Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpäsolut reagoivat stressiin aktivoimalla erilaisia ​​selviytymisen signalointireittien. Disintegriini- ja metalloproteinaasi (ADAM) 9 ylössäädellään aikana syövän etenemiseen ja hormonihoito, toimivat osittain lisäämällä reaktiivisia happiradikaaleja. Täällä esittelemme

in vitro

ja

in vivo

todisteita siitä, että terapeuttinen kohdentaminen ADAM9 geenin ilmentymisen lentivirusta-synnyttivät hiusneula-RNA (shRNA) esti merkittävästi proliferaatiota ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa ja tukossa kasvaimen kasvua hiirimallissa eturauhassyövän luumetastaasi. Solusyklin tutkimukset vahvistivat lisäämistä G1-vaiheen ja väheneminen S-vaiheessa populaatio syövän soluja nälkään stressin olosuhteissa, mikä korreloi suurentaa solunsisäisen superoksidi tasoilla. Microarray tiedot osoittivat merkitsevästi alentuneet regeneroimaan saarekkeen johdettujen perheenjäsen 4 (REG4) ilmentyminen eturauhassyövässä solujen knockdovvn ADAM9 geenin ilmentymisen. Tämä REG4 downregulation johti myös induktion ilmentymisen p21

CIP1 /WAF1, joka säätelee negatiivisesti sykliini D1 ja estää G1 /S siirtyminen. Tuloksemme osoittavat uutta molekyylitason mekanismi ADAM9 säätelyssä eturauhassyövän solujen lisääntymistä, ja ehdottaa yhdistetty liikennemuotojen ADAM9 shRNA geeniterapia ja sytostaattien varten hormoniresistentti ja luun metastaattisen eturauhassyövän.

Citation: Liu CM , Hsieh CL, hän YC, Lo SJ, Liang JA, Hsieh TF, et al. (2013) In vivo kohdentaminen ADAM9 Gene Expression käyttäminen lentivirustartunnat-Toimitettu shRNA vaimentaa Eturauhassyöpä Kasvua säätelemällä REG4 Riippuu solusyklin etenemisen. PLoS ONE 8 (1): e53795. doi: 10,1371 /journal.pone.0053795

Editor: Irina U. Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 syyskuu 2012; Hyväksytty: 3. joulukuuta 2012 Julkaistu: 16 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat NSC99-2320-B-039-029-MY3 National Science Council, Taiwan (http://web1.nsc.gov.tw); NHRI-EX99-9902BI, NHRI-EX100-9902BI ja NHRI-EX101-9902BI National Health Research Institute, Taiwan (http://www.nhri.org.tw). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

esiintyy yli 80% myöhäisvaiheen eturauhassyövän tapauksissa luuston etäpesäkkeet korreloi korkean sairastuvuuden; 5 vuoden pysyvyys 25% ja mediaanielossaolosta noin 40 kuukautta [1]. Luuston etäpesäkkeet, koska kehitystä luukipu, syöpään liittyvä luunmurtumat ja selkäydinkompressio sekä kallon neuropatia, anemia ja infektio, voi vaarantua merkittävästi elämänlaatua eturauhassyöpäpotilaalla [2], [3]. Tällä hetkellä androgeenideprivaatio on ensimmäinen rivi hoitoa metastaattisen eturauhassyövän; kuitenkin, eturauhassyöpä usein edetä androgeenista riippumaton luu-etäpesäkkeitä. Kun tämä etenemistä tapahtuu, kemoterapiaa ja sädehoitoa ovat tärkeimmät hoitovaihtoehtoja, jotka molemmat aiheuttavat epämiellyttäviä sivuvaikutuksia ja antaa vain vähän hyötyä määrään ja elämänlaatua [4]. Siksi on tärkeää jatkaa uusia terapeuttisia tekijöitä, jotka voivat olla mahdollisuus parantaa potilaiden selviytymiseen hormoneille resistentin ja luun metastaattisen eturauhassyövän.

Huolimatta viimeaikaisen kehityksen hoitostrategioita, monet pahanlaatuiset syövät vielä kehittyä Säteilynsietotestin ja kohdennettuja hoitomuotojen [5], [6]. Resistance esiintyy seurauksena stressi, mahdollistaen pahanlaatuisten solujen poistamiseksi sytotoksista vaikutusta monien hoitojen [7]. Disintegriini- ja metalloproteinaasi (ADAM) 9 on tärkeä jäsen disintegriini- ja metalloproteinaasi geeniperheen. Proteiinit koodaama tämän perheen välittävät soluvasteita ympäristölle haittoja vuorovaikutuksessa erilaisten solun pinnan proteiinien ja säännellä monipuolinen soluprosessien lukien proliferaatio, soluväliaineen sitova, ja ektodomeeni irtoaminen [8] – [12]. Aiempi työ ryhmämme [13] ja muut [14] ovat osoittaneet kliiniset tutkimukset korkeampi ADAM9 tasot korreloivat lyhyemmässä eturauhassyövän remission. Olemme myös osoittaneet merkittävää korrelaatiota kasvaimen ADAM9 värjäystä ja eturauhassyövän riskiä uusiutumisen ja kuoleman potilailla, joille tehtiin hormonihoito, mikä viittaa siihen, että progressiivinen kasvu ADAM9 ilmaisua voitaisiin käyttää biomarkkerina huonon ennusteen eturauhassyöpäpotilailla jälkeen hormonihoito [15]. Lisäksi knockdovvn ADAM9 ilmaisun johtaa lisääntyneeseen säteilyherkkyyttä ja kemosensitiivisyys terapeuttisia aineita [16], mikä osoittaa, että ADAM9 yliekspressio syöpäsolujen ehkä potentiaalia paeta mekanismi voittamiseksi stressin aiheuttama syöpäsolun kuoleman; kuitenkin tiedetään vain vähän alavirran sääntelyn mekanismeja, joilla ADAM9 edistää syöpäsolujen selviytymisen vastauksena stressiin. Koska kohonnut ADAM9 ilmentyminen havaitaan monia kehittyneitä kasvaimissa, tämä nostaa esiin mahdollisuuden, että ADAM9 voisi olla mahdollinen biomarkkeri syövän kohdennettuja geeniterapiaa, vaikka lisää tutkimusta tarvitaan.

Tässä tutkimuksessa olemme arvioimaan mahdollisuutta lentivirusvektoriannos-synnyttivät hiusneula-RNA (shRNA) vastaan ​​ADAM9 hoitoon androgen riippumaton ja luun metastasoituneen ihmisen eturauhassyövän kokeellisessa eläinmallissa. Molekyylitason mekanismi taustalla terapeuttinen vaikutus ADAM9 kohdennettu geeniterapian myös selvitetty.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Retrovirusvektoreita sisältävä shRNA että tavoitteet ADAM9 ja ohjaus shRNA saatiin Open Biosystems (Lafayette, CO). Lentivirusvektori ADAM9 shRNA ja valvonta saatiin National RNAi Core Facility Institute of Molecular Biology /Perimän Research Center, Academia Sinica, Taiwan. Anti-ADAM9 vasta-aineet on saatu R sairaala) mukaan valmistajan ohjeiden. BT474 solulysaattia (solut käsiteltiin 500 nM doksorubisiinin yön yli) saatiin tri Wei-Chien Huang China Medical University Sairaala. Lastaus ohjaus, blotit anti-EF1-α monoklonaalinen vasta-aine (1:10,000, Millipore). Inkubaation jälkeen HRP-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (1:5000; GE Healthcare Life Science), kemiluminesenssi signaaleja havaittiin käyttämällä ECL Plus kit ja blotit altistettiin Hyperfilm ECL (GE Healthcare Life Science). Proteiini kaistalla kvantifiointi suoritettiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa (http://rsbweb.nih.gov/ij/, NIH, Bethesda, USA).

mittaus Reactive Oxygen Species

Solut ympättiin on ruokia 70-80% yhtymäkohdassa ja nälässä yön yli. Kvantifioinnin analyysiä, solut trypsinoitiin, sentrifugoitiin, ja uudelleensuspendoitiin HBSS kanssa tai ilman 5% FBS (riippuen siitä, altistuivat säteilylle tai nälkään). Vetyperoksidin havaittiin käyttäen dichlorofluorescindiacetate (DCF, 2 uM) (Invitrogen). Superoksidi havaittiin käyttäen dihydroethidium (DHE, 10 uM) (Invitrogen). Superoksidi kuvantaminen havaittiin käyttäen MitoSox Red mitokondrion superoksidi-ilmaisin (Invitrogen). Näytteitä inkuboitiin 40 minuutin ajan huoneenlämpötilassa pimeässä rotaattorin. Analyysi DCF ja DHE fluoresenssi suoritettiin käyttäen FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kuvantamista varten mitokondrio-superoksidi-sukupolvi, soluja ilman ravintoa 24 tuntia, minkä jälkeen lastausta MitoSOX Red, Alexa-488 WGA ja DAPI (Invitrogen) 30 minuutin ajan ja katselu fluoresenssimikroskoopilla.

proliferaatiomääritystä

vaikutus ADAM9 shRNA soluproliferaatioon mitattiin suoraan laskemalla solujen lukumäärä. Lyhyesti, solut maljattiin tiheyteen 1 x 10

5 60 mm: lautasen. Tiettyinä aikoina, solut poistettiin trypsinoimalla ja elävien solujen lukumäärä laskettiin hemosytometrillä käyttämällä trypaanisinisen (0,4%) värjäys.

klonogeeninen määritys

klonogeenisten solujen lisääntymisen määrityksessä, solususpensiot valmistettiin käsittelemällä 0,25% trypsiiniä ja 0,05% EDTA: ta. Laskemisen jälkeen solupitoisuus hemosytometrillä, 100-soluja siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille, joissa T-väliaineessa ja 5% FBS: ää ja 2 viikkoa. Pesäkkeiden määrä kussakin kuopassa määritettiin laskemalla solujen lukumäärä kussakin siirtomaa. Vain pesäkkeitä, joiden ≥50 solut määriteltiin menestyksekäs. Tunnistaa pesäkkeitä, väliaine poistetaan ja 3,7% formaldehydiä, lisättiin 15 minuutin ajan, jonka jälkeen inkuboitiin 1 ml kristalliviolettia 15 minuuttia huoneen lämpötilassa. Colony kuvia otettiin ja solujen määrä lasketaan ImgaeJ.

TranswellTM invaasiomääritys

invasiivisuus syöpäsolujen arvioitiin käyttäen 24-kuoppaista TranswellTM (Corning, Lowell, MA) levyjä. Lyhyesti, 2 x 10

5 solua väliaineessa, joka sisälsi 0,5% FBS: ää, lisättiin ylempään kammioon, joka sisältää 8 um huokosia polykarbonaatti päällystetty 1 mg /ml matrigeeliä; alempi kammio täytettiin väliaineessa, joka sisälsi 5% FBS. 16 tunnin kuluttua inkuboinnin yläpinnan kalvo pestään pumpulipuikolla moppi. Tunkeutuvat solut alapinnalle kalvon kiinnitettiin ja värjättiin 0,5% kristallivioletilla. Satunnainen kentät (5 per kalvo) valokuvattiin 40x suurennos laskemiseksi solujen määrä. Lisäksi, solut kvantitoitiin mittaamalla absorbanssi väriaineen tiivisteet 570 nm: ssä 100 ui Sorenson liuosta (9 mg tirsodium sitraattia, 305 ml: ssa tislattua vettä, 195 ml: lla 0,1 N HCI: a, 500 ml 90% etanolia).

haavan paraneminen määritys

Solut suspendoidaan uudelleen elatusaineeseen ympättiin 24-kuoppaisille levyille. Yksi haava luotiin keskellä yksisolukerroksen varovasti poistamalla kiinnittyneet solut steriiliin muovi pipetillä kärjestä jälkeen soluviljelmät saavutti ≥90% konfluenssiin. Solujäänteet poistettiin pesemällä seerumittomassa alustassa. Solut, jotka muuttivat haavoittuneen alueelle tai ne ulkonevat rajalta haavan visualisoitiin ja valokuvattiin Zeiss Axioplan mikroskooppia (Carl Zeiss MicroImaging, Thornwood, NY), jossa on 10 x tavoite viisi ennalta valittu ajankohtina (0, 2, 4 , 6, ja 8 h). Kukin koe suoritetaan itsenäisesti vähintään kolme kertaa.

immunohistokemiallinen värjäys

Viisi mikronin paksuinen parafinoidut kudosleikkeiden poistettiin parafiini ja rehydratoitiin. Kudosleikkeissä inkuboitiin 2 tuntia hiiren monoklonaalisella anti-ihmisen ADAM9-vasta-ainetta (1:50 laimennos, R Sitten leikkeet vastavärjättiin automaation hematoksyliinillä (DAKO) 15 minuuttia. Spesifisyys merkinnät tällä menetelmällä varmistettiin negatiivinen kontrolli reaktioita käyttäen puskuria korvata primaarisen vasta-aineen ja isotyypin IgG. Masson trikromi-värjäys suoritettiin käyttäen Massonin trikromi tahra kit (Sigma-Aldrich) noudattaen protokollaa valmistajan antamia.

tartraatti-resistentti hapan fosfataasi (TRACP) Värjäys Bone

immunovärjäys TRACP suoritettiin mukaan valmistajan protokollan (Takara Bio Inc., Shiga, Japani). Lyhyesti, parafinoidut hiiri sääriluun kohdat poistettiin parafiini ja rehydratoitiin varten TRAC Posteolytic reaktion. Luun leikkeitä inkuboitiin substraattiliuosta (0,1 tilavuutta natriumtartraatti naftoli-AS-BI-fosfaatti /Fast Red Violet LB substraattiliuosta, pH 5,2) 37 ° C: ssa 45 minuutin ajan. Pesun jälkeen dia tislatulla vedellä ja lisäämällä glyserolia kuivumisen estämiseksi, näytteet tutkittiin mikroskoopilla.

määritys Solun DNA-sisällön FACS-analyysi

Cancer solut maljattiin 1 x 10

6 solua 100 mm malja ja ruokittu joko 24 tai 48 tuntia. Solut tryspinized ja alistettiin solusyklin analyysillä käyttäen propidiumjodidia kuten on raportoitu aiemmin [18]. Suhteellinen DNA-pitoisuus ydinten mitattiin FACSCalibur (BD Bioscience).

In Vivo

ksenograftimalleissa

Viisi viikkoa vanhoja koiraspuolisia kateenkorvattomiin nude (nu /nu ) saatuja hiiriä National Laboratory Animal Center Taiwan käytettiin ihon alle (sc), sydämensisäistä, ja sääriluunsisäinen kasvaimen istutuksen. Soluja viljeltiin 100% konfluenssiin, trypsinoitiin ja lueteltu. Hiiret nukutettiin 1,7% isofluraania sekoittaa ilmaa s.c. kasvaimen istutuksen. Ksenograftikasvaimissa vahvistettiin s.c. injektio 10

6 PC3-soluja, jotka ilmentävät pSM2c tai shADAM9 solua 100 ul: aan PBS: ää molemmille puolille hiiri. Eläimet tapettiin 8 viikon kuluttua. Ei ollut merkittäviä kehon painon erot eläinten kanssa ja ilman s.c. kasvaimen lopetushetkellä. Sillä sääriluunsisäinen kasvain injektio, 27-numeroista neulaa käytettiin reikään reikä luuydinonteloon kautta sääriluun molempiin vasempaan ja oikeaan sääriluu. 28-mittari Hamilton ruisku käytettiin pistää 5 x 10

5 solua 50 ul taltio luuydinonteloon. Kasvaimen kasvua seurattiin sekä bioluminenssina ja röntgenkuvat kerran viikossa. Eläimet tapettiin 8 viikon kuluttua. Sääriluu poistettiin, pestiin PBS: ssä ja kiinnitettiin 10% formaldehydiä huoneen lämpötilassa 24 tuntia. Luun näytteet pestiin PBS: llä ja sen jälkeen kalkin kanssa 0,25 M EDTA: ta PBS: ssä (pH 7,4), huoneen lämpötilassa 6 viikkoa. EDTA kalkin liuokset vaihdetaan viikoittain. Kasvaimen kasvua seurattiin viikottain käyttäen bioluminescence kuvantamisjärjestelmä (Xenogen IVIS 200 Series, Etu, Hopkinton, MA).

RNA ja DNA Microarray Analysis

Kokonais-RNA eristettiin viljellyistä soluista (Roche Applied Science, Mannheim, Saksa) valmistajan protokollaa. Puhdistetut RNA-näytteet toimitettiin Phalanx Biotech varten mikrosiruanalyysi käyttäen Human Whole Genome OneArray® Microarray V5 (Phalanx Biotech Group, Inc., Hsinchu, Taiwan). Jokainen mikrosiru sisältää 29187 ihmisen perimän antureista ja 1088 kokeellinen valvonta antureista. Yksityiskohtainen kuvaus microarray menettelyistä ja koko genomin geeni koetin luettelot ovat saatavilla http://www.phalanxbiotech.com/tech_support/general.php.

yli-ilmentyminen REG4

täyspitkä REG4 koodaava alue monistettiin PCR: llä käyttäen alukkeita luetellaan Materiaalit ja menetelmät S1, ja subkloonattiin p3XFLAG-CMV-7,1 (Stratagene, Santa Clara, CA) tai pcDNA3.1 (Invitrogen) vektoreita. REG4 konstruktit transfektoitiin väliaikaisesti PC3

shADAM9 lipofektamiinia 2000 (Invitrogen) noudattaen standardia protokollaa. Yliekspressoitu REG4 varmistettiin immunoblottauksella (R Alempi kuva: hiiri tuhoisa luun vaurio vasemman jalan eikä vaurio oikea jalka. (D) Histologinen kuvantamisen osoittavat, että molemmat trabekulaarisen ja kuoriluun korvattiin PC3

shGFP kasvain. Sen sijaan, trabekulaarisen ja kortikaalisen luun oli yhä koskemattomana PC3

shADAM9 kasvain (H 0,01) (Fig. 2e), mikä osoittaa, että hiljentäminen ilmentymisen ADAM9 vähensi kykyä eturauhassyöpäsolujen aiheuttaa osteoklastigeneesia luun.

kohdistaminen ADAM9 ilmentymisen kasvaimensisäistä toimitus shRNA vaimentaa eturauhassyöpä kasvua hiirissä

Sen tutkimiseksi, onko shRNA estoa ADAM9 ilmentymisen edustaa lupaavaa strategia eturauhassyövän geeniterapiaan, PC3-solut inokuloitiin subkutaanisesti kumpaankin paljaiden hiirien kylkiin. Kasvainten annettiin kasvaa kooltaan noin 200 mm

3. Kymmenen viisitoista hiiriä, jotka oli PC3 kasvaimia molempiin kylkiin valittiin saamaan sisäisen kasvaimen injektio 1 x 10

5 pmy lentivirusvektoreita (LV) kuljettavat shGFP (vasen site kylki) tai shADAM9 (oikea sivusto kylki) viikossa yhteensä 6 viikko (Fig. 3a), ja loput 5 hiiret toimivat kontrolleina vastaanottamalla PBS injektioita. Vähentynyt eturauhasen kasvaimen kasvua havaittiin käsitellyt kasvaimet LV-shADAM9 verrattuna hoidettiin LV-shGFP tai PBS (Fig. 3b). Keskimääräinen kasvaimen koko 6 viikon kuluttua hoidon PBS tai LV-shGFP oli 782,7 ± 174,6 mm

3 ja 1027 ± 272,2 mm

3, tässä järjestyksessä. Sitä vastoin, kasvainten koon, käsiteltiin LV-shADAM9 hoito oli 135,9 ± 72,4 mm

3. Taso ADAM9 ilmentymistä väheni käsitellyt kasvaimet LV-shADAM9 hoito, mikä vahvistetaan molemmat kudosvärjäyksellä (Kuva. S4d-f) ja immunoblottaus (Fig. 3c;

p

≤0.05).

(a) Kaavio ADAM9 knockdown hoitokoe. Hiiret injektoitiin ihonalaisesti PC3 solujen molempiin kylkiin ja kasvaimen koko mitattiin kahdesti viikossa kunnes koko oli noin 200 mm

3. Hiiret sitten sai injektioita joko PBS: ää kumpaankin tuumorikohdissa (n = 5) tai shGFP lentivirus vasemmalle puolelle kasvain ja shADAM9 oikeaan reunaan (n = 10). Virukset ruiskutettiin ja kasvaimet mitataan viikoittain 6 peräkkäisen viikon ajan. (B) jälkeen shADAM9 hoito, kasvainten ei kasvanut verrattuna shGFP hoito tai fosfaattipuskuriliuosta (**

p

≤0.01, Opiskelijan

t

testi). (C) Immunoblottaus määritystä ADAM9 ilmaisun vahvistaa väheni ADAM9 ilmaisun jälkeen shADAM9 hoidon. EF-1α käytettiin latauskontrollina (*

p

≤0.05; **

p

≤0.01, Opiskelijan

t

testi). (D) tilastollinen analyysi Ki67 värjäystä. shADAM9 hoito laski merkitsevästi solujen lisääntymistä toimintaa PC3 kasvaimia. PBS ja shGFP terapia havaittu eroa leviämisen indeksin (**

p

≤0.001, Yksisuuntainen ANOVA). (E) tilastollinen analyysi TUNEL värjäys osoitti merkittävää (NS) ero hoitojen (

p

≥0.05, Yksisuuntainen ANOVA).

Voit selvittää soluvasteita liittyy LV -shADAM9 hoito, kasvaimen leviämisen (Ki-67-indeksi, Fig. S4g-i) ja apoptoosin merkki värjäytymistä (TUNEL indeksi, Fig. S4j-l) tuumorisektioiden tehtiin. Emme löytäneet merkittävää eroa apoptoottisten solujen määrässä verrokeilla ja LV-shADAM9 (Fig. 3e ja Fig. S4j-l). Sitä vastoin hoito LV-shADAM9 johti dramaattiseen laskuun määrän Ki-67-positiivisia soluja verrattuna sekä PBS ja LV-shGFP hoitoja (Fig. 3d ja Fig. S4g-i). Nämä tiedot osoittivat, että

in vivo

toimituksen LV-shADAM9 tehokkaasti taantuu kasvaimen kasvua estämällä solujen lisääntymisen sijasta induktion apoptoottisen solukuoleman.

Knockdown ADAM9 indusoi solukierron pysähtymisen klo G1 /S Transition stressiolosuhteissa

määritellä tarkemmin mekanismi LV-shADAM9 terapia aiheuttama kasvaimen kasvun estäminen, solusyklin jakautumista ADAM9 taitava PC3

shGFP ja ADAM9 puutteesta PC3

shADAM9 soluja viljellään seerumin nälkään tai seerumi-täydennetty (5% FBS) olosuhteita analysoitiin. Vaikka PC3

shGFP ja PC3

shADAM9, normaaleissa olosuhteissa, ei osoittanut muutosta solusyklin profiilit, S-vaihe väestö väheni huomattavasti ajan (24-48 tuntia) seerumin puutteessa PC3

shADAM9 soluissa verrattuna PC3

shGFP. Vähennys mukana suuremman prosenttiosuuden soluja G1 vaiheessa (Fig. 4a). Samanlainen tulos saatiin käyttämällä LNCaP-soluja (Fig. 4b). Lisäksi immunoblottaus tutkimukset G1 /S siirtyminen liittyviä proteiineja paljasti merkittävästi suuremman p21

CIP1 /WAF1. Lisäksi alhaisempi sykliini D1 aiheutettiin PC3

shADAM9 kuin PC3

shGFP alle seerumistarvaatio olosuhteissa (Fig. 4c). Vaikka seerumistarvaatio ei aiheuttanut lisämuutoksia ilmentymistason p27

Kip1 joko PC3

shADAM9 tai PC3

shGFP, pohjapinta taso p27

Kip1 oli suurempi PC3

shADAM9 . Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että altistuminen PC3

shADAM9 seerumin nälkään aikaansaa G1 solusyklin pysähtymiseen. Lisääntynyt ilmaisuja p21

CIP1 /WAF1and p27

Kip1 havaittiin myös LNCaP

shADAM9 normaaleissa viljelyolosuhteissa (Fig. 4d).

Starvation vähensi S-vaiheen solupopulaation ADAM9 knockdown syöpäsolujen verrattuna valvonnan PC3 (a), LNCaP (b). (C) Expression tasoja p21

CIP1 /WAF1, P27

Kip1, ja sykliini D1 kasvoi shADAM9 soluja nälkään stressiä olosuhteissa PC3-soluissa. (D) Expression tasoja p21

CIP1 /WAF1 ja p27

Kip1 kasvoi LNCaP

shADAM9 sekä tavanomaisissa ja nälkään olosuhteissa.

Koska meidän aiempaan toteamukseen ADAM9 on stressiä reagoiva proteiini, joka voi tukea eturauhassyövän solujen eloonjäämistä ja etenemisen voimakkaassa oksidatiivisen stressin olosuhteissa [13], [19], etsimme onko seerumistarvaatio, joka on

in vitro

ehdolla, että jäljittelee vihamielinen kasvain microenvironment [16], [19], voivat aiheuttaa solunsisäisessä oksidatiivista stressiä, joka ADAM9-vajaiden solujen ei voittaa. Olemme havainneet kasvu endogeenisen superoksidi tasoilla sekä PC3

shGFP ja PC3

shADAM9 soluja 24 tunnin kuluttua seerumistarvaatio verrattuna soluihin kasvatettu seerumia täydennetty olosuhteissa mitattuna elävien solujen kuvantamisen kanssa MitoSox punainen fluoresoiva koetin ( kuva 5a) sekä virtaussytometrialla fluoresoivalla värillä, dihydroethidium (DHE) (Fig. 5b). Erityisesti PC3

shADAM9 näytteillä huomattavasti korkeampi superoksidi sisältöä kuin PC3

shGFP, joko perustaso tai aiheuttama seerumistarvaatio. Sen sijaan ei tason muutoksista solunsisäisen vetyperoksidin löytyivät joko PC3

shGFP tai PC3

shADAM9 soluja, analysoituna virtaussytometrialla DCFH-DA koettimia (Kuva. 5c). Nämä tiedot osoittavat, että seerumistarvaatio aiheuttama oksidatiivinen stressi eturauhassyöpäsoluissa välittyy, ainakin osittain, kautta superoksidi mutta ei vetyperoksidi, samanlainen tulos edellisessä havainnon ionisoivaa säteilyä aiheuttaman reaktiivisen hapen (ROS) sukupolven [16 ].

(a) PC3

shGFP ja PC3

shADAM9 soluja viljeltiin joko 5% FBS: ää tai alle seerumistarvaatio 24 tuntia, minkä jälkeen käsittelemällä 0,5 uM MitoSOX fluoresenssi. Equal fluoresenssin intensiteetti käytettiin kussakin kuvien ottamista varten kvantifiointiin superoksidi tasoilla.