DTX välittämä solukuolema (72 h, 7AAD) (vasen paneeli) ja lisää mitoosi-indeksi (30 h, pH 3) (oikea paneeli). H292-soluja transfektoitiin nontargeting salattu siRNA (sininen ruutu) tai siRNA: n kohdistaminen ANAPC3 (punaiset neliöt), ANAPC4 (vihreä kolmiot) tai ANAPC3 /ANAPC4 yhdistelmä (violetti ympyrät). (E) immunoblottianalyysi osoittaa knockdown tehokkuutta. Edustavat tiedot näkyvät (n = 2).

Keskustelu

MTA jotka häiritsevät mikrotubulusdynamiikan ovat yksi tehokkaimmista mitoosia hoitoja monenlaisia ​​syöpiä. Valitettavasti MTA liittyviä toksisuuksia ja lääkeresistensseihin edelleen suuria haasteita.

Vastaa