Krooninen sairaus

tiivistelmä

Sytoplasmiset läsnäolo Hsp60, joka on pääasiassa ydin- geenikoodattuja mitokondrioiden chaperonin, on usein todettu, mutta sen rooli solunsisäisen signaloinnin ei juuri tunneta. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että sytosolin Hsp60 edistää TNF-α-aktivaatio IKK /NF-KB: n selviytymisen reitti on suora vuorovaikutus IKKα /β sytoplasmassa. Valikoiva menetys tai salpaus sytosolin Hsp60 tietty antisense-oligonukleotidi tai neutraloiva vasta-aine, vähensi IKK /NF-KB: n aktivaation ja ilmentymistä NF-KB: n kohdegeenien, kuten Bfl-1 /A1 ja MnSOD, joka siten täydennetty solunsisäistä ROS tuotanto ja ASK1 -riippuvaista solukuoleman, vasteena TNF-α. Toisaalta, ektooppinen ilmentyminen sytosolin kohdistettujen Hsp60 parannettu IKK /NF-KB: n aktivaation. Mekanistisesti sytosolin Hsp60 parannettu IKK aktivoinnilla upregulating aktivointi riippuvaista seriinifosforyloinnin on kaperonia riippumattomalla tavalla. Lisäksi transgeeninen hiiri tutkimus osoitti, että sytosolin Hsp60 tukahdutetaan maksan indusoima solukuolema diethylnitrosamine

in vivo

. Sytosolin Hsp60 on todennäköisesti sääntelyn komponentti IKK monimutkainen ja se syytöksiä ensimmäinen mitokondriaalisen tekijä, joka säätelee solujen eloonjääminen kautta NF-KB-reitin.

Citation: Chun JN, Choi B, Lee KW, Lee DJ, Kang DH, Lee JY, et ai. (2010) Sytosoliset Hsp60 osallistuu NF-KB-Dependent Survival syöpäsolujen kautta IKK asetus. PLoS ONE 5 (3): e9422. doi: 10,1371 /journal.pone.0009422

Editor: Rafael Linden, Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Brasilia

vastaanotettu: 02 joulukuu 2009; Hyväksytty: 18 tammikuu 2010; Julkaistu: 23 maaliskuu 2010

Copyright: © 2010 Chun et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat 21C Frontier Toiminnallinen Proteomiikka Project (FPR08-B1-190) rahoittamaa opetus-, Science Tekniikka ja KOSEF läpi Center for Cell Signaling Drug Discovery Research (CCS DDR, R15-2006-020) at Ewha Womans University. Tämä tutkimus tuki myös osittain apurahan National R Welfare (0420190). J. N. Chun, K. W. Lee, J. Y. Lee, B. A. Choi, ja H. I. Kim tukivat Brain Korea 21 avustusta Korean opetus-, Science Technology. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Nisäkässoluilta ilmentävät useita selviytymisen geenejä, jotka rooleja inhiboimaan kaspaasi aktivointi, poistamalla haitallisia happiradikaaleja, puolustaa mitokondrioiden toimintaan, ja tarkkailun solusyklin. Niistä transkriptiotekijät vastuussa induktion selviytymisen geenejä, Nukleaaritekijä-KB (NF-KB) on keskeinen elementti, joka orchestrates monimutkaisia ​​solujen eloonjäämistä vastaus [1]. Erityisesti NF-KB-riippuvainen selviytymisen geenejä ovat anti-apoptoottiset geenit, kuten c-IAP: t ja c-FLIP, ja mitokondrioiden turvata geenejä, kuten mangaani-superoksididismutaasi (MnSOD) ja Bcl-2-perheen jäsenten [2] , [3], [4]. Keskeinen kinaasi NF-KB: n aktivaation reitti on inhibiittori KB kinaasin (IKB-kinaasi tai IKK), joka fosforyloi IKB-proteiinien kaksi aminopään seriinitähteissä, mikä sen ubiquitinylation ja proteosomal hajoamista ja siitä johtuvat vapauttamista NF-KB proteiinit [5]. Solunulkoiseen ärsykkeitä aktivoi NF-KB: n reitin lähentyä IKK [6]. Siksi lukuisat on pyritty hahmotella sääntelyyn IKK aktivoinnin. Ensinnäkin fosforylaatio riippuva sääntelyn IKK aktivointi on ollut ominaista [7]. Fosforylaatio kahden seriinitähteen (Ser 177 /Ser181 ihmisen IKKβ) aktivaatioon T-silmukka on tärkeää aktivaation, kun taas autofosforylaatiota karboksipään seriini klusterin sammuttaa aktivointi. Monet kinaasit ovat sekaantuneet olla mukana aktivointi fosforylaatio: NF-KB-asiakkuutta kinaasi (NIK) [8], [9], mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi /ERK kinaasi kinaasien 1 (MEKK1) [10], MEKK2 /3 [11], [12], Hematopoieettinen kantaisä kinaasi-1 (HPK1) [13], Mixed-linjaa kinaasi 3 (MLK3) [14], TGF-β aktivoitu kinaasi 1 (TAK1) [15]. Kuitenkin paitsi TAK1, on epäselvää, miten alkupään kinaasi aktivoi IKK monimutkainen. Toiseksi ubikitiinistä riippuvainen sääntelyn IKK aktivointi on tutkittu jo vuosia [15], [16]. Äskettäin sääntely-alayksikköä IKKγ (tai NEMO) ja IKK kompleksin on osoitettu olevan ubikitinoitu sekä tunnistamaan Lys63 sidottu polyubiquination ketju reseptori-vuorovaikutus proteiini 1 (RIP1) [17], [18]. Kolmanneksi sääntely IKK aktivoitumisen kautta vuorovaikutuksessa proteiinien on ominaista. Parhaita esimerkkejä ovat lämpöshokkiproteiineiksi. Esimerkiksi, Cdc37 ja Hsp90 on raportoitu toimivan lisäkomponentteja IKK monimutkaisia, että vakauttaa monimutkainen [19], [20]. Hsp27 on osoitettu olevan vuorovaikutuksessa IKKβ on TNF-α-riippuvaisella tavalla [21]. Hsp70 myös vuorovaikutuksessa IKKγ mutta häiritsee IKK aktivointi [22]. Lisäksi yhdistyksen välillä proteiinifosfataasi 2Cβ (PP2Cβ) ja IKK monimutkainen on osoitettu [23], ja ELKS on myös todettu uusi sääntely alayksikköä IKK monimutkaisia, joka välittää rekrytointi IKB monimutkaisia ​​[24]. Ei ole kuitenkaan mitään viitteitä mitokondrio proteiinin mukana IKK /NF-KB: n aktivoitumisen.

Olemme äskettäin tunnistettu lämpöshokkiproteiini 60 (Hsp60) kuin IKK-vuorovaikutuksessa proteiini. Hsp60 on mitokondriaalisen chaperonin joka edistää taitto tuodun proteiinin natiivin konformaation. Tästä toteamuksesta ja toiminta hsp60 extramitochondrial osastoissa on usein todettu [25]. Esimerkiksi Hsp60 voi olla ligandi solun pinnan reseptorit, kuten Toll-kaltainen reseptori [26]. Solunsisäisesti, Hsp60 on osoitettu olevan vuorovaikutuksessa pro-kaspaasi-3 tai Bax [27], [28], [29]. Kuitenkin toiminta Hsp60 liittyvien solujen eloonjäämistä signalointi ei ole raportoitu. Tässä tutkimuksessa Hsp60 havaittiin välittävän NF-KB-riippuvaisia ​​selviytymisen signaloinnin soluihin. Erityisesti, Hsp60 suoraan vuorovaikutuksessa IKKα /β sytoplasmassa ja edistää fosforylaation-riippuvaisen kinaasin aktivaatioon vasteena TNF-α. Tällainen signalointi tehtävänä Hsp60 oli riippumaton sen kaperonitoiminta, jossa asetetaan Hsp60 erilleen muista lämpöshokkiproteiineiksi jotka toimivat kautta vakauttamiseksi tai epävakautta signalointikompleksiin [30]. Osoitimme myös

in vivo

todisteita siitä, että sytosolin ilmentyminen Hsp60 suojaa maksan soluja vastaan ​​kemiallisia aiheuttamaa vahinkoja kautta parantaa IKK aktivaation. Siten tämä havainto edustaa uusi pro-selviytymisen toiminto sytosolin Hsp60 ja karistanut valoa ymmärtämiseen toiminta Hsp60 ulkopuoliseen mitokondrioiden osastoja [25].

Tulokset

Hsp60 vuorovaikutuksessa IKK monimutkainen sytoplasmassa

tunnistaa lisäosan, tutkimme molekyylitason koostumus piilevä IKK kompleksi käyttämällä proteomic tekniikkaa yhdistyvät immunologiseen affiniteettipuhdistukselle ja massaspektrometrialla. Lyhyesti, IKK-kompleksin saostettiin lysaateista stimuloimattomien HeLa S3-soluissa käyttäen anti-IKKα vasta-aineen helmiä, ja mukana saostuva proteiinit sekvensoitiin nestekromatografia-tandem-massaspektrometrialla. Tunnistaminen IKK alayksiköiden ja Hsp90 osoitti, että immuunipuhdistusmenetelmiä IKK monimutkainen melko toiminut (Fig. 1A). Näin ollen, tämä proteomiikka tutkimuksessa tunnistettiin lämpöshokkiproteiiniin, Hsp60, että saostumat (Fig. 1A ja 1B). Läsnäolo IKK alayksiköiden ja Hsp60 on sakat vahvistettiin immunoblottauksella (Fig. 1 C). Sitten päätimme tutkia biologinen merkitys IKK-Hsp60 vuorovaikutus.

. Hopea-värjätty polyakryyliamidigeeli ratkaisemiseksi affiniteettipuhdistetun IKK monimutkainen. B. MS /MS-spektrit [M + 2H]

2 + ionit johdettujen peptidien proteiinin nauha, joka vastaa Hsp60. C. Immunoblot (IB) analyysit IKK alayksiköiden ja Hsp60, että affiniteettipuhdistetut monimutkainen. D. vuorovaikutus Hsp60 kanssa IKK monimutkainen. IKK kompleksi immunosaostettiin (IP) HeLa solulysaateista (500 ug kokonais- proteiinit kutakin) kanssa IKKα, IKKβ, ja IKKγ-spesifisten vasta-aineiden. IKKα /β /γ-alayksiköitä, Hsp60 ja Hsp90 immunoblotattiin. WCL, kokosolulysaatissa. E. TNF-α-riippumaton vuorovaikutus Hsp60 ja IKK monimutkainen. F. Co-immuunisaostuksessa Hsp60 ja IKK monimutkainen sytosolifraktion.

Ylähavas

, post-ydinvoiman supernatantti (PNS), sytosoliin (Cyto), ja mitokondrioita (Mito) jakeet HeLa-soluista immunoblotattiin. COX4 ja tubuliinin käytettiin mitokondrioiden ja sytosolin markkereita, vastaavasti.

Ala-paneeli

, Hsp60 immunosaostettiin sytosolifraktion joko vuohen kontrolli-IgG: tä tai anti-Hsp60-vasta-aineita (K-19 ja N-20). Edustavia blotit näkyvät (

n

= 3).

Ensimmäinen askel oli todentaa endogeenisen vuorovaikutusta Hsp60 ja IKKS co-immuunisaostuskokeissa. Kun heterogeeninen IKK kompleksit saostettiin vasta-aineita IKKα, IKKβ, ja IKKγ kukin IKK-alayksikön vasta-aineet samalla tavoin saostunut Hsp60 (Fig. 1 D). Lisäksi Hsp90 oli myös kerasaostuvat IKK monimutkaisia ​​[20], [21]. Tämä vuorovaikutus havaittiin olevan ei vaikuta TNF-α hoidon (Fig. 1 E), joka osoittaa, että Hsp60 on osa proteiini heterogeenisten IKK komplekseja. Käänteinen immunosaostus suoritetaan sitten sytosolifraktion jättää mitokondrion saastumista. Anti-Hsp60 vasta kerasaostuvat IKKγ Hsp60, kun taas vuohen kontrolli-lgG ei (Kuva. 1 F), joka vahvistaa, että sytosolin vuorovaikutus Hsp60 ja IKK. Jotta visualisoida virtuaalinen vuorovaikutus Hsp60 kanssa IKKS sytoplasmassa, The immunokulta värjäys yhdistettynä elektronimikroskoopilla (EM) suoritettiin. Immuunikompleksien of Hsp60 ja IKK niiden spesifisten vasta-aineiden havaittiin eri käyttämällä sekundaarisia vasta-aineita on leimattu 20 nm- ja 40 nm halkaisijaltaan kulta hiukkasia, vastaavasti. Tämän seurauksena Hsp60-merkinnät kultapartikkelit jaetaan koko solun rakenteet: ei vain matriisin ja intermembrane tilaa mitokondrioita, mutta myös sytoplasmassa ja solukalvon (Fig. 2B). Sen sijaan IKKα- ja IKKβ-merkintöjä kultapartikkelit pääasiassa sytoplasmassa (Fig. 2C ja 2D), kun taas IKKα havaittiin myös ydin, joka on yhdenmukainen aikaisempien raporttien [31], [32] . Vaikka IKK ydin-alayksiköitä, on osoitettu löytyy mitokondriofraktiosta [33], meidän tiedot osoittavat, että IKK-merkinnät kultapartikkelit usein nähty vesicular rakenteisiin pikemminkin kuin mitokondrioiden (Fig. 2C ja 2D). Tämä ero saattaa johtua edellisessä tutkimuksessa tehdään subsellulaarifraktiointikokeet. Kun Hsp60 ja IKKS olivat co-värjättiin, suoran sitoutumisen 20 nm ja 40 nm: n kultapartikkeleita, havaittiin selvästi sytoplasmassa (Fig. 2E ja 2F). On huomattava, että ei ole kaikkia IKKα ja IKKβ liittyi Hsp60. Nämä tulokset yhdessä osoittavat, että Hsp60 suoraan vuorovaikutuksessa IKK-kompleksin sytosoliin.

HeLa-solut immunologisesti, joilla ei ole ensisijainen (A), anti-Hsp60 (B), anti-IKKα (C), anti-IKKβ (D), anti-Hsp60 /IKKα (E), ja anti-Hsp60 /IKKβ (F) vasta-aineita, ja sitten merkitty vastaavat sekundääriset vasta-aineet, jotka on konjugoitu 20 nm tai 40 nm: n kultapartikkeleita, kuten on kuvattu kokeellisessa mukaisesti. Merkinnöissä arvioitiin immuno-kulta elektronimikroskoopilla. Ytimet (Nu) ja mitokondrioita (M) on osoitettu.

Nuolet

havaittu suoria tarttumista Hsp60- ja IKK-leimattu kultaa hiukkasia. Ei immunoreaktiivisia signaalia nähtiin näytteessä ilman ensisijaisen vasta-aineita (A). Kokeet toistettiin kahdesti samoja tuloksia, ja edustavia tuloksia on esitetty.

Hsp60 suoraan vuorovaikutuksessa IKKα /β, ei IKKγ

Seuraavaksi analysoimme molekyylien vuorovaikutus Hsp60 ja IKKS. Voit tehdä tämän, joka on solulimaan kohdistetun versio Hsp60 (Hsp60c), jolloin mitokondrioiden kohdistaminen signaalisekvenssi poistetaan, rakennettiin. Kun Hsp60c oli koekspressoitu kunkin IKK ytimen alayksiköt, Hsp60c vuorovaikutuksessa IKKα ja, vaikkakin vähäisemmässä määrin, ja IKKβ, mutta ei IKKγ (Fig. 3A). Sitten lisätään

in vitro

Sitoutumistutkimus käyttäen rekombinanttiproteiineja glutationi-S-transferaasi (GST) -fuusioitunut Hsp60 ja (His)

6-tagged IKK core alayksiköt arvioitiin GST avattavan määritys. Tuloksena jälleen osoittaa, että Hsp60 sitoutuu suoraan IKKα ja IKKβ, mutta ei IKKγ (Fig. 3B).

. Ohjaa sitoutuminen Hsp60 ja IKK alayksiköistä. 293T-solut kotransfektoitiin Hsp60c (HA-tag) ja kunkin IKK alayksikön proteiineja (Flag tag) 24 tuntia. B.

In vitro

yhdistys Hsp60 kanssa IKKα ja IKKβ. GST-fuusioitu Hsp60-proteiinit sitoutunut glutationi-Sepharose-helmiä inkuboitiin lysaatit Sf9-hyönteissoluissa ilmentävät Hänen

6-merkitty IKK proteiineja. Hsp60 ja IKKS havaittiin immunoblottauksella GST ja HA tunnisteet, tässä järjestyksessä. C. kaavio, joka esittää deleetiomutanttien Hsp60. Oletetun fosforylaatiopaikkaa kinaasien, mukaan lukien PKA /PKG (1) ja PKC (2), on osoitettu. D ja E vuorovaikutus Hsp60 villityypin (WT) ja deleetiomutanttien kanssa ektooppisesti-ilmaistuna IKKα 293T-soluissa (D), tai endogeenisen IKK-kompleksin HeLa-soluissa (E). Kontrollivektorilla (C) on merkitty. Edustavia pyyhkii ja kuvat näkymään (

n

= 3). N. S., epäspesifinen.

molekyylien vuorovaikutus Hsp60 kanssa IKK karakterisoitiin edelleen mappauksella kokeita. Koska C-terminaalinen deleetio haittasi ektooppinen ilmentyminen, sarja N-pään deleetiomutantit Hsp60c testattiin IKK sitoutumisen kautta koeskspressio Flag-merkityn IKKα HEK293-soluissa (kuva. 3C). Tulokset osoittivat, että N-terminaalisen osan (~160 aminohappoa N-päästä) ja Hsp60-proteiinin osoitettiin olevan tarpeeton vuorovaikutus (Fig. 3d). Sama tulos saatiin, kun endogeeninen IKK kompleksi immunosaostettiin HeLa-soluissa, jotka on transfektoitu Hsp60c konstruktien (Fig. 3E). Tulokset melko osoittavat, että ydin sitova domeeni sijaitsee keskellä Hsp60-proteiinin.

Hsp60 osallistuu IKK /NF-KB: n aktivaation

Seuraavaksi biologinen vaikutus sytosolin Hsp60- IKK vuorovaikutusta tutkittiin TNF-α-välitteinen NF-KB-reitin kautta. Tavoitteen saavuttamiseksi, joka on olennainen askel on manipuloida tason sytosolin Hsp60 vaikuttamatta mitokondrion yksi koska Hsp60 puute tiedetään aiheuttavan mitokondrioiden toiminnallinen vika [34], [35], [36]. Mielenkiintoista on, on tehty monia tutkimuksia on aiemmin raportoitu, että antisense-oligodeoksinukleotidi (AS-ODN), joka on komplementaarinen sekvenssin ympäröivän aloituskodonin ihmisen Hsp60: n avoimen lukukehyksen tosiasiassa vähentää sytosolin Hsp60 taso [27], [37], [38] . Me siis päätti testata tämän AS-ODN (nimetty AS-1) on selektiivinen knockdown vaikutus. Jotta voitaisiin sulkea pois mahdollisuus epäspesifisten toimia tietyn-ODN-sekvenssi, päätimme toinen AS-ODN (AS-2), joka on komplementaarinen alueelle, (+ 95~ + 110 aloituskodonista) lähellä 5′-päätä , mutta sen jälkeen mitokondrioiden kohdistaminen signaalisekvenssi (MTS), ja Hsp60: n avoimen lukukehyksen (Fig. S1A). Mielessä ODN ​​(S-ODN) komplementaarinen AS-1 käytettiin kontrolli-ODN. Koska antisense-ODN on kohtalainen translationaalinen esto, se ei aiheuttanut vähentämistä koko Hsp60 tasolla (Kuva. S1B). Kuitenkin transfek- AS-ODN todellakin vähentää selektiivisesti sytosolin Hsp60 tasoja verrattuna mock tai ohjaus S-ODN vaikuttamatta mitokondrioiden tasolla (Fig. 4A). Tämän ymmärtämiseksi ilmiötä, me arveltu, että puoliintumisaika Hsp60-proteiinin kaksi osastot voivat vaihdella. Todistaa se, puoliintumisaika sytosolia kohdistetun Hsp60 (Hsp60c) arvioitiin jälkeen estämällä proteiinisynteesiä. Yllättäen taso sytosolin Hsp60-proteiinin laskettiin nopeasti (laskettuna

t

½ = 3,2 min), kun taas kokonaistaso endogeenisen Hsp60 ja IKKα proteiinit oli muuttumaton (kuvio. 4B). Lisäksi tämä pelkistys täysin tukossa käsittelemällä proteasomin inhibiittoria MG132 (Fig. 4C). On huomattava, että MG132 käsittely johti myös merkittävä kasvu pohjapinta tason Hsp60c proteiinia. Siten tämä tulos, ainakin osittain, selittää taso sytosolin Hsp60 oli herkempi AS-ODN hoitoa, ja se lisäksi ehdottaa, että taso sytosolin Hsp60 voisi ohjata proteasomin.

. Ablaatio sytosolin Hsp60 antisense ODN. Sytosolin ja mitokondrioiden jakeet valmistettu mock tai ODN-transfektoituja HeLa-soluja immunoblotattiin. S, tunne ODN; AS-1 ja AS-2, antisense ODN. Mitokondriofraktiosta ladattiin tilavuuteen viidesosa vastaavan sytosolifraktion. Erityisesti, Prx III, joka on antioksidantti-entsyymin läsnä mitokondrion matriisi, käytettiin mitokondrioiden markkereita katsella epäspesifisen mitokondrioiden repeämä. B. puoliintumisaika ektooppisesti-ilmaistuna Hsp60c proteiini (HA tag) jälkeen estämällä proteiinisynteesiä sykloheksimi-. Intensiteetti HA kaistan mitattiin ja normalisoitiin määrä IKKα band. Data kaaviossa ovat keskiarvoja ± S.D. Kahden itsenäisen kokeen ja asennettu SigmaPlot 8.0 ohjelmisto. C. Proteasome riippuva liikevaihdon sytosolin Hsp60c proteiinia. HeLa-soluja esikäsiteltiin tai ilman MG132 (5 uM) 30 min ennen sykloheksimidikäsittelylle. D. TNF-α aiheuttama IKK ja JNK1 aktivoinnin mock tai ODN-transfektoiduissa soluissa.

in vitro

kinaasiaktiivisuuden (KA) oli keskimäärin arvoilla kaksi erillistä koetta, ja se on edustettuna kertainen aktiivisuuden verrattuna stimuloimattomiin ja mock-transfektoituja soluja (kaista 1). E. NF-KB: n transkription aktivaation mock tai ODN-transfektoiduissa soluissa. Lisääntyvä keskittyminen AS-ODN (100 nM tai 200 nM) testattiin. Suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus normalisoida β-galaktosidaasin aktiivisuus, ja tiedot ovat keskiarvoja ± S.D. Neljän itsenäisen kokeen (*

P

0,0001, **

P

0,001 versus stimuloi S-ODN-transfektoiduissa soluissa).

TNF -α-indusoidun IKK /NF-KB: n aktivaation jälkeen tutkittiin AS-ODN-transfektoiduissa soluissa.

in vitro

kinaasimääritys osoitti, että transfektio AS-ODN: t huomattavasti vähentänyt IKK aktivointi vasteena TNF-α 60% verrattuna mock tai S-ODN (Fig. 4D). Kuitenkin AS-ODN: ien ei ollut vaikutusta MAP-kinaasin aktivaatio vasteena TNF-α (Fig. 4D ja kuviossa. S1C), paljastaen erityinen vaikutus Hsp60 AS-ODN: t on IKK aktivointia. Lisäksi AS-ODN: ien lähes kokonaan poisti NF-KB: n transkription aktivaatiota vasteena TNF-α, kun taas S-ODN ei, verrattuna mock-käsitellyt solut (Fig. 4E). Koska sen Knockdown tehoa, AS-1 on voimakkaampi että AS-2. Kuitenkin transfektio ODN ei itse indusoi pohjapinta NF-KB: n aktivoitumisen, mikä osoittaa, ei pois kohde-vaikutus ODN: ien. Lisäksi vähentävä vaikutus AS-ODN on NF-KB-transkriptionaalisen aktiivisuuden näkyi myös 293T ja A549-solut (Fig. S1D). Lisäksi ohjaus koe osoitti, että AS-ODN: ien ei ollut vaikutusta muihin transkriptiotekijän aktivaation, kuten AP-1, NF-AT, ja CRE (Fig. S1E).

Samanlainen tutkimus suoritettiin estämällä sytosolinen Hsp60 käyttäen spesifistä vasta-ainetta (Hsp60N), jota on käytetty immunosaostukseen ja immunostaing of Hsp60 (ks. 1). Vasta-aine transduktio saavutettiin peptidi välittämä proteiini jakelujärjestelmä [39]. Ohjaus- vuohi lgG: llä ja Hsp60N-vasta-aineen havaittiin onnistuneesti toimittaa sytoplasmaan, koska sitä ei ole fuusioitu Mitotracker (Fig. 5A), ja Hsp60N, mutta ei kontrolli-lgG, sidottu Hsp60 (Fig. 5B). Tämä tulos osoittaa, että toimitettu vasta-aine voi toimia funktiona esto. Sitten, IKK /NF-KB: n aktivoitumista tutkittiin vasta-aine-transdusoidut solut. Hsp60N vasta-aine selvästi vähentänyt IKK aktivointi vasteena TNF-α 50% tasosta, joka saadaan kontrolli-lgG (Fig. 5C). Sen sijaan, TNF-α-indusoidun JNK-aktivoituminen ei ollut vaikutusta, mikä taas osoittaa, että rooli Hsp60 on spesifinen IKK aktivointia. Johdonmukaisesti, The Hsp60N vasta-aine vähensi merkittävästi transkriptionaalista aktiivisuutta NF-KB: n (Fig. 5D). Tiedot yhdessä päätellä, että sytosolin Hsp60 edistää TNF-α-indusoidun IKK /NF-KB: n signalointia.

. Transduktio Hsp60-neutraloiva vasta-aine (Hsp60N) sytoplasmaan HeLa-soluissa. Mitotracker Red (Molecular Probes, USA) ja DAPI osoittavat mitokondrioita ja ytimet, vastaavasti. B. transdusoidut Hsp60N sitoutuneen vasta-aineen endogeenisen Hsp60. Sen jälkeen, kun vasta-aineen transfektion, HeLa solulysaatit altistettiin saostamalla käyttäen Protein-A-Sepharose helmiä. Saostuneet proteiinit immunoblotattiin varten Hsp60. C. IKK ja JNK1 aktivoinnin vastauksena TNF-α valvonta IgG- tai Hsp60N-vasta-transfektoiduissa HeLa-soluissa.

in vitro

kinaasiaktiivisuuden (KA) oli keskimäärin arvoilla kaksi erillistä koetta, ja se on edustettuna kertainen aktiivisuuden verrattuna stimuloimattomiin ja kontrolli-lgG-transfektoiduissa soluissa (kaista 1). D. TNF-α-indusoidun NF-KB: n transkription aktivaation vasta-aine-transfektoiduissa soluissa (*

P

0,01 versus stimuloi IgG-transfektoiduissa soluissa).

ektooppinen ekspressoituminen sytosolia -targeted Hsp60 riittävän edistää IKK /NF-KB: n aktivoitumisen

Käänteisesti rooli sytosolin Hsp60 in IKK /NF-KB-reitin käsiteltiin yli-ilmentyminen sytosolin kohdistetun Hsp60c. Ektooppisesti-ilmaisi Hsp60c havaittiin assosioivansa IKK monimutkainen (Fig. 6A) ja merkittävästi lisännyt IKK ja NF-KB: n aktivoitumisen vasteena TNF-α (Fig. 6B ja 6C). On huomattava, että ektooppinen ekspressio Hsp60c marginaalisesti indusoi pohjapinta IKK: n ja NF-KB: n aktivaation. Vaikutus Hsp60c ilmentymisen NF-KB: n aktivaatio oli täysin poistettiin IKKβ-vajaiden solujen (Fig. 6D), mikä osoittaa, että sääntelytoiminta sytosolin Hsp60 on IKK-riippuvainen. Lisäksi ektooppinen ilmentyminen Hsp60c ei lisätä joko JNK aktivointi tai aktivoinnin muiden transkriptiotekijöiden, kuten AP-1, CRE, ja NF-AT (kuvio. S2). Tämä tulos osoittaa, että lisäämällä sytosolin Hsp60 tasolla lisää TNF-α-indusoidun IKK /NF-KB: n aktivaation.

Solut transfektoitiin joko ohjaus (CGN) tai Hsp60c koodaavan plasmidin (HA-tag) 24 tunnin ajan ja sitten käsiteltiin TNF-α. A. sisällyttäminen ektooppisesti-ilmaisi Hsp60c (HA tag) in IKK monimutkainen. B. TNF-α-indusoidun IKK aktivaation HeLa-soluissa. C TNF-α-indusoidun NF-KB: n aktivaation HeLa-soluissa (

n

= 4, *

P

0,0001 versus stimuloimaton vastine). D. TNF-α-indusoidun NF-KB: n aktivaation transfektoiduissa IKKβ

– /- 3T3-solut (

n

= 4, *

P

0,001 versus stimuloitiin CGN transfektoidut solut, ND ei havaittu).

Hsp60 säätelee IKK fosforylaation aktivaation T-loop

ymmärtää mekanismia taustalla sääntelytoimella hsp60 IKK /NF-KB: n aktivoitumisen, useita kokeellisia lähestymistapoja yritettiin. Sen määrittämiseksi, onko kaperonitoiminta of Hsp60 tarvitaan kaksi aminohappotähdettä, joiden tiedetään olevan kriittisiä kaperonitoiminta of Hsp60 pidettiin. Yksi on lysiinitähteen (K28), joka on mukana oligomerointiin Hsp60-proteiinin [40], [41]. Toinen on aspartaattitähteen (D423), joka on aktiivisen tähteen ATPaasi [42], [43]. Siten Hsp60c mutantit, joissa K28 ja D423 on substituoitu glutamaatin ja alaniini vastaavasti, rakennettiin. Kotransfektiojärjestelmää koe osoitti, että sekä mutantit vuorovaikutuksessa IKKα ja IKKβ yhtä hyvin tai jopa paremmin kuin villi tyyppi (Fig. 7A). IKK aktivoinnin vastauksena TNF-α, että Hsp60 mutantti ilmentävien solujen oli samanlainen kuin villityypin (Fig. 7B), mikä osoittaa, että tällaiset menettämisestä toiminnon mutaatiot eivät vaikuttaneet IKK-lisäävää vaikutusta. Lisäksi TNF-α-indusoidun NF-KB: n transkription oli jopa parannettu, että Hsp60 mutantti-ilmentäviä soluja noin 4-6 kertaa suurempi kuin, että vektorin kontrolli (Fig. 7C). Tehostajavaikutuksen mutanttien oli selvästi IKKβ riippuvainen, on testattu uudelleen IKKβ puutteesta 3T3-soluja. Näin ollen tämä koe käyttäen menettämisestä toiminnon mutanttien viittaavat vahvasti siihen, että sytosolin Hsp60 toimii itsenäisesti kaperonitoiminta in IKK /NF-KB: n aktivoitumisen.

. Association of Hsp60c villityypin (WT) ja mutanttien kanssa IKKα ja IKKβ. Ilmoitettu proteiinit koekspressoitu 293T-soluissa, kuten on esitetty kuviossa. 3A. B ja C. IKK (B) ja NF-KB: n transkription aktivaatiota (C) soluissa, jotka ilmentävät Hsp60c villityypin ja kaperonia aktiivinen mutantteja. Kinaasi ja toimittaja toimintaa analysoitiin kuvatulla kuvassa. 4 (reportterianalyysi,

n

= 6, *

P

0,0001 versus stimuloimattomasta vastine). D.

In vitro

kinaasiaktiivisuuden IKK: n läsnä rekombinantti Hsp60-proteiinia. IKK kompleksi immunosaostettiin HeLa-solulysaateista ja inkuboitiin kanssa tai ilman osoitetun GST-proteiineja (20 ug kutakin) on kinaasireaktiopuskurin ssa 10 minuuttia ennen kinaasireaktion. E. seriinifosforylointi IKKα /β HeLa-soluissa, jotka on transfektoitu AS-1 ODN. Data kaaviossa ovat keskiarvoja ± S.D. (

n

= 3, *

P

0,02, *

P

0,001). F. seriinifosforylointi IKKα /β in Hsp60c-ilmentyminen HeLa-soluissa. Edustava blot on esitetty (

n

= 3).

Yksi IKK-vuorovaikutuksessa proteiini, ELKS, on osoitettu välittävän IKB rekrytointi IKK monimutkaisia ​​[24] . Testata tätä toimintatapaa rekombinantti Hsp60-proteiinia lisättiin suoraan osaksi IKK Kinaasireaktion, jossa aktivoitua IKK kompleksi inkuboidaan täyspitkä ihmisen IKB substraattina.

in vitro

kinaasiaktiivisuuden aktivoidun IKK kohti IKB ei vaikuttanut läsnäolo Hsp60-proteiinin (kuvio. 7D), joka osoittaa, että Hsp60 ei ole mukana vuorovaikutus IKK ja sen substraatin IkB.

Lopuksi suora osallistuminen sytosolin Hsp60 vuonna IKK aktivoituminen käsiteltiin tarkastelemalla aktivointia riippuvaista seriinifosforyloinnin että T-silmukka IKKα /β. AS-ODN transfektion merkittävästi poistettiin TNF-α-indusoitua fosforylaatiota IKK on Ser178 /181, joka osoittaa, että fosforylaatio riippuvainen IKK aktivaatio oli heikentynyt (kuvio. 7E). Kääntäen, kohdunulkoinen ilmaus Hsp60c johti kasvua IKK fosforylaation (kuvio. 7F). Kaiken kaikkiaan tulokset osoittavat, että sytosolin Hsp60 osallistuu fosforylaatioon riippuvainen IKK aktivoinnin sijaan kaperonia riippuvainen vakauttaminen IKK monimutkainen.

Sytosoliset Hsp60 vaikuttaa NF-KB: n kohdegeenin ilmentymisen ja solujen eloonjäämistä

Voit selvittää merkitys sytosolin Hsp60-välitteisen säätelyn IKK /NF-KB-reitin, tutkimme ilmentymistä NF-KB kohdegeenien ODN-transfektoiduissa soluissa. Kun ekspressiota anti-apoptoottisten geenien seulottiin RNaasi suojan määritys [44], ilmentyminen TRAF1, c-IAP1 ja c-IAP2 ei vaikuttanut AS-ODN transfektiolla (Fig. 8A). Tämä oli odottamatonta, mutta johti meidät olettaa mahdollisuuden, että jotkin valitse kohde liittyvistä geeneistä mitokondrioiden suojaus voidaan vaikuttaa. Tämän testaamiseksi me katsoimme induktioon useiden kohdegeenien, kuten antioksidantti proteiinit (ferritiinin raskaan ketjun ja MnSOD) ja Bcl-2 jäsentä (Bcl-2, Bcl-X

L, Bfl-1 /A1). On mielenkiintoista, että AS-ODN merkittävästi vähentynyt induktion vain MnSOD ja Bfl-1 /A1 ilmentymistä vasteena TNF-α (Fig. 8B). Hsp60N vasta-aine vähensi merkitsevästi myös induktion näiden geenien (kuvio. 8C). Se oli jälleen vahvistettiin, että induktio c-IAP2 ekspressio ei vaikuttanut kummassakaan tapauksessa. Täten tulokset osoittavat, että sääntely IKK aktivoinnin sytosolientsyymien Hsp60 vaikuttaa ilmaus valitse NF-KB: n kohdegeenien.

. RNaasisuojaus- määritys induktio anti-apoptoottisten geenien ODN-transfektoiduissa soluissa. Autoradiogrammi on esitetty on edustavat kolmea riippumatonta koetta. B ja C. QPCR induktion endogeenisen NF-KB: n kohdegeenien ODN-transfektoiduissa soluissa (B) ja vasta-transfektoiduissa soluissa (C) (

n

= 3, *

P

0,001). D. TNF-α-välitteinen tuotanto solun ROS ODN-transfektoiduissa soluissa. Edustaja kuvat näkyvät. Tiedot ovat keskiarvoja ± S.D. of kertainen lisäys verrattuna käsittelemättömien mock solujen suhteellisen DCF fluoresenssi (

n

= 4, *

P

0,05, **

P

0,001). E. JNK ja p38 MAPK-aktivaation ODN-transfektoiduissa soluissa. Edustavia blotit näytetään. Tiedot kuvaajat ovat keskiarvoja ± S.D. n intensiteettiä fosfo-JNK (P46) tai fosfo-p38 bändejä, jotka oli normalisoitu vastaavien muiden kuin fosfo-bändejä (

n

= 3, *

P

0,05, **

P

0,001). F. ASK-1 aktivaation ODN-transfektoiduissa soluissa. Kinaasiaktiivisuuden (KA) oli keskimäärin arvoilla kaksi erillistä koetta, ja esitetään kertainen nousu aktiivisuuden vs. stimuloitumattomassa ja mock-transfektoituja soluja (kaista 1). G. TNF-α-indusoituvaa solukuolemaa mock tai ODN-transfektoitujen HeLa. Tiedot ovat keskiarvoja ± S.D. (

n

= 3, *

P

0,01). H. TNF-α-indusoidun solukuoleman koolonkarsinoomasoluja transfektoitu ODN: t. Taso Hsp60 vuonna subsellulaarisia fraktioissa on esitetty (

Ylä

). Data kaaviossa ovat keskiarvoja ± S.D. (

n

= 3, *

P

0,05, **

P

0,01). Solukuolemaa analysoitiin FACS värjäyksen jälkeen anneksiini V-fluoreseiini isotiosynaatti- ja propidiumjodidilla.

pohtivat seuraavaksi tällainen sääntely valitse kohdegeenien vaikuttaa solujen eloonjäämistä. Koska on olemassa mahdollisuus, että MnSOD ja Bfl-1 /A1-toiminto tukahduttaa mitokondrioiden johdettu reaktiivisen hapen (ROS) [2], [45], taso solujen ROS tutkittiin ODN-transfektoiduissa soluissa käyttäen hapetus- herkkä fluoresenssiväriä, CM-H

2DCFDA. AS-ODN transfektio indusoi huomattavasti enemmän solujen ROS vasteena TNF-α hoidon ajasta riippuvalla tavalla, verrattuna vale- tai S-ODN transfektiolla (Fig. 8D). Koska parannettu ROS taso liittyy solukuolemaan kautta jatkuva JNK aktivointi [46], jatkuva aktivointi stressin aktivoimien proteiinikinaasien, JNK ja p38 MAPK, tutkittiin. Yllättäen aktivointi sekä JNK ja p38 MAPK havaittiin selvästi yllä AS-ODN-transfektoiduissa soluissa (kuvio. 8E). ASK-1 MAP3K tiedetään olevan vastuussa kestävän aktivointi JNK ja p38 ROS-välitteisen solukuoleman [47]. Kuten on esitetty kuviossa.