Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA (miRNA) tärkeä rooli syövän kehittymisessä. Kloonaamalla ja sekvensoimalla HPV16

+ CaSki- solu pieniä RNA kirjasto, me eristetty 174 miRNA (mukaan lukien uudet miR-193c), jotka voidaan ryhmitellä 46 eri miRNA lajeja, joissa miR-21, miR-24, asennuspalveli- 27a, ja miR-205 on yleisin. Valitsimme lisätutkimuksia 10 miRNA niiden kloonausta taajuus ja liittyvät niiden tasot 10 kohdunkaulan syöpää tai kohdunkaulan intraepiteliaalinen neoplasia-solulinjat. Ei havaittu mitään korrelaatiota välillä ilmaisun kanssa läsnäolo tai puuttuminen integroitu tai episomaalisen HPV-genomin. Kaikki solulinjat tutkittiin ei sisältänyt havaittavia miR-143 ja miR-145. HPV-tartunnan solulinjat ilmensivät eri joukko miRNA kun viljellään organotyyppisessä lauttaa viljellyissä verrattuna yksikerroksista soluviljelmässä, mukaan lukien ilmentyminen miR-143 ja miR-145. Tämä viittaa korrelaatio miRNA ilmaisun ja kudosten erilaistumiseen. Käyttämällä miRNA array analyysit samanikäisiin normaalia kohdunkaula ja kohdunkaulan syövän kudoksissa yhdistettynä Pohjois blot todentaminen tunnistimme merkittävästi vapautettiin miRNA kohdunkaulan syövän kudoksissa, joissa miR-126, miR-143, ja miR-145 downregulation ja miR-15b , miR-16, miR-146a, ja miR-155 säätelyä. Toiminnalliset tutkimukset osoittivat, että sekä miR-143 ja miR-145 ovat ehkäisevä solun kasvua. Kun tuodaan solulinjat, miR-146a havaittiin edistää soluproliferaatiota. Yhdessä meidän tiedot osoittavat, että downregulation miR-143 ja miR-145 ja ylössäätely miR-146a rooli kohdunkaulan syövän syntymistä.

Citation: Wang X, Tang S, Le SY, Lu R, Rader JS , Meyers C, et ai. (2008) Poikkeava ilmentäminen onkogeeninen ja kasvain heikentävän MikroRNA kohdunkaulan syövän tarvitaan syöpäsolujen kasvua. PLoS ONE 3 (7): e2557. doi: 10,1371 /journal.pone.0002557

Editor: Dong-Yan Jin, University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 10 huhtikuu 2008; Hyväksytty: 13 toukokuu 2008; Julkaistu: 02 heinäkuu 2008

Tämä on avoin-yhteys artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Public Domain ilmoitus, jonka mukaan, kun se on saatettu julkisia, tämä työ saa vapaasti kopioida, levittää, lähetetään, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee Intramural tutkimusohjelma NIH, National Cancer Institute, Center for Cancer Research ja NIH avustukset CA 94141 ja CA 95713to JSR ja CA 79006 CM

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kohdunkaulan syöpä on yksi yleisimmistä syövistä naisilla maailmanlaajuisesti, joiden arvioitu maailmanlaajuinen esiintyvyys 470000 uutta tapausta ja noin 233000 kuolemantapausta vuodessa [1], [2]. Kohdunkaulan syöpä on johtava kuolinsyy syöpään monissa vähän resursseja maissa laajalti seulonta irtosolunäyte ei ole käytettävissä. Ilmaantuvuus on pienempi kehittyneissä maissa seurauksena kohdunkaulan ja edelleen vaikuttavan terveyteen koulutusohjelmiin. Kohdunkaulan syöpä hinnat Yhdysvalloissa arvioitiin kuin 10370 uutta tapausta ja 3710 kuolemantapausta vuonna 2006 [3]. Välisen syy korkean riskin HPV (HR-HPV) infektio ja kohdunkaulan syöpä on hyvin dokumentoitu epidemiologisissa ja toiminnallisia tutkimuksia. Korkean riskin HPV, kuten HPV16, HPV18 ja HPV31, on havaittu jopa 99,7% kohdunkaulan okasolusyöpää ja 94% -100% kohdunkaulan adeno- ja adenosquamous karsinoomien [4], [5]. Korkean riskin HPV onkoproteiineja, E6 ja E7, edistää kohdunkaulan syövän synnyn inaktivoimalla solun tuumorisuppressori proteiinien p53 ja pRb vastaavasti [6] – [8].

miRNA ovat sääntely, ei-koodaavat RNA: t noin 21-23 nukleotidin pituisia ja ne ilmaistaan ​​tietyissä vaiheissa kudosten kehityksen tai solujen epänormaali erilaistuminen, ja on suuren mittakaavan vaikutuksia ekspressioon eri geenien transkription jälkeisellä tasolla. Kautta emäspariutumisvuorovaikutusten sen kohdennettuja mRNA: t, eli miRNA indusoi RNA: n hajoamisen tai translaation tukahduttaminen kohdennettujen selostukset [9], [10]. Cellular miRNA transkriptoidaan RNA-polymeraasi II niin kauan, rajattu polyadenyloitua ensisijainen miRNA (PRI-miRNA) transkriptien jossa on varsi-silmukka hiusneula rakenne -80-mukset [11]. Aikuinen miRNA syntyvät käsittelyn pri-miRNA kahdessa peräkkäisessä pilkkominen vaihetta välittävät kaksi RNaasi III entsyymejä, Drosha ja Dicer [12]. Drosha, monimutkaisissa kanssa DGCR8, pilkkoo pri-miRNA tietyn etäisyyden välein (noin 11 ep) varresta-yksijuosteiset RNA risteyksen tumassa antaa ennalta miRNA olevan -60-nt hiusneula kanssa 2-nt 3 ’uloke [13], [14]. Kun ennalta miRNA viedään sytoplasmassa exportin 5 [15], [16], se on sitten tunnustettu Dicer, kompleksissa dsRBD sisältävien kumppani HIV-1 TAR RNA-sitovan proteiinin (TRBP) [17], poistaa terminaalin silmukka, jättäen toisen 2-nt 3 ’uloke [18]. Tuloksena 21- 23-nt miRNA tuotteet sisältävät 2-nt 3 ’uloke kussakin lohkon ja toimivat toiminnalliset välituotteita RNAi että mRNA pilkkominen ja translaation vaimennus. Vaikka niiden biologiset toiminnot pysyvät suurelta osin tuntemattomia, viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että miRNA edistää erilaisten syöpien [19] ja voima toimivat tärkeä osa solun luonnollista vastustuskykyä virusinfektio [20] – [22]. On ehdotettu, että ainutlaatuinen miRNA ilmaisu profiilin tietyn syövän olisi hyödyllinen biomarkkeri syövän diagnosointiin [23] ja ennusteen [24]. Tässä tutkimuksessa käytimme erilaisia ​​lähestymistapoja profiloida miRNA ilmentymisen kohdunkaulan syövän kudoksista ja kohdunkaulan syövän solulinjat samoin kuin HPV-tartunnan emättimen keratinosyyteissä. Osoitamme, että osajoukko miRNA merkittävästi väärin säädellystä kohdunkaulan syöpiä ja pre-neoplastisia vaurioita.

Tulokset

miRNA mentymisprofiili kohdunkaulan syövän solulinjoissa

ilmentymisen tutkimiseksi profiilit miRNA kohdunkaulan syövän soluissa, me eristetty kokosolu RNA kohdunkaulan syöpää peräisin CaSki- C-2-solut, jotka sisältävät ~500 kopioita HPV16-genomin solua kohti. Fraktioitu RNA: iden koot 15-30 mukset kloonattiin ja sekvensoitiin perustuvat julkaistun protokollan [25]. Kaiken kaikkiaan olemme kloonattu yhteensä 174 miRNA 363 cDNA-kloonia, jotka ryhmiteltiin 46 eri miRNA lajien (taulukko 1), jossa miR-21, miR-24, miR-27a, ja miR-205 on yleisin. Ei HPV16-johdettu miRNA kloonattiin tähän seulontaan, kaikki miRNA olivat solu. Mielenkiintoista on, huomasimme, että kopiot kloonataan miR-21 ja miR-205 oli heterogeeninen 3′-päissä, ja ylimääräinen C nukleotidin 3′-päähän 68% miR-21: sta ja ylimääräinen U 3 ’ lopussa 33% miR-205: sta, luultavasti peräisin huojunnan pilkkomalla ennen miRNA by Dicer (Fig. 1). Lisäksi uusi alalaji miR-193, miR-193c (GenBank: EF100863), tunnistettiin kolme kertaa seulonta ja varmistettiin Northern blotting. MIR-193c alalaji eroaa miR-193B yhden nukleotidin asemassa nt 21 ja puute kolme yhteyttä 3′-päähän (miR-193B, 5’-aacuggcccucaaagucccgcuuu-3 ’; miR-193c, 5’-aacuggcccucaaagucccga -3 ’). Ilmentymisen profiili juuri tunnistettuja miR-193c, joka on 3-nt pienempi kuin miR-193B on samanlainen kuin miR-21 HeLa-soluissa ja 293-soluissa, mutta vähemmän runsas kuin miR-27a. HeLa- ja 293-solut tuottivat havaittavaa miR-205 kuin kaksinkertainen nähty CaSki- soluissa (kuvio. 2A).

Nuolet edeltäneestä miRNA osoittaa huojunnan-ruoansulatusta sivustoja ennalta miR-21 A ja pre-miR-205 B, jotka tuottavat tuotteita, ylimääräisiä nukleotidia 3′-päässä. Sekvenssit punaisella vastaavat kypsä miRNA kun taas näkyy musta on osa ennalta miRNA joka poistetaan käsittelyn aikana.

. miR-193c ilmaisun CaSki-, HeLa- ja 293-soluja. CaSki ja sen alaklooneja C-V ja C-2-soluja [72] verrattiin HeLa (HPV 18

+) ja 293-soluja (HPV

-) ilmentämiseksi miR-193c northern-blottauksella. Kokonais-RNA (30 ug) peräisin CaSki, HeLa, ja 293-solut erotettiin 15% denaturoivalla polyakryyliamidigeelillä, blotattiin Gene Screen Plus kalvo, ja sitten tutkittiin erikseen tunteen (t) tai antisense-(as) miR -193c koetin. Tämän jälkeen kalvo uudelleenseulottiin antisense-koettimia miR-21, miR-27a, miR-205, tai vastaavasti U6. B. miRNA ilmentyminen kohdunkaulan syövän solulinjat. Yhteensä solu-RNA (30 ug) uutettiin eri solulinjojen kanssa tai ilman HPV-infektio. Northern blotting käytettiin ekspression tutkimiseksi 10 miRNA kahdeksan syöpäsolulinjasta, kahden W12 solujen subklooneja, HaCaT-soluja, normaali kohdunkaulan, ja kohdunkaulan syövän kudoksissa (Ambion). C. alassäätely miR-143 kohdunkaulan syövän kudoksissa. Yhteensä RNA: iden kaksi paria normaalin (NT) kohdunkaula vs kohdunkaulan syöpää (Ca) kudoksiin kliinisistä näytteistä ja yhdet normaalin kohdunkaulan ja kohdunkaulan syöpä ostettu Ambion verrattiin ekspressiota miR-143 northern-blottauksella. U6 myös blotattiin sisäisenä kontrollina näyte lastaus paneelin A, B, ja C.

Näiden kloonauksen tulosten me edelleen seulotaan useita käytettävissä kohdunkaulan syövän solulinjoja tai ilman HPV-infektio northern blottauksella ilmentämiseen 8 miRNA suhteellisen korkeita kloonauksen taajuus ja 2 miRNA (miR-143 ja miR-145), joita ei ole eristetty meidän kloonaus (taulukko 1). Kahdeksan kohdunkaulan syövän solulinjoissa; kaksi isolaatit W12 solulinjan (20861 integroidulla HPV16 genomeja ja 20863 kanssa episomaalinen HPV16 genomit) alunperin eristettiin CIN-muutos (CIN) koepala kudoksissa [26] ja HaCaT soluja (ikuiseksi HPV-negatiivisten ihon keratinosyyttisolulinja) [27 ] tutkittiin ekspressiota 10 miRNA. Laitepari yhteensä RNA: iden kohdunkaulan syövän ja viereisten normaali kohdunkaulan kudoksissa kaupallisesti saatu Ambion verrattiin myös. Kaikki solulinjat ja kohdunkaulan syövän kudoksissa osoitti samanlaista miRNA ilme profiilin. Tämä miRNA profiili poikkesi normaalista kohdunkaulan kudoksista, joilla on alentunut ilmentyminen miR-27a, miR-143, ja miR-145 (Fig. 2B). Sen sijaan, kohdunkaulan syöpä kudoksen ja solulinjat, paitsi SiHa (HPV 16

+), HeLa (HPV18

+) ja C33A-solut (HPV

-), oli kasvanut ilmentyminen miR-205, kun verrattuna normaaliin kohdunkaulan kudoksen (Fig. 2B). SiHa-, HeLa, ja C33A solut eivät ilmentymistä miR-205. Kaikissa solulinjoissa, ekspression miR-143 ja -145 oli vähemmän kuin mitä havaittiin kohdunkaulan syövän kudosta. Läsnäolosta huolimatta joitakin eroja ilmaisua yksittäisten miRNA yhdestä solulinjasta toiseen, emme voineet määrittää ilmaus profiilia ne, jotka havaittiin miRNA korrelaatio läsnäoloon integroidun tai episomaalisen HPV genomeja. Vaimennussäätely miR-143, joka on peräisin samasta miRNA esiaste miR-145 [28], vahvistettiin edelleen olla syöpää erityinen vertaamalla sen ilmentymistä kohdunkaulan syövän kudoksissa normaalin kohdunkaulan (Fig. 2C).

miRNA ilmaisun profiilin normaalissa ja syöpä- kohdunkaulan kudosten

Koska meidän kloonausta lähestymistapa on rajoitus eristettyä alhainen runsas miRNA ja Pohjois-blottauksella rajoittavat koetin valittu, kahta menetelmää ei voi olla paras erottamaan eroa yhdestä solulinjasta toiseen miRNA ilmaisun profiilin. Tutkia tarkemmin, ovatko miRNA ilmentyvät eri kohdunkaulan syövän kudoksissa, keräsimme viisi paria samanikäisiin normaali ja syöpä- kohdunkaulan kudosten ja verrattiin niiden ekspressioprofiileja käyttäen miRNA erilaisia ​​analyysi sisältävän 455 miRNA. Vain neljä näytettä paria kelpuutettu lopulliseen klusterointi analyysi määritettynä näyte johdonmukaisuus analyysejä. Lauseke runsaus analyysi, joka perustuu signaalin tiheys ≥20,000, osoitti, että sekä normaalissa ja syöpä- kohdunkaulan kudoksissa oli runsas ilmentyminen miR-23a, miR-23b, let-7a, let-7c, ja anna-7d, kun taas korkea ilmentyminen miR-26a, miR-29a, miR-99a, miR-100, miR-125b, miR-143, miR-145, miR195, ja miR-199 havaittiin vain normaali kohdunkaulan kudoksissa, ja korkea ilmentyminen miR-16, miR-21, miR-205, ja anna-7f havaittiin vain kohdunkaulan syövän kudoksissa, siitä huolimatta suhteellisen alhainen miR-16 ja miR-21 havaittiin homogeenisesta solupopulaation joissakin solulinjoissa (kuvio. 2B). Expression of miR-143 ja miR-145 osoitti yli 2,7-kertainen vähentäminen kohdunkaulan syöpä kudoksiin. Käyttämällä klusterointia analyysi, me havainneet merkittäviä voimistunutta ilmentymistä 18 miRNA kohdunkaulan syövän ja 15 miRNA normaalissa kohdunkaula (Fig. 3A, miRNA punaisena) (P 0,05, t-testi). Tarkastusta, joukko valitun miRNA koettimilla suorittamaan Northern blot analyysi kaksi normaalia ja kaksi syöpänäytteissä. Pystyimme vahvistamaan, että syöpä kudoksiin oli vähentänyt ilmentymistä miR-126 ja miR-424, ja lisääntynyt ilmentyminen miR-15b, miR-16, miR-146a, miR-155, ja miR-223 (Fig. 3B ja 3C), kun yksittäiset miRNA tasolla kussakin näytteessä kvantitoitiin ja normalisoitiin U6 ilmentymisen.

Kokonais-RNA (5 ug) eristettiin samanikäisiin normaalia kohdunkaulan kudoksissa (NT) ja kohdunkaulan syövän kudoksissa (Ca) analysoitiin by miRNA erilaisia ​​analyysi. Syöpäkudoksessa 1, 3, ja 5 infektoitiin HPV16 ja syöpäkudoksessa 4 infektoitiin HPV45. A. klustereiden kuvaaja luotiin käyttäen hierarkkista menetelmää niiltä miRNA liittyy signaalin tiheys on enemmän kuin 1000 ja osoittaa lisääntynyt (punainen) tai pienentää (vihreä) lauseke (P 0,05) yksittäisten miRNA 4 samanikäisiin normaali ja syöpä kohdunkaulan kudosten (taulukko S1). Pylväs kenttään merkitään yksittäisen näytteen koodi määrityksessä. Kullakin rivillä näkyy ekspressiokuviota yksittäisten miRNA kuin log2 transformoitujen ilmaisun suhteen, joilla on eniten läheisesti liittyvät ilme liittynyt sivuliikkeen ja aihekokonaisuuksien keskimäärin sidottu algoritmia. Branch pituudet heijastaa astetta samankaltaisuuden miRNA ekspressiokuvioita. Väriskaala päällä paneelin edustaa astetta ilmaisun perustuu kalibroitu suhteen. Vihreä ilmaisee alempi lauseke keskimääräiseen verrattuna (nolla), musta merkitsee lausekkeen arvo on keskiarvo, ja punaisella suurempi ekspressio keskimääräiseen verrattuna. B. tarkastaminen miRNA mentymisprofiili northern blottauksella. Yhteensä solu-RNA (30 ug) eristettiin kustakin kudoksesta seulottiin yksittäisiä antisense oligo jokaiseen merkitty miRNA. Lisäksi bändi kussakin blot osoittaa huojunnan tuotteen Dicer ruoansulatusta. C. Pylväsdiagrammit osoittavat suhteelliset tasot tutki miRNA normalisoitu U6 RNA kussakin kudoksessa paneelissa B.

miRNA mentymisprofiili HPV-tartunnan, keratinosyyttispesifisestä johdettu lauttaa kudoksia

tutkimiseksi, ovatko havaitut miRNA allekirjoitusten kohdunkaulan syövän kudoksissa ovat ominaisia ​​kohdunkaulan syöpä, tarkastelimme miRNA ilmentymistä pre-neoplastisia vaurioita. Puute perinteisen soluviljelmien HPV kertominen on pitkälti hillitty ymmärrystämme HPV elinkaaren ja synnyssä. Kuitenkin, tarttuva HPV on onnistuneesti valmistettu lauttaa viljelmät ovat peräisin ihmisen keratinosyyttien [29], [30] ja induktio pre-neoplastisten leesioiden lauttaa kudoksissa HPV-infektio, jossa morfologia on samanlainen kuin kohdunkaulan epiteelin sisäinen neoplasia [31] tekee tämän järjestelmän suuri etu tutkimuksemme. Käyttämällä miRNA array analyysit, vertasimme ekspressioprofiilit 455 ihmisen miRNA in HPV18-tartunnan ensisijainen ihmisen emättimen keratinosyyttejä (HVKs) yksikerrosviljelmissä ja ositettu ja eriytetty lauttaa kudoksiin. Ilmaus runsaasti analyysi, joka perustuu signaalin tiheys ≥20,000, osoitti, että miR-21, miR-23a, miR-23b, miR-26a, miR-205, anna-7c, ja anna 7F ilmentyy runsaana HVKs sekä yksikerroksisessa kulttuureissa ja lauttaa kulttuureissa. Kolme miRNA runsaasti ilmaista vain yksikerrosviljelmissä (miR-24, miR-29a, ja miR-221) ja 11 miRNA runsaasti ilmaista ainoastaan ​​kerrostunut ja eriytetty lautta kulttuureissa (miR-27a, miR-27b, miR-200b, asennuspalveli- 200c, miR-203, miR-638, let-7a, let-7b, let-7d, let-7e, ja anna-7g). Käyttämällä klusterointia analyysissa vielä päättäneet, että 16 miRNA oli voimistunut (Fig. 4A, lautta punaisella) ja 25 miRNA olivat vaimentua (Fig. 4A, lautta vihreä) lauttaa kulttuureissa verrattuna ilmentymisen tasoa vastaava yksikerroksista viljelmät (P 0,05, t-testi). Vahvista havaintojen pariksi analysoitiin miRNA ilmentymisen northern blottauksella käyttämällä joukko erityisiä miRNA koettimet (Fig. 4B ja 4C). Kvantitointi kullakin miRNA tason kussakin näytteessä normalisoitu U6 ilme. Me vahvisti, että ilmaus miR-26b, miR-195, ja miR-200C nostettiin lauttaa kulttuureissa, mutta ilmaus miR-143 ja miR 145 vähennettiin (Fig. 4B ja 4C). Runsastuminen miR-200c osoittaa 67% enemmän ilmaisun lautoille kuin yksikerrosviljelmiin (P 0,08) mukaan erilaisia ​​analyysi varmistettiin Northern blotting. Vaikka ylössäätely miR-15a ja miR-223 ja downregulation miR-218 ja miR-424 havaittiin sekä lauttojen (pre-neoplastisia vaurioita) ja kohdunkaulan syövän kudoksissa, suurin osa miRNA ilmaisun allekirjoituksia ei osoittanut korrelaatiota kaksi kudoksissa (vertaa Fig. 4A kuvioon. 3A). Kuitenkin downregulation miR-146a huomattiin lauttaa kulttuureissa sijaan lisääntymistä havaittiin kohdunkaulan syövän kudoksissa ja vahvistettiin edelleen Pohjois-blottauksella (kuvio. 5), mikä osoittaa, että säätelyä miR-146a ilme on kohdunkaulan syöpä-erityinen. Sitä vastoin hieman voimistunutta ilmentymistä miR-21 ja miR-26b havaittiin sekä pre-neoplastisia vaurioita (HPV-tartunnan lautat) ja kohdunkaulan syöpä kudoksiin ja siten niiden ekspressio näyttää ole syöpä-spesifinen (Fig. 5).

lauttaa kudokset (viljelmät) kanssa HPV18: infektio olivat peräisin ihmisen emättimen keratinosyyttien (HVKs) yksikerrosviljelmissä kanssa HPV18: DNA-transfektio. Yhteensä solun RNA: ta (5 ug kutakin) uutetaan kustakin soluja verrattiin rinnan miRNA ilmaisun käyttämällä miRNA array analyysejä. A. klusterointi kuvaaja luotiin hierarkkisen menetelmällä kuin miRNA signaalilla tiheys on enemmän kuin 1000, saatu kolme riippumatonta transfektioissa kussakin ryhmässä (taulukko S2). Käyrä osoittaa vähentynyt (vihreä) tai lisääntynyt (punainen) lauseke (p 0,05) yksittäisten miRNA peräisin eriyttämätön HVKs yksikerrosviljelmiin (Mono) vs. ositettu ja eriytetty HVKs lautoille. Katso muita yksityiskohtia kuvassa. 3A. B. todentaminen miRNA lausekkeen eriyttämätön HVKs yksikerrosviljelmiin ja ositettu ja eriytetty HVKs lautoille northern blottauksella. Yhteensä solu-RNA (30 ug kutakin) eristettiin eriytetty tai erilaistumaton HVKs koetettiin valittu miRNA koettimet. C. Pylväsdiagrammit osoittavat suhteelliset tasot tutki miRNA normalisoitu U6 RNA kussakin näytteessä paneelissa B. M = yksikerrosviljelmään, R = lautta.

. Yhteensä RNA: iden HVKs kaksi lautat ja kaksi yksikerroksista (mono) viljelmiä verrattiin kahteen kohdunkaulansyöpä (Ca) kudosten ilmentymisen miR-146a northern blottauksella. Ilmentymistasojen miR-21 ja miR-26b tarkasteltiin miRNA valvontaa. Pieni ydinaseiden RNA U6 myös blotattiin sisäisenä kontrollina näyte lastaus. B. Pylväsdiagrammit osoittavat suhteelliset tasot tutki miRNA normalisoitu U6 RNA kussakin näytteessä paneelissa A. M = yksikerrosviljelmään, R = lautta.

alennetulla miR-143 ja miR-145 in kohdunkaulan solumuutoksia ja kohdunkaulan syöpä ovat tukahduttava kohdunkaulan syöpäsolujen kasvua

on osoittanut merkittävän downregulation miR-143 ja miR-145 kohdunkaulan syövän ja pre-neoplastisia vaurioita, tutkimme onko downregulation on tärkeää kehittämiseen kohdunkaulansyöpä. Tämän kysymyksen osoittamiseksi, synteettinen miR-143 ja miR-145 lähtöaineiden transfektoitiin lyhytaikaisesti HeLa-soluissa, ja vaikutus yli-ilmentymisen niiden kypsä miRNA HeLa solujen kasvua arvioitiin solujen laskenta. Kuten on esitetty kuviossa. 6, sekä miR-143 ja miR 145 havaittiin tukahduttava (p 0,005 Mir-143 ja p 0,008 Mir-145,

t

-testi) ja HeLa solujen kasvua. Tämä tukahduttava vaikutus solujen kasvuun ei ollut välitöntä soluvasteen; pikemminkin, kahden peräkkäisen Solutransfektiot keskenään miRNA välein 48 tuntia tarvittiin. Tiedot viittaavat siihen, että molemmat miR-143 ja miR 145 luultavasti vaimentua kohdunkaulan solujen syövän etenemiseen.

. miR-143 ja miR-145 ovat tukahduttava varten HeLa solujen kasvua. Nuolet osoittavat ajankohtina, jolloin solut saivat tietyn miRNA (30 nM) transfektion. Elävät solut kussakin ryhmässä laskettiin osoitettuina ajankohtina. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD kahdesta kokeesta, joista kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena. B. suhteelliset tasot miR-143 ja miR-145 HeLa-soluissa 96 tunnin kuluttua ensimmäisen ohimenevän transfektion. Yhteensä solun RNA uutetaan tutkittiin miRNA ligaatiomääritys. TRNA-taso kussakin näytteessä käytettiin latauskontrollina.

Lisääntynyt miR-146a kohdunkaulan syövän edistää solujen lisääntymistä

Kun otetaan huomioon 6-kertainen miR-146a ilmentyminen kohdunkaulan syöpä kudoksiin, me arveltu, että korkeatasoinen miR-146a voisi olla rooli kohdunkaulan syöpäsolujen kasvua. Meidän alkuperäinen lähestymistapa käyttäen anti-miR-146a estäjiä tai käyttämällä morphonino-oligo estää miR-146a kypsymisen kaataa miR-146a ilmentymistä kohdunkaulan syövän solulinjoissa onnistunut indusoimaan fenotyypin vaikutusta (tietoja ei esitetty). Yllätykseksemme huomasimme, että kaikki kohdunkaulan syöpäsolulinjasta ilmaisi havaittavaa miR-146a (Fig. 7A). Sen jälkeen, miR-146a otettiin käyttöön hetkellisellä trans- HeLa-soluja, HPV18

+ kohdunkaulan syövän solulinja, ja HCT116-soluja, paksusuolen ja peräsuolen syövän solulinja (Fig. 7B). Hidas, mutta huomattavasti solujen lisääntymisen tehostuneen sekä HeLa (p 0,009

t

-testi) ja HCT116 (P 0,019

t

-testi) soluja havaittiin, kun läsnä oli eksogeenisia miR-146a. Laskemalla solujen määrä kustakin ryhmästä, olemme osoittaneet, että sekä HeLa-soluja ja HCT116-solut, jotka sisältävät miR-146a oli kahdentumisaika 2-3 tuntia nopeammin kuin solut miR-kontrolleihin (Kuva. 7C ja 7D). Nämä tiedot viittaavat siihen, että miR-146a toimii kasvutekijä kohdunkaulan syövän.

. Ei ilmentyminen miR-146a kohdunkaulan syövän solulinjat ja ihmisen ihon johdettu keratinosyyttisolulinja, HaCaT soluja. Yhteensä solu-RNA uutettiin yksittäisen solun linjan ja tutkittiin miR-146a ja miR-21 ilmentyminen northern-blottauksella. U6 kussakin näytteessä toimi näyte lastaus valvonta. B. suhteellinen taso miR-146a HeLa ja HCT116-solujen 96 tunnin kuluttua ensimmäisestä transfektion. Kokosolu-RNA: ta kustakin ryhmästä tutkittiin Northern-blottauksella. C ja D. miR-146a edistää solujen lisääntymistä. Nuolet osoittavat ajankohtina, kun solut saivat transfektoimalla miR-146a tai miR-ohjaus (30 nM). Elävät solut kussakin ryhmässä laskettiin osoitettuina ajankohtina. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD kahdesta kokeesta, kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa osoitimme miRNA ekspressioprofiileja kohdunkaulan syövän ja HPV-infektion aiheuttama pre- uudisvaurioiden lauttaa kudoksissa. Vaikka sekä kohdunkaulan syövän kudosten ja HPV-tartunnan lauttaa kudosten kanssa pre-neoplastisia vaurioita osoitti ylössäätely miR-15a ja miR-223 ja vaimennussäätely miR-143, miR-145, miR-218, ja miR-424, suurin osa mirna ilmaus ei osoittanut korrelaatiota kaksi kudosten ja voi rajata taudin etenemistä. Kuitenkin korkean miR-146a ilmentyminen havaittiin olevan kohdunkaulan syöpää erityinen, koska sen ilmentyminen alassäädetty sekä normaaleissa kudoksissa ja HPV-tartunnan lautta kudosten kanssa pre-neoplastisia vaurioita.

löytäminen downregulation miR-143 ja miR-145 ja ylössäätely miR-146a kohdunkaulan syöpä oli erityisesti houkutteleva kahdesta syystä: (1) miR-143 ja miR-145 ilmennetään samasta miRNA esiaste [28] ja vaimentua myös HPV aiheuttama pre-neoplastisia vaurioita, meidän tapauksessamme HPV-tartunnan lauttaa kudoksissa, mikä viittaa siihen, että niiden vähentäminen tapahtuvat varhaisessa vaiheessa ennen syövän kehittymisen. Downregulation miR-143 ja miR-145 on havaittu useissa muissa syövissä, mukaan lukien peräsuolen syöpä [32], B-solujen lymfooma [33], ja äskettäin kohdunkaulan syövän [34], [35]. Näin ollen meidän havainto on tärkeä ymmärtää mekanismeja, joilla miR-143 ja miR-145 ovat mukana karsinogeneesissä. Inhibitio miR-143 ja miR-145 HeLa solujen kasvua tarkoittaa, että miR-143 ja miR 145 luultavasti vaimentua, jotta syövän kasvua. (2) lisääntymisen merkkejä miR-146a kohdunkaulan syövän kudoksissa, mutta ei HPV-indusoidun pre-neoplastisia vaurioita tai syövän solulinjat osoittavat, että miR-146 ilmentyminen on kohdunkaulan syöpä-spesifinen. Eri tutkimukset osoittavat, että miR-146a on NF-kappaB-riippuvaista geenin [36] – [38]. Expression of miR-146a näyttää vaihtelevan eri syövän kudoksissa, jossa tehostettuun miR-146a havaittiin Burkittin ”lymfooma linjat EBV-LMP1 (piilevä kalvo proteiini 1) ilmaisu [37], [38], mutta laski taso hormoni tulenkestävät eturauhassyöpä [39] ja papillaarinen kilpirauhassyövän [40]. Kohdunkaulan syövän, voimistumista miR146a ilmaisun näyttää liity mitään HPV-geenin ilmentymisen koska sen ilmentymistä jopa vähennetty tuottavasti HPV-tartunnan lauttaa kudoksiin. Mielenkiintoista on, että kaikki kohdunkaulan syövän solulinjat ja ihon keratinosyyttisolulinja tutkittiin ei sisällä havaittavaa miR-146a, viittaa siihen, että miR-146a kohdunkaulan syövän kudoksissa ilmentyminen lisääntyy kertoimella puuttuu homogeeninen solupopulaatio tai ilmaistaan ​​toisen tyypin solujen syöpä kudoksiin. Näin ollen päättelemme, että ylössäätely miR-146a ekspressio kohdunkaulan syöpä on hyödyllistä syövän kasvua käyttöönoton miR-146a syöpäsoluiksi lisääntynyt solujen kahdentumisaika ja edistää soluproliferaatiota.

Noin 800 ihmisen miRNA on ennustettu . Näistä yli 450 (https://microrna.sanger.ac.uk/sequences, 2006) on nyt tunnistettu ihmisen [41], [42] [43], [44], ja niiden toiminnot ovat alkaneet selvittämättä [45]. Tässä tutkimuksessa olemme kloonattu ja tunnistettu 174 miRNA jotka ryhmiteltiin 46 eri miRNA lajia. Uusi alalaji miR-193, miR-193c, oli myös kloonattu ja tunnistettu meidän miRNA kirjastosta seulonta. Seulonta 10 johdetut solulinjat kohdunkaulan syövän tai CIN kudoksissa ekspression 10 miRNA ehdotti, että läsnäolo tai puuttuminen yhdistetty tai episomaalisen HPV-genomeja ei ole vaikutusta ekspression analysoitiin miRNA. Lisäksi emme pystyneet tunnistamaan yhden HPV16-johdettu miRNA HPV16

+ CaSki- soluista tätä lähestymistapaa, vaikka muut ydinvoiman DNA-viruksia tehdä koodata miRNA [46], mukaan lukien EBV [47]; KSHV [48] – [50]; HSV-1 [51], [52]; ja SV40 [53]. Negatiivinen kloonauksen HPV16 johdettujen miRNA viittaa siihen, että integroitu HPV16 genomiin CaSki- soluissa näyttää ole ilmaista viruksen miRNA. Toisessa tutkimuksessa eriytetyn HPV31

+ LKP1 solut, jotka sisältävät -50 kopioita episomaalisessa HPV31-genomin solua kohti myöskään tunnistaa virusperäisten miRNA [54].

Viimeaikaiset raportit ovat osoittaneet, että miRNA edistävät erilaisten solujen toiminnot [41] ja ne ovat mukana kehittämässä ihmisen syövissä [19]. Esimerkiksi, miR-32 ohjaa solun resistentiksi retrovirusinfektiota [55]. Klusterin kuuden miRNA ihmisen kromosomissa 13 säätelee c-Myc, ja c-Myc-säännelty miR-17-5p ja miR-20a negatiivisesti ilmentymisen moduloimiseksi E2F1, transkriptiotekijä [56]. miRNA on myös ominaista äskettäin mahdollisina onkogeenien, jotka edistävät ihmisen B-solulymfooma (miR-17-92 cluster) [57] sekä lisääntymistä ja kasvaimen kehittymisen primaaristen ihmisen soluja (miR-372 ja miR-373) neutraloimalla p53-välitteisen CDK inhibition [58]. Toinen tutkimuksessa todettiin, että yli-ilmentyminen miR-17-5p, miR-20a, miR-21, miR-92, miR-106a, ja miR-155 voisi pitää miRNA allekirjoitus kiinteän syövän [59]. Tässä raportissa 18 miRNA oli voimistunut ja 15 miRNA oli vaimentua kohdunkaulan syövän kudoksissa. Lisääntynyt ilmentyminen miR-15b, miR-16, miR-146a, miR-155, ja miR-223, että me havaittu kohdunkaulan syövän kudoksissa on myös liitetty kehittämiseen ihmisen muiden syöpien: miR-15 ja miR-16 apoptoosia säätelevissä kohdistamalla BCL2 [60] ja niiden mutaatio on liittynyt krooninen lymfaattinen leukemia [61]; miR-16 on myös mukana valvonnassa sytokiinien RNA epävakauden [62]; miR-146b tasot ovat erittäin lisääntyneet papillaarinen kilpirauhassyövän [40]; miR-155 on hiljattain ollut mukana kehittämässä lymfoblastisen leukemian /korkealaatuisesta lymfooma [63] ja keuhkosyövän [24] ja säätelyssä ihmisen fibroblastien angiotensiini II tyypin 1 -reseptorin ilmentymisen [64]; miR-223, yhdessä transkriptiotekijöiden C /EBPa ja VMI-A, osallistuu sääntely granulosyyttistä erilaistumisen tukahduttamalla transkriptio VMI-A mRNA [65].

Vaikka kypsä miRNA peräisin niiden ensisijainen selostukset kautta Drosha ja Dicer ruoansulatusta kahdessa erillisessä trimmausta reaktiot sisältävät 2-nt 3 ’ylitys jokaisen osan, Dicer ruoansulatus esi-miRNA ei aina suoritettu tarkasti. Tämä näkyi miR-21 ja miR-205 eristetty tässä tutkimuksessa. Olemme havainneet, että yli 68%: n miR-21 eristettiin CaSki-soluja oli ylimääräinen C 3′-päähän ja 33% miR-205 eristetty sisälsi ylimääräisen U 3’-päähän, mutta ylimääräisiä nukleotidi- ei koskaan tunnistaa 5 ’päissä on joko miRNA. Verrattuna vastaavan pre-miRNA-sekvenssi, ylimääräinen C on miR-21 ja U on miR-205 havaittiin olevan peräisin suoraan nukleotidin 3 ’pilkkomiskohdan, viittaa siihen, että Dicer ruoansulatusta on huojunta mekanismin . Tämä havainto pienten RNA kloonaus voidaan edelleen todentaa kaksinkertainen taajuusalueiden miR-21 (Fig. 5A ja Fig. 7A) ja Mir-205 (Fig. 2A ja 2B) Northern blot-analyysit. Meidän havainnot ovat yhdenmukaisia ​​muiden raporttien saatu biokemiallisia analyysejä, jotka Dicer käyttää 3 ’päähän laskenta sääntö ja mittaa etäisyys ~22 nt 3’-päässä pilkkomaan molempia RNA-juosteita, 1- ja 2-nt muutoksia edullinen pilkkominen kannasta [18], [66].

Materiaalit ja menetelmät

Soluja, kudoksia, ja lauttaa viljelmät

Kahdeksan kohdunkaulan syövän solulinjoja käytettiin määrityksissä : HPV16

+ CaSki- ja SiHa-, HPV18

+ HeLa ja C4II, HPV68

+ ME180 [67], ja HPV31

+ CIN612 6E ja 9E soluja. Kaksi HPV16

+ W12 alakloonien (20861 ja 20863) alunperin eristettiin heikompilaatuisen kohdunkaulan leesion histologisesti diagnosoitiin CIN I [26] käytettiin myös vertailun vuoksi. Näistä solulinjoista, 20863 ja 9E solut sisältävät episomaalisen muoto HPV-genomin, ja 20861 ja 6E solujen on integroitu HPV-genomin [68], [69].