PLoS ONE: Hes1 Kasvattaa Invasion Kyky peräsuolen syövän solut kautta STAT3-MMP14 Pathway

tiivistelmä

Notch polku myötävaikuttaa itseuudistumisen Kasvainten aloittamista solujen ja estämällä normaalin paksusuolen epiteelisolujen erilaistumista. Vapautettiin ilmaus Notch1 ja Jagged1 havaitaan peräsuolen syöpä. Karvainen /tehostajaa split (HES) perhe, kaikkein tunnettu kohteet Notch, mukana kehittämässä monien syöpien. Tässä tutkimuksessa selvitimme roolia Hes1 että kasvainten synnyssä paksusuolen syövän. Kaatamalla Hes1 aiheuttama CRC solujen vanhenemista ja vähensi hyökkäyksen kyky, kun taas yli-ilmentyminen Hes1 lisääntynyt STAT3 fosforylaatioaktiivisuuden ja säädelty MMP14 proteiinin tasolla. Me tutkia tarkemmin ilmaisun Hes1 ihmisen peräsuolen syövän ja todettu korkea Hes1 mRNA ilmentyminen liittyy huonon ennusteen CRC potilailla. Nämä havainnot viittaavat siihen, että Hes1 säätelee hyökkäyksen kyky kautta STAT3-MMP14 väylän CRC soluissa ja korkean Hes1 ilme on ennustaja huonoon ennusteeseen CRC.

Citation: Weng M, Tsao P, Lin H, Tung C , muutos M, Chang Y, et ai. (2015) Hes1 Kasvattaa Invasion Kyky peräsuolen syövän solut kautta STAT3-MMP14 Pathway. PLoS ONE 10 (12): e0144322. doi: 10,1371 /journal.pone.0144322

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 24 kesäkuu 2015; Hyväksytty: 15 marraskuu 2015; Julkaistu: 09 joulukuu 2015

Copyright: © 2015 Weng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Liver Disease Prevention Treatment Research Foundation, Taiwan, MTW. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on kolmanneksi yleisin syöpä [1] ja kirurginen resektio on tavallinen hoito alkuvaiheen CRC. Chemotherapies lukien oksaliplatiinia, irinotekaania, ja flouracil ovat villisti käytetään hoitamaan kehittyneen taudin [2]. Therapies vastaan ​​verisuonen endoteelin kasvutekijöiden tai niiden reseptorien, kuten bevasitsumabi [3], aflibersepti [4], ja regorafenib [5], pidentää elinaikaa potilailla, joilla on edennyt kolorektaalisyövissä. Huolimatta edistysaskeleet kirurginen asemointia ja systeemiset hoidot, mukaan lukien adjuvantti chemotherapies, monet potilaat edelleen kuolevat CRC, ja peräsuolen syöpä on neljänneksi syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti [1].

Genetic ja epigeneettiset muutokset ajaa aloittamista ja etenemistä adenooma-karsinooma-sekvenssin kolorektaalisyövässä [6] ja poikkeava aktivaatio Notch1 signalointi on yksi tunnistettu reitin [7, 8]. Notch signalointi edistää itseuudistumisen Kasvainten aloittamista solujen laajeneminen suolen progenitorivarastoon, ja estämällä normaalin paksusuolen epiteelisolujen erilaistumisen [9-11]. Notch signalointi aktivoidaan sitovat kaksi ryhmää ligandeja, Jagged (Jagged1, 2) ja Delta-, kuten (Dll1, 3, 4). Korkeampi ilmentyminen Notch1 ja Jagged1 mRNA: ta ja niiden proteiinit havaittiin CRC kudoksissa verrattuna viereiseen ei-kasvainkudoksessa [12]. Lisäksi Notch1 proteiinin ilmentyminen korreloi positiivisesti kasvaimen vaiheessa [12] ja patologia (suuri ilmentyminen Notch1 huonosti eriytetty syöpä) [8, 13].

Yksi tunnettu tavoitteet Notch on karvainen /tehostajana split (HES) perhe [14]. Tämä tavoite on lupaava asiakkuutta suolen kasvainten solujen erilaistumista [15]. Yliekspressio Hes1 on liittynyt kehittämiseen haiman [14, 16, 17], rintojen [18] ja munasarjojen [19] syöpien ja sen alassäätöä johtaa kiihtyi erilaistumista ja laski soluproliferaatiota useissa syövän malleissa [20, 21 ]. Tähän mennessä on ollut vähäistä tietoa Hes1 ilmaisun kolorektaalisyövässä [7, 22, 23]. Koska korkea Notch ilmentymistä havaitaan kolorektaalisyövässä ja liittyy kasvaimen vaiheessa olimme kiinnostuneita tietämään, onko Hes1 osallistuu kasvainten synnyssä paksusuolen adenokarsinooman.

Tässä tutkimuksessa selvitimme ilmaus Hes1 ihmisen peräsuolen syövän ja korreloi sen ilme kanssa kliinisiä tuloksia. Korkea Hes1 mRNA: n ekspressio on liitetty huonoon ennusteeseen CRC potilailla. Vuonna funktionaalisen analyysin, huomasimme, että suppressio Hes1 ilmaisun indusoi enemmän CRC solujen vanhenemista ja vähentää hyökkäys kyky CRC soluihin säätelemällä MMP14 ilme.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljelmät

Ihmisen 293-T-solujen ja koolonsyöpäsolulinjoissa: HCT116, Caco2 ja SW48 saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Ne pidettiin DMEM (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia ja 1% penisilliini /streptomysiiniä 100 ug /ml streptomysiiniä. Soluja kasvatettiin 37 ° C: ssa 5% CO2-atmosfäärissä kosteutetussa inkubaattorissa.

Reagenssit

Plasmidi EF.hHES1.Ubc.GFP ja plasmidi EF.deltaBHES1.Ubc.GFP hankittiin alkaen Linzhao Cheng laboratoriosta [24] kautta addgene Inc. (Cambridge, MA). Flag-Hes1 muodostettiin pilkkomalla EF.hHES1.Ubc.GFP BamHI: llä ja XhoI: llä, ja asettamalla pilkottu plasmidi monikloonauspaikkojen on pcDNA4-TAG-vektoriin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Stattic saatiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Ohjaus siRNA ja Hes1 siRNA saatiin Qiagen (Venlo, Alankomaat). Lipofetamine RNAiMAX (Invitrogen) käytettiin siRNA transfektioreagenssia. Protokolla tehtiin mukaisesti valmistajan ohjeiden lopulliseen konsentraatioon 10 nM.

Western Blot

Western blotit suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [24]. Ensisijainen käytetyt vasta-aineet olivat Hes1 (Millipore, Billerica, MA), MMP14 (Abcam, Cambridge, UK), STAT3, fosfori-STAT3 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), Flag ja Actin (Sigma-Aldrich). Sitten kalvot inkuboitiin tietyn ensisijaisen vasta-yössä, pestään, inkuboidaan sitten sopivan sekundäärisen vasta-aine konjugoituna piparjuuriperoksidaasiin, ja kehitettiin käyttäen ECL (PerkinElmer Life Sciences, Waltham, MA).

RNA ja reaali aika polymeraasiketjureaktio (RT-PCR) B

Kokonais-RNA potilaan näytteistä uutettiin RNA (Qiagen) kudoksesta homogenisoitiin Trizol (Invitrogen). Kokonais-RNA solulinjoissa uutettiin RNeasy Mini Kit (Qiagen). RNA käänteistranskriptio DNA käyttäen High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Expression of Hes1 ja MMP2, MMP3, MMP7, MMP-9 ja MMP14 mRNA arvioitiin käyttämällä Virta SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). GAPDH mRNA käytettiin endogeenista ohjaus. Ekspressio RNA analysoitiin käyttämällä 2-ΔΔCt menetelmällä. Alukkeet mRNA: n ekspression osoitettiin S1 taulukossa.

Proliferaatiomääritys

Solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT [3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5- difenyylitetratsolium-, Sigma-Aldrich Co.] määrityksessä.

in vitro invaasiomääritys

invasiivisia aktiivisuus mitattiin käyttäen kalvoa hyökkäyksen kulttuuri järjestelmä, jossa polykarbonaattimembraanille 8 um huokosia (Millipore , Billerica, MA) päällystettiin Matrigelillä (R 0,05, ** p 0,01, *** p 0,005).

heikentävien Hes1 geenin aiheuttama lisää CRC solujen vanhenemista

Se on raportoitu, että Hes1 tarvitaan palautuvuus solujen quiescence ja se estää ennenaikaista vanhenemista lepotilassa fibroblasteissa [25]. Me pudotti Hes1 vuonna SW48 ja Caco2 solujen ja havaittiin merkittävästi enemmän beeta-galaktosidaasin ilmentymisen Hes1 tippuu alas soluihin, mikä viittaa enemmän vanhenemista siinä Hes1depleted soluissa (kuvio 1 F ja 1 G).

Knockdown on Hes1 geenin pienenee invaasio kautta säännellään MMP14

Koska useat metalloproteinaasien (MMP: t) välittävät hyökkäys syöpäsolujen [26], tutkimme ilmaus paneelin MMP: iden koolonkarsinoomasoluissa upon Hes1 knockdown. Havaitsimme, että vain MMP14 ekspressiotaso laski upon Hes1 Knockdown mRNA tasolla Caco2 soluissa (kuvio 2A). Sitten löytyi knock-down Hes1 lukemiin MMP14 proteiinin tason lasku SW48 soluissa (kuvio 2B). Toisaalta yli ilmentyminen Hes1 johti kasvua MMP14 mRNA: n ilmentymisen (kuvio 2C). Me ektooppisesti ilmaisi mutantti HES1 geeni, joka kuljettaa katkaisu sen kuvaavaa, emmekä noudata kasvu MMP14 että HCT116 ja HT29 (kuvio 2C).

(A) sarja MMP mRNA ilmaisu upon siRNA Hes1 transfektiota Caco2 soluissa. (B) MMP14 proteiini vähennys upon siRNA Hes1 transfektion SW48 soluissa (C) MMP14 mRNA ilmaisun yhteydessä Hes1 ja mutantti Hes1 yli- ilmeneminen HCT116 ja HT29. (* P 0,05, ** p 0,01)

Hes1 säännelty MMP14 ilme riippuu STAT3 koulutusjakson

Kerrottiin, että Hes1 aktivoi signaalimuunta- ja aktivaattorit transkriptio 3 (STST3) koulutusjakson [27, 28], ja että STAT3 ohjaa MMP-1 ilmentymisen koolonkarsinoomasoluissa [29, 30]. Siksi arvioitiin, onko STST3 toiminta on rooli HES1 n asetus MMP14 paksusuolen syöpäsoluissa. Hes1 ehtyminen siRNA Knockdown pienentää MMP14 proteiinin ilmentymistä Caco2 ja SW48 soluja. Hes1 ehtyminen johti laskua STAT3 fosforylaation ja mitään muutosta koko STAT3 vuonna Caco2 ja SW48-soluissa (kuvio 3A ja 3B). Ektooppisesti ilmentämään FLAG-leimattua konstitutiivisesti aktiivinen STAT3 plasmidi, lisännyt MMP14 proteiinin tasot HCT116-soluissa (kuvio 3C ja 3D). Kohdunulkoinen yliekspressio Hes1 kasvoi MMP14 ilme sekä STST3 phosphyorylation että HCT116-soluissa. Lisäksi STAT3 fosforylaation ja MMP14 proteiinin ilmentyminen väheni, kun soluja käsiteltiin stattic, joka on STAT3 aktivointi inhibiittori (kuvio 3E ja 3F). Tulosten perusteella näyttää, että HES1 säätelevät MMP14 ilmaisun up säätelevä STAT3 aktiivisuuden koolonkarsinoomasoluissa.

Hes1 ja MMP14 ilmaisun eivät riipu kasvaimen vaiheesta

Kuten Notch1 ilmentyminen liittyy kasvaimen vaiheessa arvioimme ilmaus Hes1 ihmisen CRC kudoksissa. Analysoimme 74 pariksi ihmisen paksusuolen adenokarsinooma ja niiden vieressä ei ollut kasvainta paksusuolen kudokset National Taiwan University Hospital potilaan kohortin (taulukko 1). Olemme havainneet, että ilmentymisen taso Hes1 (kuvio 4A) tai MMP14 mRNA (kuva 4B) oli liity kasvaimen vaiheesta.

(A) Hes1 mRNA (

p

= 0,06, jonka Yksi tapa ANOVA) ja (B) MMP14 mRNA: n ilmentymisen (

p

= 0.60 yksisuuntaisella ANOVA) ei korreloi kasvaimen vaiheesta.

korkea ilmentyminen Hes1 CRC on liittyy lyhyempi selviytymisen

tutki tarkemmin sitä Hes1 ja MMP14 ilmaisuja korreloivat potilaan selviytymistä. Hes1 mRNA: n ilmentymisen ja MMP14 mRNA: n ilmentymisen korreloivat positiivisesti kasvainkudoksessa (korrelaatio coefficiency = 0,238, p = 0,035). Korkea Hes1 ilmentyminen kasvaimissa korreloi lyhyemmät elossaoloaika (kuvio 5A). Korkea MMP14 korreloi myös lyhyempi elinaika (kuvio 5B).

Potilaat jaettiin Hes1 /MMP14 matala ja korkea ryhmät perustuvat mediaani ERH /MMP14 ilmaisun ja niiden selviytyminen oli piirtämistä käyttäen Kaplan-Meier-analyysi ( uptick osoittaa sensuroinnin tapahtumia). (A ja B) CRC potilaan korkea Hes1 ja MMP14 ilmentyminen liittyy huono selviytymistä. (C ja D) Kun potilasryhmässä, jossa vaiheen I-III CRC, korkea Hes1 ja MMP14 ilmentyminen merkitsevästi yhteydessä huonoon säilymiseen. (E ja F) Kun potilasryhmässä, jossa vaiheen IV CRC, Hes1 ja MMP14 ilmaisua ei liity selviytymistä.

lisäksi ositettu näitä potilaita mukaan metastasoituneeseen sairauksia. Potilaille, joilla on varhainen tai paikallisesti edennyt sairaudet, korkea Hes1 tai korkea MMP14 ilmentyminen liittyi huomattavasti lyhyempi selviytymistä. Kuitenkin Hes1 ja MMP14 ekspressiotasot eivät liittyneet selviytymisen metastasoituneen sairauksia (kuvio 5C-5F). MMP on rooli syövän eteneminen ja metastaasit, se voi olla vähemmän ennustetekijöitä potilaille, joilla on kasvaimia, jotka oli jo etäpesäkkeitä diagnosointi.

Mukaan Coxin monimuuttuja regressioanalyysisarjoissa, Hes1 (HR, 2,41; 95% CI , 1,07-5,43) ja MMP14 (HR, 2,36; 95% CI, 1,02-5,46) jäi positiivisessa yhteydessä kuolemantapauksia peräsuolen syöpä. Etäpesäke oli myös merkitsevästi liittynyt (HR, 10,05; 95% CI, 4,11-24,60), jossa kuolemien kolorektaalisyövän (taulukko 2). Välisestä vuorovaikutuksesta Hes1 ja etäpesäkkeiden potilaista korkea Hes1 vielä oli lisääntynyt riski kuolla kolorektaalisyövän.

Keskustelu

homeostaasiin itseuudistumisen, lisääntymisen ja erilaistumisen kanta- ja progenitorisolujen säädellään Notch, WNT, FGF ja Hedgehog signalointireitteihin [31-33]. Suolistossa, nämä reitit ovat mukana myös Villi muodostumiseen ja peräsuolen kasvainten kehittymiseen [9, 34, 35]. Wnt-polku esittelee rajat sääntelyn vuorovaikutusta Notch polku [36, 37]. APC

Min (useita suoliston neoplasia) hiiriä, jossa APC-geeni kantaa tynkämutaation kodonissa 850 ja WNT polku on väärin säädeltyä, voi kehittyä satoja ohutsuolen ja paksusuolen polyypit [38]. Notch aktivointi on välttämätöntä koolonadenooma muodostumiseen APC

Min-hiirillä [10]. Esto Hes1 APC

Min-hiirillä on vähentynyt kasvainsolujen proliferaatiota ja se on johtanut kasvaimen solujen erilaistumista suolen epiteelisolujen [15].

Hes1 on tärkeä rooli CRC syövän synnyssä. Se sitoutuu suoraan promoottorin HATH1 geenin ja estää Hath1 ilmaisun [39]. Hath1 on tuumorisuppressorigeeni joka estää proliferaatiota ja kiinnittymisestä riippumaton kyky paksusuolen syövän soluja [40, 41] ja edistää suolen erittävien solujen erilaistumista [42]. On tunnettua, että Hes1 estää ennenaikaista vanhenemista lepotilassa fibroblasteissa [25]. Tässä me osoitimme, että heikentävien Hes1 paksusuolen syövän solut eivät vaikuta solujen proliferaatiota, mutta kasvoi beeta-galaktosidaasi ilmaisu, joka osoittaa, että Hes1 ehtyminen indusoi paksusuolisyöpäsolulinjassa vanhenemista. Down-regulation Hes1 aiheuttamaa vanhenemista on myös raportoitu hepatosellulaarinen soluihin säätelemällä CDKN1C /p57 [43].

Seuraavaksi tunnettu että Hes1 edistetään soluinvaasiota lisäämällä MMP14 ilme. MMP14 on keskeinen proteaasi solumigraatioon /invaasion ja angiogeneesin [44, 45]. Korkea ilmentyminen MMP14 kerrottiin keuhkosyövän ja gliooma [46, 47]. Hes1 vuorovaikutuksessa STST3 ja edistää sen fosforylaatio [28]. Lisäksi STAT3 ilmoitettiin up-MMP-2 ja MMP-9 ilmaisun ja toiminnan kautta suoraan sitoutumalla niiden promoottori [48-50]. Tässä tutkimuksessa olemme myös havaittu, että STST3 yliekspressio lisääntyneen ilmentymisen MMP14 (kuvio 3). Tulosten perusteella näyttää, että säätely ylöspäin MMP14 mukaan Hes1 CRC soluissa on riippuvainen STST3 kautta.

Lisäksi havaitsimme, että sekä korkea Hes1 ja MMP14 ilmentyminen korreloi huonon säilymisen. Samanlainen tulos havaittiin potilaiden alaryhmässä aikaisin tai paikallisesti edennyt CRC, mutta ei potilailla, että kasvain on metastasized. Veenendaal tutkimuksessa, he havaitsivat korkeampi Hes1 ilmaisun ensisijainen koolonsyöpiä mutta hävisi ilmaisun alueellisissa ja etäispesäkkeitä [23]. Tämä havainto ehdotettu alentunut Notch toimintaa toisen Kolorektaalituumorien ja voivat selittää, miksi Hes1 ilmentymistaso ei liity selviytymisen kun kasvain on metastasied tutkimuksessamme. Sen sijaan, Reedijk et ai. aiemmin raportoitu, että korkea Hes1 ei liity selviytymisen CRC potilaiden analysoimalla 130 microarray tietoja US National Cancer Institute Colon Cancer Family Registry. Korkea ilme määriteltiin parhaaseen neljännekseen että Allredin tulokset [7]. Vaikka Reedijk tulos on ristiriidassa meidän toteamuksen, kasvain vaiheessa korkea ilmaisun määritelmä ja menetelmät ovat erilaisia ​​näissä kahdessa tutkimuksessa. Todellinen prognostisia rooli Hes1 CRC optio lisävahvistusta.

Yhteenvetona poikkeava aktivaatio Notch koulutusjakson estää solujen erilaistumista ja edistää syövän syntymistä. Hes1 on keskeinen transkription repressori ja olennaisia ​​sääntelijöiden Notch polku. Täällä, osoitimme, että yliekspressio Hes1 kasvattaa soluinvaasiota kyky kautta STAT3-MMP14 reitin. Hes1 ilmentyminen korreloi MMP14 ilmaisua CRC ja on ennustaja elossaololuku. Kohdistaminen Notch-Hes1 reitin voitaisiin hyödyntää terapeuttisiin tarkoituksiin Notch aktivoitu syövissä.

tukeminen Information

S1 Kuva. (A) Solujen elävyys muutoksen yhteydessä siRNA Hes1 transfektion että SW48 soluissa.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0144322.s001

(TIF) B S1 Taulukko. Alukkeet RT-PCR.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0144322.s002

(DOCX) B

Kiitokset

Haluamme kiittää professori Linzhao Cheng armollisesti tarjoamalla Hes1 ja delta-Hes1 plasmidien kautta Addgene.

Vastaa