Krooninen sairaus

tiivistelmä

Uusi molekyylikokonaisuutena quinoxalinhydrazide johdannainen NVX-412 oli tunnistettu lupaava lääke-ehdokas hoitoon eri syöpätyyppien vahvan sytotoksinen aktiivisuus ja suhteellinen spesifisyys. Täällä tarjoamme ensimmäiset tiedot siitä toimintamekanismit NVX-412. Osoitamme, että NVX-412 kykenee sen antineoplastinen on p53-riippumattomalla tavalla ja indusoi S-vaiheen pysähtymisen ja DNA-vaurioita arvioimana γH2AX värjäystä. Ehdotamme bimodaalinen (annoksesta riippuva) toimintatapa NVX-412, on ensi sijassa sytostaatit alemmilla ja pääasiassa sytotoksisia korkeilla pitoisuuksilla. Perustuen laaja ja johdonmukainen antineoplastinen havaittu, NVX-412 lupaava tehokas lääke-ehdokas hoitoon eri syöpätyyppien, erityisesti hematologiset maligniteetit erittäin tyydyttävää lääkehoitoa.

Citation: Hebar , Rütgen BC, Selzer E (2012) NVX-412, New Oncology Drug Candidate, indusoi S-vaiheen pysähtymisen ja DNA Damage syöpäsoluissa on p53-riippumattomalla tavalla. PLoS ONE 7 (9): e45015. doi: 10,1371 /journal.pone.0045015

Editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 helmikuu 2012; Hyväksytty: 14 elokuu 2012; Julkaistu: 13 syyskuu 2012

Copyright: © Hebar et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Nämä kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

Kilpailevat edut: ES on osakas ja konsultti Novelix Pharmaceuticals, Inc. Novelix Pharmaceuticals, Inc. on patentin haltija NXV-412 ja tarjotaan NVX-412 tätä tutkimusta varten. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Syöpä on yksi johtavista kuolinsyistä maailmassa. Mukaan Maailman terveysjärjestön syöpä vastaa noin 13% kaikista kuolemista maailmanlaajuisesti [1]. Huolimatta laaja investointiohjelma, tutkimiseen vuosikymmenien aikana, tällä hetkellä saatavilla syöpälääkkeet lay takana odotukset ja siksi uusia, erittäin aktiivinen, hyvin siedetty ja mieluiten suun kautta biologisesti saatavilla syöpälääkkeet ovat vahvasti tarvita. Pyratsiini-2-karboksyylihapon N ’(7-fluori-pyrrolo [1,2-α] kinoksalin-4-yyli) hydratsidi-oksaalihappo co-kide, kutsutaan NVX-412 (kuvio 1), on lupaava lääke-ehdokas hoitoon useiden syöpätyyppien. Tämä uusi molekyyli yksikkö lääke-ehdokas täyttää kriteerit Lipinskís säännön viisi, joka antaa ensimmäinen vihje huumeiden kaltaisia ​​ominaisuuksia ja siitä oletetun lääkeainekandidaatti voi olla sopiva lääkkeeksi [2]. NVX-412 on co-kide oksaalihappoa ja NVX-144, sen vanhempien lyijyä yhdistettä. NVX-144: n löytö ja kemiallinen rakenne kuvasivat Grande ja työtovereiden [3]. Se kuuluu kemialliseen luokkaan quinoxalinhydrazides ja kehitettiin kautta järkevä lääkekehityksessä [3]. Se, että NVX-144 muodostaa yhdessä kiteen oksaalihapon kanssa on erityisen kiinnostavaa, koska Aakeroy et ai. ovat osoittaneet, että co-kiteitä typpeä sisältävät heterosykliset karboksyylihappojen kanssa osoittavat etuja vastaavat suolat, jotka koskevat tiettyjen fysikaalisten ominaisuuksien suotuisat farmaseuttiset valmisteet [4]. NVX-412 vahvistaa tätä käsitystä näyttämällä lisääntynyt sytotoksista aktiivisuutta verrattuna vanhempien yhdiste NVX-144 HT-29 ja HCT116 koolonkarsinoomasolulinja yhteyksien IC

50, joka on 3-4 kertaa pienempi [3].

: Pyratsiini-2-karboksyylihapon N ’- (7-fluori-pyrrolo [1,2-α] kinoksalin-4-yyli) hydratsidi-oksaalihappo co-kide; Molekyylikaava: C

18H

13FN

6O

5, Molekyylipaino: 412 g /mol B: liuotinpääsyisellä mesh malli. Valkoinen: hiili; keltainen: fluori; sininen: typpi; punainen: happi. Molemmat rakenteet tuotettiin ChemBio 3D Ultra 12,0 (CambridgeSoft, MA, USA).

Toistaiseksi vaikutusmekanismi NVX-412 ei ole tiedossa. Tässä osoitamme, että NVX-412 on lupaava uusi syövän vastaisen aineen, joka kykenee sen antineoplastisia vaikutuksia laajan kasvainsolulinjoissa eri histologia. Olemme lisäksi viittaavat siihen, että NVX-412 on bimodaalinen vaikutusmekanismi on pääasiassa sytostaatit alemmilla ja pääasiassa sytotoksisia korkeilla pitoisuuksilla. Osoitamme, että NVX-412 indusoi S-vaiheen pysähtymisen sekä DNA-vaurioita ja lasku DNA-replikaatioon. Toimintatapa on NVX-412 on riippumaton p53.

Materiaalit ja menetelmät

Drugs

NVX-412 (kuvio 1) saatiin Novelix Pharmaceuticals, Inc. (La Jolla, CA, USA). Sillä

in vitro

tutkimuksissa, yhdiste liuotettiin DMSO: iin (25 mM varastoliuos säilytetään -80 ° C: ssa) ja laimennettiin annettuina pitoisuuksina. Nutlin-3 ja (S) – (+) – Kamptotekiini (CPT) ostettiin Sigma-Aldrich (Wien, AUT) ja liuotettiin DMSO: hon (kannat: 3,5 mM ja 5 mg /ml, vastaavasti). Kaikki liuokset valmistettava juuri ennen käyttöä.

NCI-60 DTP (Developmental Therapeutics Program) Human tuumorisolulinja Screen

NVX-412 sisältyi syövän vastaisen aktiivisuuden näytön National Cancer Institute (NCI) [5]. Yhdiste testattiin 59 erilaista ihmisen tuumorisolulinjoja, jotka edustavat leukemia, melanooma ja keuhko-, paksusuoli-, aivo-, munasarja-, rinta-, eturauhas-, ja munuaisten (täydellinen lista solulinjojen katso Shoemaker ym. 2006 [5]). Metodologia Tämän

in vitro

syöpää näyttö on kuvattu yksityiskohtaisesti NCI verkkosivuilla (https://dtp.nci.nih.gov/branches/btb/ivclsp.html). Lyhyesti, ihmisen kasvainsolulinjoissa syövän seulonnan paneelin kasvatettiin RPMI 1640-alustassa, joka sisälsi 5% FCS: llä ja 2 mM L-glutamiinia 96-kuoppaisille levyille tiheyksillä välillä 5000 ja 40000 solua /kuoppa. 24 tunnin jälkeen koe-lääkettä lisättiin 5 pitoisuuksina sekä ohjaus- ja soluja inkuboitiin vielä 48 tunnin ajan. Määrittämiseksi kasvua estävää vaikutusta yhdisteelle Sulphordamine B-määritys suoritettiin, joka käyttää kemiallista kiinnitystä vaiheen lopussa lääkehoidon ja myöhempi värjäys 10 minuuttia. Pesuvaiheen jälkeen, absorbanssi määritettiin 515 nm: ssä. Kolme eri annosta vasteparametrien lasketaan sitten: kasvun estäminen 50% (GI

50), joka on lääkeaineen pitoisuus johti 50%: n vähennys netto proteiinin lisääntyminen, lääkeaineen pitoisuus, joka aiheuttaa kasvun esto (TGI) ja LC

50, mikä osoittaa nettotappio solujen käsittelyn jälkeen [5].

Annosvastekäyrät HT-29, HepG2, HeLa- ja HCT116 syöpäsoluja. Soluja inkuboitiin osoitettujen konsentraatioiden NVX-412: ssa 72 tuntia ja laskettiin Beckman Coulter ViCell XR. B: klonogeeninen selviytymisen HepG2 ja HT-29-soluja. HepG2 ja HT-29-soluja inkuboitiin osoitettujen konsentraatioiden NVX-412 12 tai 14 päivää, vastaavasti. Klonogeenisten eloonjääminen merkittävästi vähentynyt annoksesta riippuvalla tavalla. C: leviämisen kinetiikkaa kolmen päivän hoidon eri pitoisuuksilla NVX-412 HT-29-solut osoittavat merkittävästi vähentynyt proliferaatio 300 nM ja lasku solujen määrä 1 uM NVX-412 käsittelyä. Data edustaa keskiarvoja (± SD), joka on vähintään 2 itsenäisestä kokeesta. Tilastollinen analyysi suoritettiin GraphPad Prism 5.0. * Tarkoittaa p-arvo 0,05, **** osoittaa p-arvo 0,0001 (Kaksisuuntainen ANOVA).

Solulinjat

Seuraavat solulinjat olivat tässä tutkimuksessa käytetyt (solulinjoja NCI-60 DTP ihmisen tuumorisolulinja näyttö ei sisälly): tällä isogeenisiin paksu- sinoomasolulinjoja HCT116 p53 + /+ ja p53 – /- ja RKO p53 + /+ ja p53 – /- hankittiin Horizon Discovery Ltd (Cambridge, UK), ja niitä viljeltiin McCoyn 5A-väliaine, johon oli lisätty 10% FCS: ää, 1% Pen Strep ja 2 mM L-glutamiinia (kun p53 tila HCT116-soluja ei ole määritelty p53 + /+ soluja käytettiin) . CLBL-1 (canine B-solulymfooma) [6], OSW [7] ja CL-1 (koiran T-solulymfooma) [8] ja GL-1 (canine B-solu-leukemia) [9] solulinjoja ystävällisesti tarjoamat BC Rütgen (University of Veterinary Medicine Wien, Wien, AUT), ja viljeltiin RPMI 1640 täydennetty 10% FCS ja 1% Pen Strep. B-solu non-Hodgkin-lymfooma solulinjojen SU-DHL-6 ja SU-DHL-8, ostettu DSMZ (German Collection of Microorganisms ja Cell Cultures, Braunschweig, Saksa), viljeltiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% FCS: ää, ja 1% Pen Strep. Samoja viljelyolosuhteet käytettiin kaikkien muiden lymfooma ja leukemia solulinjoja Raji [10], [11], Ramos [10], [11], KG-1 [10], [12], [13], [14 ], KG-1a [14], HL-60 [10], [12], [13], BV173 [10], [11], Nalm-1 [12], [13] ja K562 [10], [ ,,,0],12], [13], jotka ystävällisesti P. Valent (Medical University of Vienna, Wien, AUT) ja kaikki aiemmin julkaistu solulinjoissa saatavissa joko ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) tai DSMZ . HS27, normaali fibroblastisolulinjan, saatiin D. Barlow (Research Center for Molecular Medicine, Wien, AUT) ja kasvatettiin DMEM 10% FCS ja 1% Pen Strep [15], [16]. Hs578T kasvatettiin Minimum Essential Medium-α (MEM) täydennettynä 10% FCS, 1% Pen Strep ja 1% L-glutamiinia ja oli ystävällinen lahjoitus T. Grunt (Medical University of Vienna, Wien, AUT) [17] . Molemmat solulinjat, HS27 ja Hs578T, ovat saatavilla ATCC: ltä. HUVEC ihmisen normaaleja napalaskimon endoteelisoluja ostettiin Lonza (Walkersville, Maryland, USA) ja kasvatettiin Clonetics® EGM® BulletKit media. Ihmisen valkoinen preadiposyytit (HWP) ostettiin Promocell (Heidelberg, Saksa) ja viljeltiin preadiposyytti kasvualusta yrityksen toimittamien. Rintojen adenokarsinoomasolulinja MCF-7, kohdunkaulan karsinooman solulinjassa HeLa, hepatosellulaaristen karsinooma HepG2 ja peräsuolen adenokarsinoomasolulinja HT-29 saatiin ATCC ja viljeltiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FCS: ää ja 1% Pen Strep . Jos ei toisin mainita kaikki soluviljelmäreagenssit hankittiin Gibco (Grand Island, NY, USA).

HCT116, HeLa ja HT-29-soluja käsiteltiin korkeintaan 72 tuntia kuten. DMSO kontrolli suoritettiin mutta ei osoittanut mitään eroja verrattuna UTC. 24, 48 ja 72 tunnin kuvat on otettu (A, C, E). Paneelit B, D ja F esittävät kvantifiointiin solukoko 48 tunnin kuluttua hoidon osoitettujen konsentraatioiden NVX-412. Rasiakuvaajien edustavat tiedot soluja laskettiin 5 näkökenttien eroihin. Tilastollinen analyysi suoritettiin GraphPad Prism 5.0. **** Osoittaa p-arvo 0,0001 (U-testi). A, B: HCT116. C, D: HeLa. E, F: HT-29. UTC, Hoitamaton valvonta; CPT, Kamptotesiini.

sytotoksisuusmääritykset

Solut maljattiin 24-kuoppaisille levyille. Sen jälkeen solujen annettiin toipua 24 tuntia, NVX-412 lisättiin tuoretta elatusainetta. Maksimaalinen DMSO-pitoisuus saavutti kaikissa kokeissa oli alle 0,01%. Valvontaluetteloihinsa kokeita korkeimmalla DMSO pitoisuus tehtiin, jotta voidaan sulkea pois DMSO vaikutusten kumoamiseen. 72 tunnin kuluttua inkubaation kuluttua elinkelpoisten solujen osuus määritettiin solujen laskenta Z1 Coulter Particle Counter (Beckman Coulter, Wien, AUT), joka on ViCell XR (Beckman Coulter, Wien, AUT) tai CASY® Cell Counter (Scharfe, Reutlingen , Saksa). Sytotoksisuus ilmaistiin IC

50-arvot, jotka olivat peräisin vastaavasta annos-vaste-käyrät.

klonogeeninen määritykset

klonogeenisten määrityksiä, HT-29 ja HepG2-solut maljattiin 60 mm astiat tiheydellä 1000 solua maljaa kohden. 24 tunnin kuluttua NVX-412 lisättiin ilmoitettuina pitoisuuksina. Kasvatuksen jälkeen 12-14 päivää (jolloin arvioitavissa pesäkkeet olivat näkyviä), pesäkkeitä kiinnitettiin 70% etanolilla, värjättiin 0,5% Crystal Violet ja laskettiin käsin.

Western Blot analyysi p-p53 (Ser15) in HCT116-solut 24 ja 48 tunnin inkuboinnin 0, 0,15, 0,5 ja 1 uM NVX-412 ja 1 uM CPT positiivisena kontrollina. B: Vastaavat immunofluoresenssivärjäystä p-p53 (Ser15) (vihreä) ja HCT116-solujen 24 tunnin kuluttua inkubaation 0, 0,15, 0,5 ja 1 uM NVX-412 ja 1 uM CPT positiivisena kontrollina. Ytimet Hoechstilla 33342 (sininen). C: Vahvistus p53 tilaansa HCT116 p53 + /+ ja p53 – /- solut immunoblottauksella. Soluja viljeltiin, kun läsnä ja poissa ollessa 375 uM 5-FU: ssa 24 tuntia. D, E: Cell Numbers of HCT116 p53 + /+ tai p53 – /- (D), RKO p53 + /+ tai p53 – /- (E) soluissa, sen jälkeen 72 tunnin inkubaation NVX-412 tai Nutlin-3. Soluja viljeltiin 72 tunnin ajan eri pitoisuuksilla NVX-412 tai Nutlin-3, vastaavasti. Elinkelpoisten solujen määrä määritettiin käyttäen Beckman Coulter ViCell XR. Data edustaa keskiarvoja (± SD) kahden itsenäisen kokeen.

leviämisen Kinetics

HT-29-solut maljattiin (2 x 10

4 solua /kuoppa) 24 -kuoppaiset levyt. Elpymisen jälkeen 24 tunnin ajan, NVX-412 lisättiin tuoretta elatusainetta ja lopulliset pitoisuudet 0, 300 ja 1000 nM, vastaavasti. 24, 48 ja 72 tunnin solumäärät määritettiin Z1 Coulter Particle Counter.

Morfologia Analyysit

tutkia mahdollisia morfologisia muutoksia käsiteltäessä NVX-412, HCT116, HeLa- ja HT 29-solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja inkuboitiin 72 tuntia osoitetuilla pitoisuuksilla NVX-412, DMSO vehikkelikontrollina ja 1 uM Kamptotekiini (CPT) positiivisena kontrollina apoptoottinen morfologia. Ohjaus kokeet suoritettiin, jotta morfologisia muutoksia ei erojen vuoksi konfluenssiin. 24, 48 ja 72 tunnin kuvat on otettu Olympus IX71 käänteismikroskoo- ja kamerajärjestelmä (Olympus Color View III) 20-kertaisella suurennuksella.

kvantifiointi Cell Koot

Solukoot kvantitoitiin käyttäen erikoistunut kuvankäsittelyohjelma (ImageJ 1.45d, US NIH, Bethesda, MD, USA). Keskimääräinen alueilla kaikkien solujen läsnä 5 näkökenttien eroihin per näyte määritettiin 48 tunnin kuluttua hoidon 0, 0,15 ja 1 uM NVX-412. Ei-parametrinen U-testi käytettiin arvioitaessa tilastollisen merkityksen eroja solun kokoa, koska Kolmogorov-Smirnov testi osoitti, että tiedot eivät ole jakautunut normaalisti (GraphPad Prism 5.0, La Jolla, CA, USA).

V: Cell kaarianalyysien virtaussytometrialla HT-29, HeLa ja HCT116-solut käsiteltiin 24 tunnin ajan kuten on osoitettu NVX-412 tai CPT. Prosenttiosuudet solujen G1, S ja G2 /M-vaiheen solusyklin on esitetty. Solut analysoitiin käyttäen BD FACScan. B: NVX-412 vähentää DNA-replikaation palautuvasti HeLa ja HCT116-soluissa. HeLa ja HCT116-soluja käsiteltiin 24 tunnin ajan kuten on osoitettu. Lisäksi, 24 tunnin kuluttua hoidon Solujen annettiin toipua 24 tunnin ajan normaalissa kasvualustaa NVX-412 tai CPT. DNA: n kahdentuminen korko analysoitiin BrdU. C: Western Blot for pChk1 (Ser296) in HCT116-soluissa jälkeen 0-48 tunnin inkubaation 150 nM NVX-412. D: NVX-412 indusoi γH2AX HeLa solujen palautuva tavalla. Soluja käsiteltiin 3 ja 24 tunnin ajan kuten on osoitettu. Lisäksi, 24 tunnin kuluttua hoidon Solujen annettiin toipua 24 tunnin ajan normaalissa kasvualustaa NVX-412 tai CPT. Data edustaa kertainen muutos keskimäärin γH2AX fluoresenssin voimakkuutta per ydin (± SD) kuin määrällisesti alkaen immunofluoresenssivärjäyksessä. UTC, Hoitamaton valvonta; CPT, Camptothecin. Keskiarvoja vähintään 2 itsenäisestä kokeesta on esitetty. Tilastollinen analyysi suoritettiin GraphPad Prism 5.0. **** Osoittaa p-arvo 0,0001 (Kaksisuuntainen ANOVA).

Western Blot

Käsitellyt solut suoraan hajotettiin NP40 soluhajotuspuskurin (Invitrogen, Grand Island, NY, USA), joka sisälsi proteaasi ja fosfataasi-inhibiittorit. Proteiini mitattiin kolorimetrisesti (D

C Protein Assay, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Proteiinit erotettiin SDS – polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (Whatman ™, Wien, AUT). Equal lastaus tarkastettiin Ponceau S (SERVA, Heidelberg, Saksa) värjäys. Sitoutunut antigeeni visualisoitiin parannetun kemiluminesenssidetektiolla järjestelmä (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA). Nämä menettelyt suoritettiin valmistajan protokollia. Spesifisten vasta-aineiden seuraavat kiinnostavia proteiineja käytettiin: pChk1 (Ser296), p-p53 (Ser15), β-Tubulin ja GAPDH saatiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) 1:1000 laimennus. Toissijaiset vasta-aineet olivat peroksidaasilla merkitty vuohen anti-kani tai anti-hiiri-lgG: illä (Cell Signaling Technology) (1:2000).

Immunofluoresenssivärjäys p-p53 (Ser15) ja γH2AX (Ser139) B

HCT116 ja HeLa-solut ympättiin lasipeitinlevyihin 6-kuoppaisille levyille. 24 tuntia maljaamisen jälkeen, HCT116-soluja inkuboitiin 0,15, 0,5 ja 1 uM NVX-412 ja 1 uM CPT 24 tunnin värjäykseen p-p53. Tutkimiseen γH2AX, HeLa-soluja inkuboitiin 0,21, 0,5 ja 1 uM NVX-412 ja 1 uM CPT 3 tai 24 tuntia. Lisäksi solujen annettiin toipua 24 tuntia normaalissa kasvualustassa 24 tunnin kuluttua inkubaation NVX-412 tai CPT (pesu-out kokeilu). Sen jälkeen, kun vastaavat käsittelyt, solut pestiin ja kiinnitettiin 4% metanoli-vapaata formaldehydiä (Polysciences Inc. Warrington, PA, USA) 15 minuuttia huoneen lämpötilassa ja sitten läpäiseviksi 0,2% Triton X-100 /PBS: ssä 2 minuutin ajan huoneen lämpötila. Sen jälkeen, kun esto vuohen seerumia (5%), 1% BSA /0,3% Triton X-100 /PBS: ää, kunkin ensisijaisen vasta-ainetta lisättiin ja soluja inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli. Vasta-aineita käytettiin: hiiren p-p53 (Ser15) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) 1:100 laimennus ja hiiren p-H2AX (Ser139) (Millipore, Billerica, MA, USA) 1:1000 laimennoksena 1% BSA /PBS: llä, vastaavasti. Sitten solut pestiin 3 kertaa 10 minuutin ajan 0,25% BSA /0,1% Triton X-100 /PBS: llä ja inkuboitiin Alexa Fluor 488 konjugoidun sekundaarisen anti-hiiri-vasta-ainetta (1:1000 0,25% BSA /0,1% Triton X-100 /PBS) 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa pimeässä. Solut pestiin 3 kertaa 10 minuuttia, jossa oli 0,05% Tween-20 /PBS, joka sisälsi Hoechst 33342 (Sigma Aldrich, Wien, AUT) ja asentaa kiinnitysväliaine (Fluoprep, bioMérieux, Marcy l’Etoile, FRA). Fluoresenssi heti tallennettiin Zeiss LSM700 laserkeilauksen mikroskooppi.

kvantifiointi γH2AX

Yhteinen arviointimenettely γH2AX induktio on laskea γH2AX pesäkkeitä. Koska kanssa NVX-412 ja positiivisen kontrollin CPT γH2AX aktivointi oli niin vahva, ei erotettavissa ja mitattavissa pesäkkeet nähtiin. Näin ollen, keskimääräinen γH2AX fluoresenssi-intensiteetti tumaa kohti määritettiin. Tätä varten γH2AX intensiteetin tietyllä alalla mitattiin Määrä Yksi -4.6.9 (Basic freeware versio, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) ja jaettiin useissa ytimien tällä alalla.

määritys p53 status Riippuvuutta

isogeenisiin koolonkarsinoomasoluja linjat HCT116 p53 + /+ tai p53 – /- ja RKO p53 + /+ tai p53 – /- kasvatettiin 12-kuoppalevyillä. Elpymisen jälkeen 24 tunnin ajan, NVX-412 tai Nutlin-3 lisättiin tuoreeseen kasvualustaan ​​ilmoitettuina pitoisuuksina. Nutlin-3, joka on MDM2-antagonisti ja siten p53-reitin aktivaattorin käytettiin todistamaan ero biologisia vaikutuksia p53-tilasta. Kun oli kulunut 24 tai 72 tuntia solujen määrä määritettiin Beckman Coulter ViCell XR.

DNA Replication Luokitus

HeLa ja HCT116-solut maljattiin musta 96-kuoppaisille levyille. Sen jälkeen solujen annettiin toipua 24 tuntia NVX-412 tai CPT lisättiin tuoretta elatusainetta. 24 tunnin inkuboinnin kemiluminoivaa BrdU-ELISA (Roche Applied Science, Penzberg, Saksa) suoritettiin puolet levyjen mukaan valmistajan protokollaa. Solut jäljellä levyjen annettiin toipua 24 tuntia normaalissa kasvualustassa ennen DNA: n replikaatiota mitattiin (pesu-out kokeilu). Voit tarkistaa, onko mahdollinen lasku DNA-replikaation nopeus ei yksinkertaisesti johtui solujen määrä, koska solukuoleman induktio osuus elävien solujen määritettiin rinnan MTT-pohjainen sytotoksisuusmääritystä mukaan valmistajan protokollan (EZ4U, Biomedica, Wien, Itävalta). Kolorimetrinen (492 ja 620 nm) ja kemiluminesenssi mittaukset suoritettiin käyttämällä Fluostar Optima (BMG Labtech, Ortenberg, Saksa).

Virtaussytometrinen Cell Cycle Analyysit

HT-29, HeLa ja HCT116 solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille. Sen jälkeen solujen annettiin toipua 24 tuntia, NVX-412 lisättiin tuoreeseen kasvualustaan ​​kulloisellakin IC

50 keskittyminen ja 0,5 ja 1 uM. CPT käytettiin 50 nM ja 1 uM. Analysoida solusyklin jakautumisen, solut kerättiin 24 tunnin kuluttua inkubaation ja pestään PBS: llä. Solut kiinnitettiin 70% etanolilla vähintään 2 tuntia. Analyysiä varten solut siirrettiin PBS, inkuboitiin RNaasi A: n (0,04 ug /ml lopullinen pitoisuus) 30 minuuttia 37 ° C: ssa, käsiteltiin 40 ug /ul propidiumjodidia 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja analysoitiin sitten virtaussytometrillä käyttämällä BD FACScan (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA). Tuloksena DNA histogrammien kvantitoitiin käyttäen ModFit LT (Verity Software House, Topsham, ME, USA).

TILASTOANALYYSI

Jos ei toisin mainita, kaksisuuntainen ANOVA (varianssianalyysi; GraphPad Prism 5.0) käytettiin arvioimaan tilastollinen merkitys eroista datan.

tulokset

NVX-412 Kiinnostavuus Strong antineoplastinen

tarvittiin riippumaton yleiskatsaus välillä aktiivisuuden NVX-412 (kuvio 1) vasten paneelin hyvin kuvattu syöpäsolulinjoissa, lääke-ehdokas on sisällytettävä syövän vastaista aktiivisuutta näytön suoritettiin NCI vastaan ​​59 eri ihmisen tuumorisolulinjoja ovat peräisin eri syöpä tyypit. Tämä näyttö paljasti hyvin vahva ja laaja syövän vastaisen aktiivisuuden NVX-412 kasvainsolulinjoissa kaikkien syöpätyyppien alhaisen nanomoolialueella joiden keskimääräinen IC

50 noin 200 nM (taulukko 1). Leukemiasolulinjoilla olivat kaikkein herkimmät joiden keskimääräinen IC

50 62 nM. Lisäksi NCI-60-DTP Human Tumor Cell Line Screen (katso taulukko 2), lisäksi solulinjat on johdettu erilaisista kasvaimen yksiköiden ja kaksi eri lajien, mukaan lukien ihmisen ja koiran soluja ja myös normaali ei-syöpä-solut testattiin. Suostumuksella saadut tiedot NCI näytössä, nämä tiedot osoittivat syövän vastaista aktiivisuutta kaikissa testatuissa solulinjoissa ympäri erilaisia ​​kasvaimen tyyppejä. Kuvio 2A esittää annos-vaste-käyriä HT-29 koolonin adenokarsinooma, HepG2 hepatosellulaarista karsinoomaa, HeLa kohdunkaulan syöpä ja HCT116 koolonkarsinoomasoluille, jotka ovat solulinjoja, joita käytetään kaikissa myöhemmissä kokeissa tässä tutkimuksessa. Normaalit ihmisen endoteelisolujen (HUVEC) ja ihmisen valkoinen preadiposyytit (HWP) näytetään pienempi herkkyys verrattuna syöpäsolun linjat. HUVECrlle solut IC

50 määritettiin 2,0 uM ja ihmisen valkoinen preadiposyytit HWP 1,0 uM.

NVX-412 Näyttää bimodaalinen Activity ja indusoi morfologiset muutokset

jotta ymmärtää paremmin NVX-412 aiheuttama vaikutus, solun kasvun, solujen eloonjäämistä ja solukuoleman kokeet suoritettiin. Klonogeeniset selviytymisen määritykset [18] tehtiin HepG2 ja HT-29-soluja. Soluja inkuboitiin eri konsentraatioilla NVX-412 12 tai 14 päivää, vastaavasti. Kuten voidaan nähdä kuviosta 2B, NVX-412 vähensi kykyä HepG2 ja HT-29-solujen muodostamiseksi pesäkkeitä annoksesta riippuvalla tavalla. On huomioitava, että pitoisuus NVX-412 saavuttaa puoli-maksimaalinen vaikutus määritettiin klonogeenisten määritys on samanlainen kuin pitoisuus, määritettynä 3 päivän lisääntymisen määritys. Leviämisen kinetiikkaa määritettiin yli 3 päivää hoidon HT-29 koolonkarsinooma soluihin (kuvio 2C). Tällä IC

50 (300 nM), solujen lisääntymisen väheni huomattavasti sen jälkeen, kun 2 päivää verrattuna käsittelemättömiin kontrollisoluihin. Pitoisuus on yli IC

50 (1 uM), solujen määrä alkoi laskea alle solumääristä kylvetään alussa kokeen, mikä viittaa suoraan solukuoleman induktioon sekä solusyklin pysähtymiseen. Lisäksi sellaisten solujen morfologian altistetaan NVX-412 joko IC

50 tai suuremmilla pitoisuuksilla (1 uM) tutkittiin HCT116, HeLa ja HT-29-solujen (kuviot 3A, C, E). Hoito NVX-412 IC

50 johtanut muutoksiin morfologiset ulkonäkö kaikkien kolmen tutkitun solutyyppejä 24 tunnin sisällä solut näyttivät suurempia kuin käsittelemättömissä soluissa. DMSO yksinään ajoneuvon ohjaus ei muuta morfologinen ulkonäkö (DMSO-kontrollin ei esitetty). Tämän tutkimiseksi mielenkiintoinen ilmiö yksityiskohtaisemmin, solun kokoa kvantifioitiin 48 tunnin kuluttua hoidon NVX-412. Erittäin merkittävä kasvu solukoko havaittiin kaikkien kolmen testattu solulinjoissa (kuvio 3B, D, F). Seuraavan 48 tunnin laskua solutiheyksien voitiin havaita ja HCT116, HeLa ja HT-29-soluja. Kuitenkin tämä kuva muuttui dramaattisesti, kun korkeampia pitoisuuksia NVX-412 sovellettiin. Jälleen solut näytetään muuntunut morfologinen ulkonäkö ja suurennettuna käsittelemättömiin soluihin verrattuna (kuvio 3), mutta jo 48 tunnin määrä irrottaa ja kuolleiden solujen lisääntynyt (tietoja ei ole esitetty), samankaltainen kuin hoidon solukuoleman induktori CPT.

NVX-412 Apt p53 status Independent

tutkia mahdollisen p53 asema riippuvuutta NVX-412, fosforylaatiota asema p53 at Ser15 määritettiin [19], [20]. Immunofluoresenssivärjäyksessä p53 fosforyloitiin Ser15 suoritettiin HCT116-soluissa 24 tunnin kuluttua inkubaation eri pitoisuuksilla NVX-412 (kuvio 4B). Kuten odotettua, solut käsiteltiin 1 uM CPT oli positiivinen tumavärjäystä p-p53 (Ser15), kun taas käsittelemättömät solut olivat selvästi negatiivinen. Inkubointi IC

50 pitoisuus NVX-412 ei johda p-p53 (Ser15) värjäys, kun taas solut, joita käsiteltiin suuremmilla pitoisuuksilla (0,5 ja 1 uM) osoittivat positiivista värjäytymistä. Tämä korreloi Western blot-analyysi, joka suoritettiin samoissa olosuhteissa ja samalla pistettä, kun 24 ja 48 tuntia (kuvio 4A). Jälleen käsittelemättömiä soluja ja soluja käsiteltiin alle tai IC

50 olivat negatiivisia fosforyloitu p53, kun taas vertailukokeessa 1 uM CPT ja soluja käsiteltiin NVX-412 pitoisuus on yli IC

50 osoitti vahvaa induktio .

tutkimiseksi edelleen mahdollisena p53 asema riippuvuus aktiivisuuden NVX-412 kahden eri isogeenisiin solulinja malleissa eroavat niiden p53 tila tutkittiin; HCT116-solut, joissa on p53 + /+ tai p53 – /- fenotyyppi, ja RKO solut p53 + /+ tai p53 – /- fenotyyppi. P53-asema solujen varmistettiin immunoblottauksella (kuvio 4C). Kuviossa 4D ja 4E annos-vaste-käyriä NVX-412 ja ohjausyksikön Nutlin-3 p53 + /+ ja p53 – /- solut on esitetty. On voitu osoittaa, että molemmissa solulinjoissa, HCT116 ja RKO, p53-asema ei vaikuta herkkyyttä NVX-412; IC50-arvot isogeenisiin solulinjat olivat vertailukelpoisia. Toisin että vastaus Nutlin-3 osoitti selkeästi p53 asema riippuvuuden, jossa p53 + /+ solut ovat paljon herkempiä kuin p53 – /- solut.

NVX-412 indusoi S-vaiheessa pidätys, kohottavat DNA Damage Markers ja Vähentää DNA Replication

tulosten perusteella edellä kuvatun, pyrimme saamaan paremman käsityksen solusyklin vaikutuksia NVX-412. Siksi suoritettiin virtaussytometristen solusyklin analyysit HT-29, HeLa ja HCT116-soluissa. Kaikissa kolmessa solulinjoissa tutkittiin annoksesta riippuva nousu osa S-vaiheessa olevien solujen havaittiin 24 tunnin kuluttua inkubaation NVX-412 (kuvio 5A). Jo 24 tunnin kuluttua hoidon NVX-412 IC

50 pitoisuuksien nousu suhteellinen määrä S-vaiheessa olevien solujen havaittiin, että alkoi korostua suurempia pitoisuuksia. Lisäksi, kasvua sub-G0 /G1 solupopulaation, joka on ominaista apoptoottisia soluja, havaittiin suurempia pitoisuuksia NVX-412 ja myös CPT (tuloksia ei ole esitetty). CPT toimi positiivisena kontrollina G2 /M- tai S-vaiheen pysähtymisen. HT-29 ja HeLa-solut CPT indusoi G2 /M pidätys 50 nM ja S-vaiheen pysähtymisen 1 uM. Vuonna HCT116-soluissa 50 nM CPT indusoi myös G2 /M-vaiheen pysähtymisen, kun taas pitoisuudella 1 uM useimmat solut olivat jo kuolleet (ei näy kuvassa). Solusyklin viive havaittu FACS-analyysillä on yhteensopiva tulokset BrdU ELISA-, että vähensi DNA-replikaation, kun NVX-412 käsittelyä HeLa ja HCT116-solut (kuvio 5B). Jälleen, CPT käytettiin positiivisena kontrollina vähentämiseen DNA-replikaation määrä. Mielenkiintoista, kun solujen annettiin toipua 24 tuntia normaalissa kasvualustassa jälkeen 24 tunnin hoidon jälkeen DNA: n replikaation talteen ja nousi normaalille tasolle sekä HeLa-soluissa ja HCT116-soluissa. Sen jälkeen CPT hoito elpymisen todettiin vain alimmalla testatulla pitoisuudella. Tutkia mahdollisesti DNA-vaurion indusoivasta vaikutuksesta NVX-412, muutokset Ser296 fosforylaatioon tilasta Chk1 tutkittiin. Fosforylaatio havaittiin lisätään 4 tunnin NVX-412 käsittely, joka on osoitus DNA-vaurioita vaikutus (kuvio 5C). Seurata tämän havainnon, induktio γH2AX pesäkkeitä määritettiin immunofluoresenssivärjäyksen HeLa-soluissa (kuvio 5D). γH2AX tasot havaittiin olevan koholla, kun 24 tunnin hoidon annoksesta riippuvalla tavalla. Mukaisesti kyky solujen palauttaa normaalin DNA: n replikaatioon korko jälkeen 24 tunnin toipumisaika (kuvio 5B), γH2AX laskivat lähes perustason tasolle 24 tunnin kuluessa peruuttamisen NVX-412 (kuvio 5D, mustat palkit ). Vaikutus 1 uM CPT että käytettiin positiivisena kontrollina γH2AX induktio eivät olleet palautuvia.

Keskustelu

tutkineet antineoplastisia of NVX-412, uusi lääke ehdokas. Kattavasti näytön suorittaa NCI, NVX-412: n havaittiin aiheuttavat voimakasta syövän vastaista aktiivisuutta on submikromo- laarisena alueella, jonka keskimääräinen IC

50 200 nM kaikkien solulinjojen yhdistetty. Muita tietoja kerätään 21 syöpäsolulinjasta korosti voimakas anti-syöpä aktiivisuus NVX-412. Meidän alustavat tulokset tarjoavat ensimmäiset todisteet siitä, että NVX-412 on mielenkiintoinen tutkimus – vaihe lääkeainekandidaatti jotka voivat olla lupaavia uutena terapeuttinen, etenkin vastaan ​​hematologisten pahanlaatuisten kasvainten.

klonogeeninen selviytymisen määritykset osoittivat, että NVX-412 vähensi merkittävästi tai kokonaan esti kapasiteetti HepG2 ja HT-29-solujen muodostamaan pesäkkeitä. Nämä tulokset hienosti vahvistivat tulokset lyhytaikaisista leviämisen kokeita.