Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Aktiviinilla reseptori 2 (

ACVR2

) on yleisesti mutatoitunut mikrosatelliitti epävakaa (MSI) paksusuolen syöpiin, mikä proteiinia menetys, signalointi häiriöitä, ja suurempia kasvaimia. Täällä tutkimme activin signalointi häiriöitä mikrosatelliitti vakaa (MSS) paksusuolen syöpiin.

Methods

Viisikymmentäyksi väestöpohjainen MSS koolonsyöpien arvioitiin ACVR1, ACVR2 ja pSMAD2 proteiinia. Consensus mutaatio altis osat

ACVR2

sekvensoitiin primaarisyöpien ja kaikki eksonit paksusuolen syöpäsolulinjoissa. Loss Heterotsygoottisuuden (LOH) arvioitiin

ACVR2

ja

ACVR1

, ja

ACVR2

promoottori metylaation metylaatiospesifistä PCR ja bisulfiitti sekvensointi ja kromosomi epävakaus (CIN) fenotyyppi kautta loisteputki LOH-analyysi 3 päällekkäisiä merkkejä.

ACVR2

promoottori metylaatio ja ACVR2 ilmaisun arvioitiin koolonsyöpäsolulinjaa kautta qPCR ja IP-Western blotit. Re-ilmentyminen ACVR2 jälkeen demetylaatio 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa) määritettiin. Ylimääräinen 26 MSS koolonsyöpien arvioitiin ACVR2 menetys ja sen mekanismi, ja ACVR2 tappio kaikilla testatuilla syövistä korreloi kliinis kriteerit.

Tulokset

51 MSS koolontuumoreissa, 7 (14% ) menetti ACVR2, 2 (4%) ACVR1, ja 5 (10%) pSMAD2 ilmaisua. Ei somaattiset

ACVR2

mutaatioita havaittiin. Menetys ACVR2 ilmaisun liittyi LOH osoitteessa

ACVR2

(p 0,001) ja

ACVR2

promoottori hypermetylaation (p 0,05).

ACVR2

LOH, mutta ei promoottori hypermetylaation, korreloi CIN tila. Paksusuolen syöpäsolulinjoissa täysin metyloitu

ACVR2

promoottorin, menetys

ACVR2

mRNA ja proteiinin ilmentyminen palautettiin 5-atsa hoitoon. Menetys ACVR2 liittyi kasvuun ensisijainen paksusuolensyöpä tilavuus (p 0,05).

Johtopäätökset

Vain pieni osa MSS koolonsyöpien menettävät ilmaus aktiviiniin signalointi jäsentä. ACVR2 menetys tapahtuu läpi Loh ja

ACVR2

promoottori hypermetylaation, paljastaen erillisiä mekanismeja ACVR2 inaktivaatio sekä MSI ja MSS alatyyppejä paksusuolensyöpä.

Citation: Jung B, Gomez J, Chau E, Cabral J, Lee JK, Anselm A, et al. (2009) aktiviinin Signaling mikrosatelliitti Stable koolonsyöpien häiriintyy yhdistelmällä Genetic ja Epigeneettiset mekanismit. PLoS ONE 4 (12): e8308. doi: 10,1371 /journal.pone.0008308

Editor: Irene Oi-Lin Ng, The University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 18 kesäkuu 2009; Hyväksytty: 20 marraskuu 2009; Julkaistu: 14 joulukuu 2009

Tämä on avoin-yhteys artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Public Domain ilmoitus, jonka mukaan, kun se on saatettu julkisia, tämä työ saa vapaasti kopioida, levittää, lähetetään, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta.

Rahoitus: tukemana UCSD Academic senaatin BJ, Yhdysvaltain Public Health Service DK074019 BJ; DK067287, VA Research Service, ja American Cancer Society Institutional Research Grant # 70-002 ja J.M.C. ja UCSD Digestive Diseases Research Development Center (DK080506). DNA: n sekvensointi suoritettiin DNA Sequencing resurssin, UCSD Cancer Center, joka rahoitetaan osittain NCI Cancer Center Support Grant # 2 P30 CA023100-23. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Colon syövistä suurtaajuus mikrosatelliittien epävakaus (MSI-H) liittyvät mutaatiot useita geenejä koodausvälineillä toistuvat sekvenssit, kuten

transformoivan kasvutekijän β reseptori 2 (TGFBR2) B ja

aktiviiniproteiinien tyypin 2 reseptorin (ACVR2) B [1] – [3]. Mikrosatelliitti vakaa (MSS) koolonsyöpien on ehjä DNA mismatch korjaus, mutta hautoisi

TGFBR2

kinaasialue mutaatioita [4]. Muita komponentteja TGFp kanoninen signalointi cascade, kuten Smad2 ja Smad4 esitetään erityisesti inaktivoitu muutamissa koolonsyöpien [5] – [7]. Systemaattinen inaktivointi TGFp sisaren koulutusjakson, aktiviini, ei ole täysin selvitetty MSS paksusuolen syövissä.

Aktiviinilla on jäsen TGFp superperheen joka säätelee solujen erilaistumista monissa kudoksissa [8]. Samanlainen kuin TGF, aktiviini käytetään kahta solun pinnan reseptoreihin, aktiviini-reseptori 1 (ACVR1) ja aktiviini-reseptori 2 (ACVR2), jota seurasi Smad aktivointi. Toinen tyyppi 2-reseptorin, ACVR2B, ei voi korvata toimintoja ja signalointi ACVR2 [9].

ACVR2

havaittiin mutatoitu useimmissa MSI-H paksusuolen ja peräsuolen syöpiä [10], [ ,,,0],11], mikä johtui lähinnä lukukehyksen A

8 suolikanavan eksoni 10. palauttaminen activin signalointi ja kasvun hidastuminen esiintyy vastauksena

ACVR2

täydentämisen avulla in

ACVR2

-mutant paksusuoli syöpäsolut [12], [13]. Olemme aiemmin osoittaneet tiheä

ACVR2

mutaatioita MSI-H koolonsyöpien yhdessä menetykseen ACVR2 proteiinin ilmentymisen [2] ja yhdessä suurempien koolontuumoreissa ja huonompi histologinen [14]. Lisäksi löysimme osajoukko MSS koolonsyöpien joka menetti ACVR2 ilmaisun [2], muistuttaa

TGFBR2

menetys löytyy MSS koolonsyöpien [4].

Tässä tutkimuksessa selvitimme aktiviini signalointireitin häiriöitä ja mahdollisia mekanismeja ensisijainen MSS paksusuolisyövän yksilöitä ja koolonkarsinoomasoluissa. Olemme havainneet, että menetys ACVR2 ilmentymisen tapahtuu osajoukko MSS kasvainten, joka liittyy usein säilytetään pSMAD2, seuraava alavirtavaikuttajainhibiittorit sekä TGFp ja aktiviini signalointia. Toisin kuin TGFBR2, ACVR2 tappio MSS kasvaimissa tapahtuu yhdistämällä LOH osoitteessa

ACVR2

ja erillisiä

ACVR2

promoottori metylaatio, mutta ei geneettinen mutaatio. Vuonna koolonsyöpäsolulinjaa, mekanismit ACVR2 menetys myös eroteltava mukaan microsatellite tila, jossa MSI-H solulinjat osoittavat

ACVR2

polyadenine suolikanavan mutaatio ja MSS koolonkarsinoomasoluissa osoittavat promoottorin hypermetylaatio. Siten osoitamme, että häiriöt aktiviinin signalointi tapahtuu MSI ja MSS paksusuolen syöpien erilliset mekanismit, paljastaen activin signalointi tärkeänä tavoite kaksi yleisintä genomista alatyyppejä paksusuolensyöpä.

Tulokset

aktiviiniproteiinien signalointireitin jäsenet ovat kohdennetut inaktivoimiseksi lomakelajitelmana Primary MSS koolonsyöpien

aikaisemmat tiedot osoittivat ainakin osittain menetetyksi ACVR2 proteiinin ilmentymisen osajoukko ensisijainen MSS paksusuolisyövän yksilöitä huolimatta villityypin

ACVR2

polyadenine kirjoitusten [2]. Tutkimme tätä pidemmälle ja pyrittiin määrittämään ekspressiomalleja molempien ACVR2, ACVR1 sekä sen alavirtavaikuttajainhibiittorit, pSMAD2, 51 eri ensisijainen paksusuolensyöpä yksilöt mikrosatelliittimerkkien vakaa genomista taustoja saadaan samasta kohortin North Carolina Colon Cancer Study (NCCCS ) [15], [16]. Vaikka ACVR1 reseptorin ilmentymisen hävisi vain 4% (2/51) potilaan kasvaimen yksilöt (kuvio 1AB, ylärivi), tappio ensisijainen reseptori, ACVR2, esiintyi 14% (7/51) (Kuva 1CD, keskimmäinen rivi). Lisäksi menetys pSMAD2 ilmaisun myötävirtaan ACVR2 ja ACVR1 aktivaatio aktiviinin esiintyi 10% (5/51) testatuista tapauksista (kuva 1EF, alin rivi), ja oli yleisesti havaittu kasvaimia paljastamaan täysin ilmaista reseptoreihin (taulukko 1).

immunohistokemiallinen analyysi parafinoidut ensisijainen paksusuolen syöpiä arvioidaan ekspressio kohdeproteiinin (ruskea) verrattuna viereiseen normaaliin kudokseen. A ja B (Ylärivi): ACVR1 ilmentyminen on menetetty osajoukko MSS kasvaimia. Esimerkki kasvain ilmentymistä sekä normaaleissa että paksusuolen kasvainkudoksen (vasen paneeli) ja valikoiva menetys osajoukko kasvaimia, mutta ei vieressä on normaalia koolonin kudokseen (oikea paneeli). Kaiken ACVR1 menetys havaittiin 2/51 tai 4% kaikista MSS koolonsyöpien analysoitu. C ja D (Keskirivi): ACVR2 ilmentyminen on menetetty osajoukko MSS kasvaimia. Kaksi esimerkkiä selektiivisen menetyksen ACVR2 paksusuolen kasvaimen, mutta ei normaalissa paksusuolen kudoksessa (vasen ja oikea paneeli) esitetään. Kaiken ACVR2 menetys havaittiin 7/51 eli 14% kaikista MSS koolonsyöpien analysoitu. E ja F (Alarivi): pSMAD2 ilmentyminen on menetetty osajoukko MSS kasvaimia. Esimerkki ilmentymisen sekä normaaleissa ja paksusuolen kasvainkudoksen (vasen paneeli) ja valikoiva menetys osajoukko kasvaimia, mutta ei normaalissa paksusuolen kudoksessa (oikea paneeli). Kaiken pSMAD2 menetys havaittiin 5/51 eli 10% kaikista paksusuolen syövistä analysoitiin.

Kaikki yksilöt menetys ainakin yhden activin reseptorireitin komponentti paljasti ilmentymä sekä täydellistä Smad2 ja TGFBR2 (taulukko 1, kuvio 2). Nämä tiedot viittaavat siihen, että ACVR2 proteiinin menetys on suurin levinneisyys MSS kasvaimia, jonka jälkeen pSMAD2 menetys, ja sitten ACVR1 menetys. ACVR2 tappio ja pSMAD2 tappio näyttävät esiintyvän täydentäviin alaryhmiin, mikä viittaa enemmän kuin yksi tavoite inaktivoivat aktiviinin signalointia MSS paksusuolen syöpiin. Toisaalta kaikki MSS paksusuolen syövän yksilöt activin signalointi komponentti menetys ilmaistaan ​​TGFBR2.

Niistä 51 MSS paksusuolen syövät päässä NCCCS kohortin testattu ACVR2 ja ACVR1 menetys, 8 paljasti menetys joko reseptorin (7 menetetty ACVR2 ja 2 menetti ACVR1 yhdellä kasvain menettää sekä, katso taulukko 1). Näistä 8, 1 menetetty pSMAD2. Ja 7 kasvaimia ACVR2 menetys, 3 paljasti LOH ja 3 oli selektiivinen ACVR2 promoottorin hypermetylaatio, kun taas mitään mutaatioita löydettiin tahansa kolmesta kinaasidomeenin kohteiden tai koodaus polyadenine suolikanavan eksonin 10, yleisesti mutatoituneet MSI paksusuolen kasvaimissa. Kumpikaan 2 kasvainten ACVR1 tappio paljasti Loh on

ACVR1

lokuksessa. Sitä vastoin on 43 ilmentävien kasvainten sekä ACVR2 ja ACVR1, 4 tai 9% kadonnut pSMAD2 ilmaisun säilyttäen koko Smad2 ja TGFBR2 ilmaisun korostaen menetys Smad2 fosforylaation valmiudet ylimääräisenä ensisijainen tapahtuma häiritä activin signalointi.

LOH, mutta ei mutaatio, liittyy menetys ACVR2 ilmentäminen Ensisijainen MSS Colon Cancer näytteet

sen arvioimiseksi, onko menetys reseptorin ilmentymisen johtui heterotsygotian menetys (LOH), yhteinen genomista mekanismi tuumorisuppressori inaktivaatiomenetelmät MSS paksusuolensyövät, me analysoitiin Loh on

ACVR2

ja

ACVR1

geenilokukset. Niistä 51 MSS kasvaimet tutkittiin, 4 paljasti alleeliset menetys. LOH osoitteessa

ACVR2

oli voimakkaasti yhteydessä menetys ACVR2 proteiinin ilmentymisen (p = 0,006, Fisherin testiä), ja 3/7 (43%) MSS kasvainten menetyksen ACVR2 proteiinin ilmentymisen osoitti myös LOH (kuva 2), verrattuna 1/44 ACVR2 ilmentäviä kasvaimia. Ei LOH löydettiin

ACVR1

lokukseen joko ACVR1 ilmentävät tai ei-ilmentäviä kasvaimia. Tarkempia ACVR2 ilmaisu korrelaatio Loh, laajensimme määrää potilaan kasvainten 51-77 näytteitä, joka paljasti 5 ylimääräistä kasvaimista ACVR2 proteiinin tappion, jolloin kokonaismäärä on 12/77 tai 16% (taulukko 2). Tässä laajennettu ryhmässä, 6/12 (50%) ja MSS kasvainten ACVR2 tappio osoitti LOH (taulukko 2).

sitten sekvensoitiin koodaus mikrosatelliittimerkkien sekä 3 erillistä kriisipesäkkeisiin kinaasi verkkotunnus

ACVR2

(sukua vastaava mutaatioita

TGFBR2

in MSS kasvaimissa) [4]. On huomattava, että eksoni 10 A

8-suolikanavan

ACVR2

piilee kinaasidomeeni tämän reseptorin, ja lukukehysmutaatioita sekä muita mutaatioita kinaasidomeenissa poistaa fosforyloivan kapasiteetti ACVR2. Havaitsimme kuitenkin, ei kasvaimen spesifisten mutaatioiden vastaava menetys ACVR2 proteiinin ilmentymisen. Nämä tiedot viittaavat siihen, että muut inaktivoivan mekanismien rooli menetys ACVR2 ilmaisun.

ACVR2

Promoottori hypermetylaation liittyy menetys ACVR2 ilmentäminen Ensisijainen MSS Colon Cancer näytteet

tutkia, epigeneettiset muutokset liittyvät ACVR2 ilme menetys, arvioimme, onko

ACVR2

promoottori hypermetyloitunut paksusuolisyöpäkudoksessa verrattuna normaaliin ja jos on, onko tietty mety-

ACVR2

korreloi ACVR2 proteiinia tappio ensisijainen MSS paksusuolisyövän yksilöitä. Alussa jaettu

ACVR2

promoottori kolmeen alueeseen, alue 1 (142–603), region 2 (-607–958), ja alue 3 (-958–1484). Meidän bisulfiitti sekvensointi tulokset osoittivat, ettei metylaation alueella 1 ja minimaalinen metylointi alueella 2, mutta 46 CpG dinukleotideissä välillä on -958–1484 nukleotidin suhteessa transkription aloituskohdasta (alue 3) (kuvio 3A) on metyloitavaa sekä solulinjat ja kliinisissä näytteissä (kuvio 3B), joka ei vastaa viereisen normaalin kudoksen (tuloksia ei ole esitetty). Johtuen vaikeudesta monistamiseen suurempia amplikonien välillä parafiiniin kudoksesta DNA, teimme metylaatiospesifisen bisulfiitti sekvensoinnin hieman pienempi alue (-603–1297 kannat) on

ACVR2

promoottori kliinisistä näytteistä.

A) ACVR2 promoottorin kartta paikannus MSP-alukkeiden B) käyttäen CpG-saarekkeiden hakuohjelma tunnistimme CpG saarilla

ACVR2

promoottori perustuu seuraaviin tiukat kriteerit: ~CG prosentuaalinen 55%; havaittujen CpG /odotetaan CpG 0,65; pituus 500 emäsparia. Kaikki CpG-sekvenssit edustavat pystypalkki poikki vaakasuora viiva kuvaa promoottorisekvenssin. Jokainen ympyrä alapaneelia havainnollistaa yksittäisen CpG sivusto vastaa pystypalkit kuvattu yläpaneeli. Perustuu bisulfiitti sekvensointi, kukin CpG pisteytettiin kvantitatiivisesti 100% metyloituja (tummia), 50% metyloituja (tummanharmaa ympyrät), 50% metyloituja (vaaleanharmaa ympyrät) tai metyloimattomia (valkoiset ympyrät). Kuten on osoitettu, 3 7 ACVR2-negatiivinen CRC osoitti täydellistä metylaation kriittisen alueen ACVR2 promoottorin, kun taas yksikään ACVR2 ilmentävien kasvainten havaittu mitään näyttöä korkea /täydellinen metylointi ACVR2 promoottorin. Metylointi kuvio samanlainen kuin in ACVR2 negatiivinen paksusuolen syöpiä havaittiin MSS koolonisyöpäsolulinja HT29 perimän DNA: HT-29 mahdollistaa sekvensoinnin hieman suurempi alue

ACVR2

promoottori. C) Kuusi koolonsyöpäsolulinjoissa eri microsatellite epävakaus taustat (katso taulukko 3) analysoitiin ACVR2 proteiinin ilmentymisen käyttäen immunosaostustekniikoilla. Kahta solulinjaa HCT116 (MSI koolonisyöpäsolulinja bialleelisilla lukukehysmutaatioita on

ACVR2

) ja MSS koolonisyöpäsolulinja HT29 (jossa

ACVR2

promoottorin hypermetylaatio), paljasti menetys ACVR2 proteiinin ilmentymiseen. D) menetys ACVR2 proteiinin ilmentymisen korreloi lasku ACVR2 mRNA transkriptio kautta kvantitatiivinen PCR HT29 verrattuna ACVR2 ilmentävää solulinjaa FET käyttämällä GAPDH standardisoinnin. Tämä koe suoritettiin kolme kertaa kolmena kappaleena, ja pylväskaavio edustaa yhtä kokeilu * osoittaa tilastollisesti merkitsevä ero, jonka p 0,001. E) ACVR2 -proteiiniekspressio uudelleen käyttöön seuraavat demetylaatio hoidon 5’Aza.

ACVR2 ei-ilmentäviä ensisijainen paksusuolen syövät alkuperäisen näytteen koko 51 MSS kasvaimia, 3/7 syövät osoitti täydellinen metylointi (100% metyloituja alleeleja) sisällä alueella 3

ACVR2

promoottorin, kun taas yksikään 13 ACVR2 ekspressoivat ensisijaisesti paksusuolen syöpien kudoksissa määritettiin osoitti täydellisen

ACVR2

metylaatio, joka tukee kausaalinen rooli metylaatio ja puute ACVR2 ilmaisun (p = 0,03, Fisherin eksakti testi) (taulukko 2, kuvio 3B). Bisulfiitti sekvensointi tulokset olivat yhdenmukaisia ​​MSP havainnot (tietoja ei esitetty), jossa 3/7 ACVR2-negatiivinen CRC osoitti, että läsnä spesifisesti metyloituja alleeleja. Vaikka alhainen metylaatio ( 50% metyloituja alleeleja) löydettiin myös 7/13 ja ACVR2 ilmentävien CRC, yksikään CRC osoitti täydellistä metylaatio tahansa CpG-dinukleotidejä, joka oli yhdenmukainen mahdollistaa ACVR2 ilmentymistä näissä kasvaimissa ( Kuva 3B).

ACVR2

Promoottori hypermetylaation korreloi ACVR2 transkriptio ja Protein Expression in koolonsyöpäsolulinjaa

vahvistavat havaintomme kliinisistä näytteistä

in vitro

, arvioimme mekanismit

ACVR2

tappio koolonkarsinoomasoluissa linjat, jotka perustuvat microsatellite epävakautta. Testasimme 3 MSI-H ja 3 MSS paksusuolisyövän solulinjoja: 1) mutaatio koodaus polyadenine ruoansulatuskanavan eksonin 10

ACVR2

, 2)

ACVR2

promoottorin hypermetylaatio, 3) määrälliset RT-PCR

ACVR2

mRNA, ja 4) ACVR2 proteiinin ilmentymisen immunosaostuksella. Kuten aikaisemmin ilmoitettiin [2], [12], kaksialleelisten mutaatio polyadenine suolikanavan

ACVR2

(A

8 A

7) MSI-H koolonisyöpäsolulinja HCT116 aiheuttavat tappiota of ACVR2 proteiinia (kuvio 3C ja taulukko 3).

MSI-H solulinjoissa SW48 ja RKO, ACVR2 proteiini on läsnä, koska se on MSS koolonsyöpäsolulinjaa Caco2 ja FET ( kuvio 3C). Sekä RKO ja SW48 sisältää heterotsygoottinen mutaatio

ACVR2

, paljastaen villityyppisen

8 sekä Mutanttialleelit (taulukko 3). A

8

ACVR2

alleeli sallii sellaisten ACVR2 proteiinia. MSS koolonisyöpäsolulinja HT29 ilmaisee alentuneesta ACVR2 mRNA ja proteiini (kuvio 3C, D ja E), toisin kuin sen MSS kollegansa Caco2 ja FET, joista kumpikaan ei sataman tahansa eksoni

ACVR2

mutaatio (tuloksia ei ole esitetty ). HT29 paljasti selvä

ACVR2

promoottori hypermetylaation kuvio (kuvio 3B) yhdessä mRNA ja proteiini menetys, mikä viittaa siihen, että tämä erityinen metylaatiokuvion aiheuttaa menetyksiä

ACVR2

ilme. Demetylaation

ACVR2

promoottorin 5-atsa johti uudelleen käyttöön ilmentyminen ACVR2 mRNA: ta ja proteiinia (kuvio 3D ja E). Me tehnyt myös näytön 11 koolonsyöpäsolulinjaa joko MSI (DLD1, HCA7, HCT15, LoVo, LS174, SNU175, SNU407), tai MSS (SNU81, SNU503, SW480 ja T84) taustat paljastaa samalla tasolla ACVR2 mRNA ja perustamisesta HT29 koska ainoa havaittu MSS paksusuolisyövän malli selvä ACVR2 menetys.

korreloivat ACVR2 ilmaisutapoja kasvaimen kokoa, laatu ja vaihe, olemme analysoineet laajennettu joukko 77 kasvaimia, jotka sisälsivät 12 kasvaimista ACVR2 tappio ( Taulukko 2). Näistä 69 oli tietoja sukupuoleen ja rotuun, 46 kasvaimen tilavuus, 59 kasvainten vaiheessa, ja 65 asteen (katso taulukko 4) mahdollistaa subanalyses. Sukua MSI-H paksusuolen syöpiä [14], menetys ACVR2 ilmaisun korreloi suurempi kasvaimia (p = 0,024), kun taas vaiheessa ei ollut vaikutusta verrattuna ACVR2 ilmentävien kasvainten (taulukko 4). Tämä yhtäläisyyksiä aiemmat löydös MSI-H paksusuolensyövät, jossa menetys ACVR2 proteiini liittyi suurempi, huonosti eriytetty kasvaimia vaiheessa riippumaton muoti [14].

Suoritimme sitten genomista alatyyppi analyysi kaikista ACVR2 ei-ilmentäviä syöpiä ja totesi, että puute kromosomaalisen epävakaus (CIN) fenotyyppi korreloi

ACVR2

promoottori hypermetylaation (taulukko 2), mikä viittaa siihen, erillinen väyliä MSI- /LOH + ja MSI- /LOH – paksusuolen syöpiä.

yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että kliinis-patologisten vaikutusten ACVR2 proteiinin menetys voi olla samanlainen molemmissa MSI ja MSS kolorektaalisyövissä huolimatta erilaisista taustalla olevien mekanismien menetyksen, syytetään ACVR2 menetys on tärkeä askel koolonin karsinogeneesissä.

keskustelu

Häiriöt aktiviiniin signalointi on yleinen MSI-H koolonsyöpäsolulinjaa mutaation kautta on

ACVR2

yhdessä sen polyadenine kirjoitusten [10] ja aiheuttaa ACVR2 proteiini [2]. Menetys ACVR2 proteiinin ilmentyminen havaittiin myös pienessä määrässä MSS koolonsyöpien [2]. Täällä me arvioida esiintyminen ja mekanismi häiriintyy aktiviinin signaloinnin MSS koolonsyöpien ja osoittaa, että activin signalointi on suunnattu häiriöitä useilla tasoilla MSS koolontuumoreissa. Yleisimmin,

ACVR2

ilmentyminen menetetään yhdistelmän avulla LOH ja epigeneettisten hiljentäminen

ACVR2

promoottori. Nämä havainnot korostettaisiin kumotaan aktiviinin signaloinnin paksusuolen kasvainten synnyssä, koska sen häiriöitä esiintyy sekä MSI ja MSS alatyypit paksusuolensyöpä erilaisin erilliset mekanismit.

MSI-H paksusuolensyövät, sekä TGFp ja aktiviini kumonnut johtuen lukukehysmutaatioita että tyypin II reseptori [2], [17]. Menetys molempien signalointireittien voi olla edullista kasvaimen kasvua [12], [18]. Sekä TGF ja activin käyttää samoja solunsisäisiä Smad proteiineja (Smad 2 ja 3) lähettävät signaalia. Olemme aiemmin havaittu yli 50% päällekkäisiä

ACVR2

ja

TGFBR2

mutaatioita ensisijainen MSI koolontuumoreissa [2], mahdollisesti koska additiivisten vaikutusten välittämisessä kasvureaktio, jotka ovat parhaillaan tutkittavana .

näyttää siltä, ​​että MSI koolonsyöpien

ACVR2

mutaatiot voivat esiintyä aikaisin kasvainten synnyssä ja niihin liittyy lisääntynyt paikallinen kasvu [14]. Vuonna MSS paksusuolensyövät menetys ACVR2 korreloi suurempia kasvaimia, sopusoinnussa häiriöitä aktiviiniin aiheuttama kasvun hidastuminen. Ajoitus

ACVR2

mutaatioita MSI paksusuolen syöpä voi olla samanlainen kuin

TGFBR2

jossa lukukehysmutaatioita esiintyy korkea dysplasiaa rajapinnassa maligniteetin [17].

osoittavat, että MSS koolonsyöpien vähintään kolme jäsentä aktiviinin signalointiryöpyn, ACVR2, ACVR1, ja pSMAD2 hajotetaan. Merkittävä alaryhmä paksusuolen kasvaimista näkyy laskua fosforyloidun Smad ehjät ACVR2 ja TGFBR2, osoittaa erillinen ensisijainen tapahtuma alavirtaan ensisijaisen reseptoreihin. Yksi kadotessa ACVR1, ACVR2 ja pSMAD2 havaittiin, joka oli TGFBR2 värjäytymistä positiivinen (taulukko 2). Tämä voi johtua ensisijainen inaktivoitumisen pSMAD2 ja erillinen kohdentaminen sekä aktiiviinimolekyylien reseptorien, tai IHC positiivinen katkaistun TGFBR2, mikä pSMAD2 menetys. Vaikutus menetys monipistemittaus saman signalointi cascade vielä huolellisesti tutkia ja ehdottaa erillistä osaa jokaisen jäsenen.

Olemme havainneet LOH klo

ACVR2

locus 6%: MSS paksusuolen kasvaimet, kasvaa 50% kasvaimista menetys ACVR2 proteiinin ilmentymisen. Tämä yleinen määrä on hieman pienempi kuin taajuus

ACVR2

LOH raportoitu aiemmin kohortin tuntemattomalla

ACVR2

tila [19], vaikka olemme aiemmin havaittu kohortti-riippuvainen taajuuksien ACVR2 lauseke voi olla vaihe tai rotu-riippuvainen [14].

mutaatioanalyysiin keskittynyt kuormittajat sukua syyllistyneitä inaktivoituminen

TGFBR2

kinaasialue inaktivaatio [4], mutta emme löytäneet kasvaimeen liittyviä mutaatioita, kun sekvensoidaan kaikkien eksonien ACVR2 ilmentävät ja ei-ilmentävät koolonsyöpäsolulinjoissa. On mahdollista, että mutaatiot ulkopuolella kuormittajat voivat edistää menetys ACVR2 perusterveydenhuollossa paksusuolensyöpä yksilöitä, vaikka valossa näyttöä LOH sekä epigeneettiset vaiennettu, tämä on todennäköisesti vähemmän tärkeä tuumorigeenistä mekanismi. Se voi kuitenkin olla tärkeä rooli kolmen kasvaimien menetys ACVR2 jossa löysimme geneettistä tai epigeneettiset mekanismi suoraan selittää, että menetys.

Tämä on ensimmäinen raportti, jossa kuvataan ACVR2 tappio MSS koolonsyöpien ja

ACVR2

promoottori hypermetylaation mekanismina, kontrasteja ja mekanismeja

ACVR2

tappio MSI koolonkarsinoomasoluissa [12]. Sekä ensimmäisen MSS paksusuolen kasvaimissa ja HT29 koolonkarsinoomasoluissa, alueen promoottorin hypermetylaatio, joka liittyy menetys

ACVR2

ilmaisu on nukleotidien -1297–958. Niistä geenit, jotka ovat kohteita epigeneettisiä hiljentämiseltä

hMLH1

on parhaiten tutkittu metylaation, ja on ehdotettu, että promoottorialueen lähellä transkription aloituskohdasta (TSS) on kriittinen transkription hiljentämisen tämän geenin [ ,,,0],20]. On puute vastaavia tietoja useimpien muiden geenien, mutta

hMLH1

promoottorialue tietoja käytetään usein paradigman, ja uskotaan, että useimmat geenit, analyysi samanlainen promoottorialueen on kriittinen korreloida DNA: n metylaatio havainnot menetys geenin ilmentymisen. Tässä tutkimuksessa olemme analysoineet 1500 bp proksimaalisesti TSS, ja löysi hyvä korrelaatio

ACVR2

promoottori metylaatio (alueilla -958–1297) ja tappio proteiinin ilmentymisen IHC. Tuloksemme viittaavat siihen, että sen sijaan, että pelkästään läheisyys TSS, ero pääsy metylaatio co-aktivaattorit tai repressorit promoottorista määrää geenien, ja

ACVR2

tällainen alue voi tapahtua ylöspäin 900 bp TSS.

Olemme tietoisia, että kokonaismäärä MSS sairastavien potilaiden ACVR2 tappio jotka tutkittiin tässä tutkimuksessa ei ole suuri, mikä korostaa, että tämä on suhteellisen harvinaista tapahtumaa [15]. Emme aio määrittää yleinen taajuudet tällaisten tapahtumien, vaan osoittaa vaihtoehtoisen mekanismin ACVR2 proteiinin tappion MSS paksusuolen syöpiin. 51 ensisijainen, väestöpohjainen MSS kasvain näytteissä, 7 osoitti menetys ACVR2 ilmaisua. Noudattaen 51 aiheita on satunnaisesti poimittu kohortin, välillä 7% ja 21% MSS kasvaimia väestön pitäisi näyttää samanlainen menetys ACVR2 ilmaisun kanssa 95%: n luottamusväli (Clopper-Pearson tarkka luottamusväli). Kasvattaminen otoskoko 77 paljasti menetys ACVR2 in 12/77 tai 16% ja tilastollisesti merkitsevä korrelaatio menetyksen ACVR2 lisääntynyt kasvaimen kokoa. Lisäksi genomista alatyyppiä analyysi paljasti, että LOH osoitteessa

ACVR2

liittyi CIN fenotyypin, kun taas

ACVR2

hypermetylaation korreloi CIMP fenotyyppi. Vaikka nämä luokittelujen mahdollistavat ansioksi menetys

ACVR2

ilmaisua promoottori hypermetylaation ja /tai kromosomaalisia epävakaus kuin mekanismi MSS syövissä, vaihtoehtoisia mekanismeja kuten histonimodifikaation ja /tai MikroRNA voi olla leikkiä, etenkin LOH negatiivinen /metylaatio negatiivinen syöpiä. Tuloksemme kuitenkin osoittavat merkittävää korrelaatiota menetys ACVR2 ilmaisun ja LOH /epigeneettiset hiljentäminen. Näin tarjoamme todisteita olemassaolosta joko kromosomi epävakauden tai epigeneettisellä muuttaminen

ACVR2

paksusuolen syövän ja tunnistaa solun malli epigeneettisellä vaiennettu

ACVR2

. Koko kliinistä vaikutusta tämän datan edellyttää lisävahvistusta tulevissa tutkimuksissa suurempia potilaan näytteet.

Yhteenvetona menetys ACVR2, ACVR1 ja pSMAD2 ilmaus tapahtuu osajoukko MSS kasvaimia, ja todisteet tukevat että tämä tulokset kumoamisen normaaliin kasvuun tukahduttava aktiivisuus aktiviinin signalointi. Vähentynyt pSMAD2 liittyy yleisesti villityypin ACVR2 ja ACVR1. Mekanismit

ACVR2

tappio sisältää LOH osoitteessa

ACVR2

ja

ACVR2

promoottori hypermetylaation nukleotidien -1297 ja -958, jotka liittyvät CIN ja CIMP fenotyyppejä, vastaavasti. Menetys ACVR2 liittyy lisääntynyt kasvaimen kokoa. Siksi aktiviini signalointi voidaan inaktivoida erottuva mekanismeja MSI ja MSS paksusuolen syöpiin, mikä viittaa tärkeyttä tämän reitin säätelyssä colonocyte kasvuun.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tämä tutkimus suoritettiin periaatteiden mukaisesti ilmaistu Helsingin julistus. Tutkimuksen hyväksyi Institutional Review Board of University of North Carolina sairaaloissa. Kaikki potilaat kunhan kirjallinen lupa varten näytteitä osana alle IRB hyväksyminen osana North Carolina peräsuolen syövän Study (NCCCS) ks. Analyysi osana tätä tutkimusta oli täysin de-tunnistettu eikä tunnistetietoja ollut saatavilla PI, joten tämä tutkimus vapautettu erillistä lupaa.

Potilasnäytteet

Sporadic paksusuolen kasvaimia takautuvasti kerättiin alle IRB hyväksyminen osana North Carolina peräsuolen syövän Study (NCCCS), väestöpohjaisen, tapauskontrollitutkimuksessa käsittää 503 potilasta [15], [16]. Mikrosatelliitti-analyysi suoritetaan parafinoidut kudosta, kuten aiemmin on kuvattu [2], erottelevat kohortin osaksi 54 MSI-H, ja 449 MSS /MSI-L potilailla. Tätä tutkimusta varten 51 MSS potilaan näytteitä runsaasti kasvain ja normaali kudos valittiin satunnaisesti.

Solulinjat

MSI paksusuolen syöpäsoluissa linjat HCT116, SW48, DLD1, HCA7, HCT15, LoVo, LS174T, SNU175, SNU407, SW48, ja RKO, sekä MSS koolonsyöpäsolulinjoissa Caco2, HT29, SNU81, SNU503, SW480 ja T84 pidettiin Iscoven muunnettuun Dulbeccon alustaan ​​(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) ja FET olivat ylläpidetään F12 /Dulbecon Modified Eagles Medium olosuhteissa aiemmin kuvattu [12]. Kaikki solulinjat ovat saatavissa ATCC paitsi FET (ystävällinen lahja Michael Brattain, Medical College of Ohio, Toledo, OH) [21].

Tissue mikropreparoinnilla DNA Extraction, ja RNA

DNA formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettu materiaali uutettiin seuraavat mikrodissektion käyttäen Takara DEXPAT (Takara Bio Inc., Japani). Genominen DNA-solujen linjat saatiin käyttäen QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). RNA solulinjoissa saatiin käyttäen TRIzol reagenssia (Life Technologies Inc. Carlsbad, CA).

Vasta-aineet

Kanin anti-TyrGly mACVR2 (482-494) (antelias lahja W. Vale , Salk Institute), jossa on kohde-epitoopin C-päähän alueelle ACVR2 (yli tuloksena katkaisu peräisin Kehyksenvaihto eksonissa 10) käytettiin immunohistokemiaa kuten aiemmin on kuvattu [2], [12]; kanin anti-TyrGly ACVR1 (474-494) käytettiin 1:800; pSMAD2 (Cell Signaling) at 1:250; Yhteensä Smad2 (Epitomics) at 1:400; ja TGBR2-C16 (Santa Cruz) on 1:300.

immunohistokemiaallisesti ACVR1, ACVR2, pSMAD2, TGFBR2 ja Smad2 Protein Expression

Immunohistokemia suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [2]. Värjäys ryhmitelty menetys tai 0 (puuttuminen tai merkittävä lasku verrattuna viereiseen normaaliin kudokseen), vähentää tai 1+ (hienovarainen pieneneminen verrattuna viereiseen normaaliin kudokseen), ennallaan tai 2+ (ei muutosta verrattuna viereiseen normaaliin kudokseen), ja lisääntynyt tai 3+ (lisäystä verrattuna viereiseen normaaliin kudokseen). Kolme riippumatonta tutkijat sokeasti teki kaikki dioja. Kaikki kolme tutkijat oli oltava sopimuksen kasvain kutsua 0 tai menetyksen ilmaisun.

Heterotsygotian menetys (LOH) Analysis

Arvio LOH klo

ACVR2

ja

ACVR1

loci suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [22] käyttämällä 2 mikrosatelliittimarkkerin (D2S1353 ja D2S1399) reunustavan

ACVR2

[19] sekä geeninsisäinen merkkiaineena

ACVR1

(D2S2686) (katso taulukko S1).

CIN Analyysi

Analyysi CIN suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [23]. Lyhyesti, eteenpäin oligonukleotidialukkeita olivat fluoresoivasti leimattu FAM 5′-päässä (Applied Biosystems) ja joukko 6 polymorfisten mikrosatelliittimarkkerin (D5S346, D5S409 D17S261 D17S250 D18S81, D18S91, ja D18S69) (katso taulukko S1) käytettiin määrittämään LOH kromosomissa 5q, 17Q ja 18q.