Krooninen sairaus

tiivistelmä

ylivoimainen todisteet ovat osoittaneet, että poikkeava ekspressio ihmisen trophoblast solun pinta-antigeeni (TROP2) liittyi kasvaimen aggressiivisuus ja huonon ennusteen erilaisia ​​ihmisen syövissä, mutta roolit TROP2 vuonna kohdunkaulan syöpä ei ole tutkittu. Tarkoituksena Tutkimuksemme oli valottaa ennustetekijöiden merkitystä TROP2 ilmentymisen potilailla, joilla on kohdunkaulan syöpää ja määrittää sen vaikutus syövän etenemiseen. Immunohistokemia määritys osoitti, että 88,7% (94/106 tapausta) kohdunkaulan syövän näytteet, jotka värjäytyivät positiivisesti TROP2, ja yli-ilmentyminen TROP2 oli läheisessä FIGO vaiheessa, histologiset laadut, imusuonten etäpesäke, invasiivisia interstitiaalinen suunnassa ja korkea ekspressio Ki-67 . Potilaat, joilla TROP2-positiivista värjäytymistä osoitti merkittävästi vähentynyt eloonjäämiseen ja ilman taudin etenemistä; se oli myös itsenäinen ennustaja ennusteen mukaan monimuuttujamenetelmin. Lisäksi alas-säätely TROP2 välittämän siRNA Siha ja CaSki solut johti vahva lisäkasvun estäminen ja invaasio, TROP2 kumota myös kohonnut apoptoottisten suhde ja aiheutti G1 pidätykseen. Käänteisesti täytäntöön ilmentyminen TROP2 HeLa ja C33A-solut huomattavasti edistänyt solujen kasvua, muuttoliikkeen ja hyökkäystä. Lisäksi, kasvaimia toiminta TROP2 liittyi lisääntynyt ilmauksia sykliini D1, sykliini E CDK2 ja CDK4: n, mutta vähentää ilmentymistä p27 ja E-kadheriinin aktivaation kautta Erk1 /2 signalointireitin. Lisäksi esto TROP2 ekspression kohdunkaulan syövän solulinjoissa parantaa herkkyyttä sisplatiinia. Tämä tutkimus viittaa siihen, että yli-ilmentyminen TROP2 voi olla ratkaiseva rooli kehittämisessä ja patogeneesi ihmisen kohdunkaulansyövän siis TROP2 voi edustaa mahdollinen prognostinen indikaattori ja potentiaalinen terapeuttinen kohde kohdunkaulan syövän.

Citation: Liu T Liu Y, Bao X, Tian J, Liu Y, Yang X (2013) yli-ilmentyminen TROP2 ennustaa huono prognoosi Potilaat, joilla on kohdunkaulan syövän ja edistää leviämisen ja invaasion kohdunkaulan syövän solujen säätelemällä ERK Signaling Pathway. PLoS ONE 8 (9): e75864. doi: 10,1371 /journal.pone.0075864

Editor: Irina U. Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 10, 2013; Hyväksytty: 22 elokuu 2013; Julkaistu: 27 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Projekti tukivat National Natural Science Foundation of China ja Science (nro 81372809) ja teknologian kehityksen suunnittelu Shandong (nro 2011GSF12121). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kohdunkaulan syöpä on kolmanneksi yleisin maligniteetti naisten keskuudessa kaikkialla maailmassa [1], joiden arvioitu noin 530000 uutta tapausta ja 275000 naista kuolemaa vuosittain.

alkuvaiheen potilailla (I-II A) voi saada tyydyttävän tuloksen kautta radikaaleja tai sädehoidon, joiden kokonaispituus 5 vuoden eloonjäämistä 65%. Kuitenkin potilailla, joilla on edennyt pitkälle (IIB-IV) voidaan hoitaa vain sädehoitoa tai plus kemoterapia, 5 vuoden pysyvyys potilailla, joilla on vaiheen III on 25 35%, mutta vaiheessa IV on 15% tai vähemmän [2] , [3]. On olemassa useita korkean riskitekijöitä arvellaan tiiviisti epäedullinen kliinisistä tuloksista, mukaan lukien kehittyneet International Federation Naistenklinikka (FIGO) vaihe, suuri kasvain koon, imusolmuke etäpesäke, kaulan syvät strooman invaasio ja lymphovascular tilaa hyökkäystä. Potilaat, joilla on korkea riskitekijöitä aina vastustuskykyiseksi kemoterapiaa ja sädehoitoa, lopulta kuoli paikallisen uusiutumisen tai kaukana etäpesäke. Siksi on kiireesti etsittävä uusia biomarkkerit täydentävänä ennakoiva indikaattori varhaisen diagnoosin ja tarkka ennuste arviointi, mikä olisi hyödyllistä kohdentamisessa hoitoja kohdunkaulan syövän.

trophoblast solun pinta-antigeeni 2 (TROP2) on 36 kDa läpäisevä glykoproteiini kuuluvat kasvaimeen liittyvien kalsium signaalinmuuntajana (TACSTD) geeniperheen. Se tunnistettiin alun perin ihmisen trophoblast solulinjoissa, ja kohonnut ekspressio havaittiin erilaisten epiteelin karsinoomien, kun taas alhainen tai rajoittaa ekspressio havaittiin normaaleissa kudoksissa [4]. Lisäksi TROP2, epiteelisolujen adheesiomolekyyli (EpCAM) geeni on toinen erittäin konservoitunut jäsen TACSTD geeniperheen, ne jakavat 49% sekvenssihomologia sekä tyroglobuliiniin tyypin I ja interleukiini-2-reseptoreihin [5]. Vaikka asetus ilmentymisen TROP2 geeni ei ole täysin ymmärretty, fosforylaatiota sivustoja sytoplasmisen hännän alueen ja säilynyt tyrosiini- ja seriinifosforyloinnin sivuston katsotaan olevan tärkeä rooli signaalitransduktion. Varhaiset tutkimukset osoittivat, että ristisilloitukseen TROP2 vasta-aineiden kanssa johtaa sytoplasman kalsium- [Ca

2+] kasvoi kolme kertaa kuin perustaso, joka ehdotti liikkeelle Ca

2 + sisäisestä myymälöissä [6]. Kun fosfatidyyli-4, 5-bis fosfaatti (PIP2) sitoutuminen sytoplasmisen hännän TROP2, se voi mahdollisesti johtaa lisäys inositoli-1,4,5-trifosfaattia (IP3), joka on välttämätön Ca

2+ liikkeelle . Yhä Ca

2 + vapautuu Endoplasmakalvosto, proteiinikinaasi C (PKC) voitaisiin aktivoida positiivista palautetta mekanismi, joka voi puolestaan ​​johtaa fosforylaatioon enemmän TROP2, tämä prosessi voi olla merkittävä vaikutus aktivointiin RAF, MAPK ja NF-KB reittejä ja niin edelleen. [7]

Viimeaikaiset työ osoitti, että TROP2 käyttäytyi kuin todellinen onkogeenin johtaa kasvaimien syntyyn ja invasiivisuus kolorektaalisyövässä solulinjoissa [8], ja yliekspressio TROP2 läheisesti liittyy syövän etenemiseen ja huonon ennusteen. Tutkijat ovat havainneet, että bisistroninen sykliini D1-TROP2 mRNA ilmaistaan ​​usein munasarjojen, paksusuolen ja kohdun limakalvon syöpiä, ja sekä TROP2 ja sykliini D1-ryhmiä kimeeran voisi aiheuttaa solujen pahanlaatuisiksi [9]. Nämä havainnot viittaavat kaikki siihen, että TROP2 ei ole ainoastaan ​​mahdollisia ennusteen biomarkkeri, mutta myös ehdokas terapeuttisena kohteena, jota voitaisiin käyttää kehittämään innovatiivisia hoitostrategioita. Nykyisessä tutkimuksessa selvitimme TROP2 proteiinin ilmentymisen ja sen korrelaatio viittaavia tekijöitä ja kliinisiin tuloksiin kohdunkaulan syövän näytteissä. Lisäksi olemme arvioineet vaikutuksia TROP2 ilmaisun proliferaatioon, solusyklin ja invaasiota neljässä kohdunkaulan syövän solulinjoissa, myös määritettävä, onko TROP2 on merkitystä kemoterapiassa kohdunkaulan syöpää. Nämä tiedot voisivat antaa tietoja ennustamisessa kohdunkaulan syövän ennustetta ja perustaminen kohdennettujen hoitomuotojen.

Methods

ennusteeseen viittaavia tietoja kohdunkaulan syövän Potilaat

yhteensä 160 näytettä on saatu by booli koepala, kartio biopsia tai kohdunpoisto haettiin Patologian osasto, Qilu sairaalan Shandong University välillä huhtikuussa 2005 lokakuuta 2007 (taulukko 1). Tutkimuksessa oli mukana 106 potilasta, joilla kohdunkaulansyöpä (keski-ikä 43,6 ± 11,5 vuotta), 34 potilaalla CIN-muutos (CIN) (keski-ikä 40,2 ± 8,1 vuotta) ja 20 potilasta, joilla oli normaali kohdunkaulan kudoksissa (keski-ikä 46,4 ± 4,8 vuotta). Normaali kohdunkaulan kudosnäytteitä saatiin potilailta, joille tehtiin kohdunpoisto hyvänlaatuisen sileälihaskasvain. Kaikki ilmoittautunut osallistujia oli ehjä seurantatiedot ja eivät altistuneet sädehoitoa tai kemoterapiaa ennen kirurgista resektiota. Näytteet histopatologisesti vahvistettiin kolme patologit mukaan diagnostiset kriteerit. Kliinisessä vaiheessa kohdunkaulan syöpä luokiteltiin mukaan International Federation of Gynecology and Obstetrics (FIGO) kriteerit. Aikana seuranta-ajan (mediaani seuranta-60 kuukautta alue 9,6-82,5kuukautta), 68 potilasta (64,15%) oli elossa ja 38 potilasta (35.85%) oli kuollut. Tämä tutkimus tarkasteli ja hyväksynyt institutionaalisten Medical Ethics komitean Qilu sairaalan Shandong University. Kaikki osallistujat, jos niiden kirjallinen suostumus olla mukana tässä työssä.

immunohistokemia

immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin 4-pm paksu osissa parafinoidut kudoksia, ja värjäytyminen prosessi tiukasti suoritettiin streptavidiini-biotiini-peroksidaasi-kompleksin menetelmä. Jälkeen deparaffinisation ja nesteytys, leikkeet käsiteltiin 3% vetyperoksidilla endogeenisen peroksidaasin salpaamiseksi. Ei-spesifinen sitoutuminen estettiin normaalilla vuohen seerumilla 30 min ajan 37 ° C: ssa, sitten leikkeitä inkuboitiin anti-TROP2 (Santa Cruz, USA, 1:500 laimennus) tai anti-Ki-67 monoklonaalista vasta-ainetta (Dako, lostrup Tanska, 1:100 laimennos) yön yli 4 ° C: ssa. PBS-pesun jälkeen, leikkeitä inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-leimattua polymeeri-konjugoidulla anti-hiiri-vasta-ainetta (Beijing Zhong Shan Biotech Co Ltd, Peking, Kiina) 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Sitten leikkeet värjättiin 3,3-diaminobentsidiinitetrahydrokloridilla 5 min ja tumat vastavärjättiin hematoksyliinillä 3 min, ja sitten asennetaan neutraalilla balsamia. PBS: ää käytettiin korvaamaan vasta negatiivisena kontrollina.

arviointi ja kvantifiointi Immunovärjäys

immunovärjäyksen tuloksia arvioitiin kolme patologit jotka sokkoutettu kliinisiä tietoja potilaista. TROP2 ilmentyminen määritettiin läsnäolo kellanruskea kalvon värjäytyminen kasvainsolujen. Kukin näyte olisi arvioitava myös värjäytymisen intensiteettiä ja prosenttiosuus positiivisten kasvainsolujen peräti 1000 solua ja 5 HPF. Värjäytymisen intensiteetti pisteytettiin 0 (negatiivinen), 1 (heikko), 2 (kohtalainen) ja 3 (voimakas), kun taas positiivisten solujen prosenttiosuuden pisteytettiin 0 (0%), 1 (1-10%), 2 (11-50%) ja 3 (51-100%). Yleinen immunohistokemiallista värjäystä tulokset perustuivat intensiteetti pisteet × prosenttiyksikköä värjäytyminen pisteet seuraavasti: – (pisteet 0); + (Pisteet 1, 2, 3); ++ (Pisteet 4, 6); +++ (Pisteet 9) [10]. Ki-67, merkintöjä indeksi (LI) arvioitiin prosenttiosuutena solujen tumavärjäystä keskuudessa 1,000 invasiivisia tuumorisolujen satunnaisesti valitun, lopullinen pistemäärä Ki-67 ilmentyminen luokiteltu neljään ryhmään perustuen merkintöjä indeksin ja sijainti ja tuman värjäytymisen, kuten aiemmin on kuvattu [11]. Luokitus oli seuraava: – ( 10%, rajoitettu parabasal solukerroksissa); +, (10% 30%, rajoittuu alin kolmannes epiteelin); ++, (30 70% saavuttaen ylempi kolmannes epiteelin); +++, (70% tai enemmän epiteelisolujen, mukaan lukien koko paksuudeltaan nimenomainen ioni Ki-67).

Cell Culture

neljä ihmisen kohdunkaulan syöpäsolulinjasta CaSki, Siha, HeLa- ja C33A-solut hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), kasvatettiin Dulbeccon modifioitua Eaglen väliaineessa (DMEM, Gibco Inc., Carlsbad, CA, USA), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (Invitrogen, Carlsbad, CA , USA) ja 1% penisilliini-streptomysiiniä (Invitrogen), kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa ja 5% CO

2-ilmakehässä.

Immunofluoresenssivärjäys

Siha ja CaSki-soluja viljeltiin lasilevyille on 6-kuoppaiselle levylle ja inkuboitiin 24 tuntia. Solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja estää normaalin vuohen seerumin 30 min 37 ° C: ssa. Perusteellisen pesun jälkeen Tris-puskuroidulla suolaliuoksella (TBS), soluja inkuboitiin primääristen anti-TROP2 monoklonaalinen vasta-aine (Santa Cruz, USA, 1:500 laimennos) yön yli 4 ° C: ssa ja värjättiin FITC-konjugoidulla anti-hiiri-IgG (Beijing Zhongshan Biotech Co Ltd, Peking, Kiina, 1:200 laimennus) 30 minuuttia. Fluoresenssi-leimattu TROP2 havaittiin fluoresenssimikroskoopilla ja valokuva otettiin.

Solut transfektoinneilla

kaataa endogeenisen TROP2 ilme, kaksi paria siRNA sekvenssit kohdistaminen TROP2 suunniteltiin ja syntetisoitiin Genepharma Co., Ltd (Shanghai, Kiina). Nämä sekvenssit olivat: siRNA-1100, 5′-GCACGCUCAUCUAUUACCUTT-3 ’, 5′-AGGUAAUAGAUGAGCGUGCTT-3; siRNA-550, 5’-CCAAGUGUCUGCUGCUCAATT-3 ’, 5′-UUGAGCAGCAGACACUUGGTT-3’. Negatiivinen sekoituskoodin säätelysekvenssit olivat: 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ’, 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’. Tutkia vaikutuksia TROP2 täytäntöön ilmaisu, TROP2 isoformi ilmentävien plasmidia käytettiin HeLa ja C33A soluja. Ihmisen TROP2 täysimittainen cDNA monistettiin ja insertoitiin pcDNA 3.1-vektoriin (Genepharma Co., Ltd Shanghai, Kiina), jolloin saatiin pcDNA3.1-TROP2. Transfektioon, solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja sen odotetaan olevan 50%: n konfluenssiin seuraavana päivänä. Sen jälkeen, kun solun kiinnitys, TROP2 siRNA tai rekombinantti pcDNA3.1-TROP2 transfektoitiin soluihin Opti-MEM (Invitrogen) käyttäen Lipofectamime 2000 transfektioreagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden, viljelyalusta korvattiin sen jälkeen 6 tunnin inkubaation jälkeen. 48 tunnin kuluttua transfektiosta solut laskettiin ja saatettiin solunelinkykyisyysmääritys ja western blot -analyysillä. Transfektoimattomiin soluja ajateltiin olevan taustanäytteeseen, jotka on transfektoitu salattu siRNA tai pcDNA3.1 (tyhjä vektori) pidettiin negatiivisena kontrollina.

solunelinkykyisyysmääritys

Solujen elävyys määritettiin käyttäen solua laskenta kit-8 (CCK-8) mukaisesti valmistajan protokollan (Jingmei biotekniikka, Shanghai, Kiina). Lyhyesti, ohjaus ja transfektoidut solut ympättiin 5000 kuoppaa kohti 96-kuoppalevyille, kun sisplatiinia (Sigma, St. Louis, MO, USA) tai MEK estäjä U0126 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) osoitti ajankohtina, 10 ui CCK-8, lisättiin kuhunkin kaivoon, sitten inkuboitiin vielä 2 h 37 ° C: ssa. Optinen tiheys (OD) mitattiin käyttämällä mikrolevylukijaa (Bio-Rad Model 680, Richmond, CA, USA) 450 nm: n aallonpituudella. Inhiboiva pitoisuus on 50% proliferaation (IC50) Sisplatiinin laskettiin GraphPad Prism-ohjelmiston. Koe toistettiin kolme kertaa.

Apoptosis Assay

48 h transfektion jälkeen, solut kerättiin ja pestiin kahdesti kylmällä PBS: llä, suspendoitiin uudelleen 400 ul: anneksiini V-FITC sitovaa puskuria tiheys 1 x 10

6 solua /ml. Solut värjättiin 5 ui anneksiini V-FITC ja 10 ui propidiumjodidia (PI) mukaan Apoptosis Detection Kit (Jingmei biotekniikka, Shanghai, Kiina) ohjeet. Sitten suoritettiin virtaussytometrialla (BD, San Jose, CA, USA) havaitsemiseksi solun apoptoosin. Tämä koe suoritettiin kolme kertaa.

Cell Cycle Analysis

transfektoidut solut TROP2 siRNA tai pcDNA3.1-TROP2 kerättiin 48 h transfektion jälkeen, kerättiin trypsinisaatiolla ja vahvistettu 75% kylmässä etanolia 1 h ajan -20 ° C: ssa. Pesun jälkeen PBS: llä, soluja inkuboitiin 100 ul RNaasi A: lla (100 ug /ml) ja 400 ui propidiumjodidia vastaavasti 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Lopuksi, solusyklin mitattiin virtaussytometrialla käyttämällä FACScan-virtaussytometrillä (BD, San Jose, CA, USA) 488 nm: ssä, ja suhteellinen suhteet G1, S ja G2 faasit analysoitiin FlowJo 2,8 ohjelmisto. Koe suoritettiin kolmena kappaleena.

haavan paraneminen Pitoisuus

Yksikerroksisista haavoja määritystä käytettiin arvioimaan solujen vaeltamiseen kyky. -Soluja (5 x 10

5) ympättiin 6-kuoppalevyille, niitä inkuboitiin yli yön, sitten transfektoidaan TROP2 siRNA tai pcDNA3.1-TROP2. Saavuttamisen jälkeen 90% konfluenssiin, yksisolukerros oli naarmuuntunut steriilillä pipetillä kärjestä, kelluvat solut poistettiin PBS: llä ja viljeltiin uudelleen RPMI 1640-alustassa, joka sisälsi 1% FBS: ää. Valokuvat otettiin 0, 24 ja 48 tuntia pitkin kaapia rivi mikroskoopilla. Tulokset ilmaistaan ​​suhteellisena tyhjästä leveys, perustuen etäisyyden siirtynyt suhteessa alkuperäiseen naarmuuntunut etäisyyttä. Koe suoritettiin kolmena kappaleena.

Cell invaasiomääritys

invasiivisen kyky kohdunkaulan syövän solujen arvioitiin käyttäen 24-kuoppaista transwell kammio (cell invaasiomääritys kit), laskemalla solut läpäissyt läpi polykarbonaattikalvon (8 um huokoskoko) (Corning Costar, New York, USA). Polykarbonaatin pinnalle kunkin kammion peitettiin 20 ui matrigeelin (BD Biosciences, USA; 1:04 laimennus) luoda keinotekoinen tyvikalvon. -Soluja (1 x 10

5-solut) transfektoitiin TROP2 siRNA tai pcDNA3.1-TROP2 suspendoitiin 200 ul seerumittomassa 1640-elatusaineessa ja viljeltiin ylemmän transwell kammiossa 24 tuntia 37 ° C: ssa, alempi kammio oli täynnä 600 ui 1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Ei-tunkeutuvat soluihin kiinnitetty yläpintaan kalvo poistettiin steriilillä vanupuikolla, ja invaasio solujen lävistää kalvon värjättiin 0,1% kristallivioletilla 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Lukumäärät soluja laskettiin alla Leica mikroskoopin kahdeksassa satunnaisesti aloilla. Koe toistettiin kolme kertaa kullekin ryhmälle.

Hoechst 33258 Värjäys

24 h transfektion jälkeen, transfektoituja soluja ja ohjaus solut altistettiin eri sisplatiinin 48 tuntia. Sitten solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 15 minuutin ajan, mitä seurasi värjäys 100 ug /ml Hoechst 33258 (Beyotime, Shanghai, Kiina) huoneenlämpötilassa pimeässä 30 minuuttia, apoptoottisten ominaisuudet arvioitiin havainnoimalla kromatiinin kondensaation tai fragmentit fluoresenssimikroskoopilla, jossa viritysaallonpituudella 340-360 nm.

Western blot -analyysi

Vastaava määrä solun proteiinin näytteet ladattiin 10% natriumdodekyylisulfaattia polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS -sivu) ja siirrettiin PVDF-membraaneille käyttämällä Bio-Rad Sähkösiirtomenetelmiä järjestelmä. Sen jälkeen estetty 5% w /v rasvatonta kuivamaitoa 1 h, kalvoja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla spesifisiä TROP2 (Santa Cruz Biotechnolog, CA, USA; 1:1000 laimennus), E-kadheriinin, sykliini D1, sykliini E, CDK2, CDK4, Erk1 /2, p-Erk1 /2, P27, bcl-2 ja bax (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA; 1:1000 laimennus) yön yli 4 ° C: ssa. Sitten inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua kanin anti-hiiri-vasta-ainetta (Beijing Zhong Shan Biotech Co Ltd, Peking, Kiina, 1:4000 laimennos) 1 h, proteiininauhat tehtiin näkyviksi tehostetulla kemiluminesenssilla (Millipore) ja analysoitiin densitometrisesti käyttämällä määrä Yksi Image-ohjelmisto (Bio-Rad, USA). β-aktiini (Beijing Zhong Shan Biotech Co Ltd, Peking, Kiina, 1:1000 laimennus) käytettiin sisäisenä kontrollina Proteiinilisäyksen ja analyysi.

TILASTOANALYYSI

SPSS (SPSS Inc , Chicago, IL, USA) 18,0 ohjelmistoa käytettiin tehdä tilastollinen analyysi.

Quantitative data ilmaistiin keskiarvoina ± keskihajonta (SD). Erot ryhmien välillä arvioitiin parittomia Studentin t-testiä tai yksisuuntaista ANOVA. Pearson chi-neliö testi tai Fisherin testiä käytettiin analyysiin välillä asteen värjäys ja kliinisten parametrien, korrelaatio analyysi suoritettiin Spearmanin kertoimella. Kaplan-Meier -käyrät piirrettiin kuvaamaan selviytymisen tietoja log-rank-testi. Monimuuttuja-analyysi suoritettiin käyttäen Coxin suhteellisten riskien regressiomallia. P 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

TROP2 on Over-ilmaistaan ​​erittäin proliferatiivisen kohdunkaulasyövän

Yhteensä 160 näytettä määritettiin immunohistokemiallisesti, mukaan lukien 20 normaali kohdunkaulan kudoksissa, 34 CIN kudosten ja 106 kohdunkaulan syöpä kudoksiin. Demografiset tiedot ja kasvaimen ominaisuudet on kuvattu taulukossa 1. Yksikään potilaista ei ollut saanut sädehoitoa tai kemoterapiaa ennen leikkausta. Mukaan määriteltyjen perusteiden aikaisemmin, 55% normaalista kohdunkaulanäytettä osoitti huomaamaton TROP2 ilme, 40% ja 5% näytteistä näkyy heikko ja kohtalainen värjäytyminen, pääasiassa havaittu ectocervical levyepiteelillä (kuva 1A ja B). Kiehtovan ekspressio TROP2 vähitellen kasvanut CINI (50%) ja CINII (66,7%) ja CINIII (76,9%; kuvio 1C) (p = 0,037), mikä osoittaa, TROP2 ekspressio korreloi merkitsevästi kehittymistä ja etenemistä kohdunkaulan syöpä . Lisäksi voimakas kalvo värjäys TROP2 havaittiin enemmistö (88,7%) kaikista kohdunkaulan syövistä kun stromasoluja olivat säännöllisesti negatiivinen (kuvio 1D, E ja F). Tilastollinen analyysi osoitti, että TROP2 ekspressiotaso kohdunkaulansyövistä oli merkittävästi suurempi kuin normaalissa kohdunkaulan kudoksissa ja CIN kudoksissa (p 0,001).

A-B. Negatiivinen ja heikko TROP2 ilmentymistä normaaleissa kohdunkaulan kudoksissa. C. CIN III vahvojen TROP2 solukalvojen värjäytymistä (pisteet +++). D-E. Vahvat ja heikot TROP2 ilmaisun kohdunkaulan sqamous cell carcinoma (pisteet +++, +). F. Strong TROP2 ilmentymistä kohdunkaulan adenokarsinooma (pisteet +++). G-H. Ki-67 ilmentyminen CINIII ja kohdunkaulan syöpä (pisteet ++, +++). Suurennukset: × 200 (A, B, C, D, E) ja x 400 (F, G, H).

Ylimääräisenä tarkastamaan yhdistyksen välillä TROP2 ilmaisun ja syövän etenemiseen, me analysoitiin myös ilmaus Ki-67 samassa sarjaa kohdunkaula näytteistä immunohistokemia määrityksessä (kuvio 1G ja H). Ki-67 on osoittautunut yhteinen proliferatiivisen merkki ja käytetään arvioimaan monia pahanlaatuisten leesioiden syövistä. Tilastollinen analyysi osoitti, että oli merkittävä korrelaatio lisääntynyt TROP2 värjäys ja Ki67-positiivisten jakautuviin soluihin kohdunkaulan syövän yksilöt (p 0,001; taulukko 2), joka osoitti, että TROP2 oli yli-ilmaistu erittäin proliferatiivisen ihmisen kohdunkaulan syöpäsoluja.

korrelaatio TROP2 Expression and Clinical patologiset

kliininen merkitys suuri TROP2 yli-ilmentymisen potilailla, joilla on kohdunkaulan syöpä oli yhteenveto taulukossa 1. tulokset osoittivat, että TROP2 ekspressiotasot olivat merkittävästi erilaisia ​​ryhmien välillä suhteen histologiseen grade (p 0,001), lymfaattinen etäpesäke (p = 0,001), invasiivisia interstitiaalinen syvyys (p 0,001), FIGO vaihe (p 0,001) ja histologisia-alatyypin (p = 0,023). Kuitenkin, ei ollut merkittävää assosiaatiot TROP2 ilmaisun ja iän (p = 0,100), kasvaimen koko (p = 0,255).

korkea ilmentyminen TROP2 korreloi huonon ennusteen Kohdunkaulan syöpä

arvioidaan TROP2 ilmaisun ja kliinis-kliiniseen tulokseen potilaista, käytimme Kaplan -Meier analyysi ja log-rank testi sensuroitiin Eloonjääntitulokset. Kuten esitetty kuviossa 2, Kaplan-Meier selviytymisen käyrät osoittivat, että potilailla, joilla on positiivinen TROP2 ilme oli huonompi yleistä (OS) verrattuna ilman TROP2 lauseke (p 0,01), ilman taudin etenemistä (PFS) myös laskivat vähitellen kasvaessa TROP2 ilmaisun tulokset (p 0,01). By univariate analyysi huomasimme, että ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia kuten korkea FIGO vaiheissa, huonosti histologinen luokka, positiivinen imusuonten etäpesäke ja syvempi invasiivisia interstitiaalinen syvyys oli huomattavasti huonompi kliininen tulos (taulukko 3). Seuraavaksi ilmaus TROP2 sekä kaikki tilastollisesti merkitseviä muuttujia arvioitiin Yksiulotteisissa analyysit tutkittiin monimuuttuja Coxin regressiomallin analyysi. TROP2 proteiini yliekspressio yhdessä histologinen luokka ja imusuonten etäpesäke tunnistettiin olevan riippumaton ennustavan tekijöitä huono OS (p = 0,022, p = 0,023 ja p = 0,002, vastaavasti) ja PFS (p = 0,016, p = 0,04 ja p = 0,005 , vastaavasti).

TROP2 Edistää soluproliferaatiota kohdunkaulan syövän solut

Koska todisteita siitä, että TROP2 kohonnut ilmentyminen tiiviisti kasvaimen aggressiivisuus ja huono kliininen ennuste, me edelleen tutki toiminnallinen seuraukset TROP2 ilmaisun kohdunkaulan syövän solulinjoissa. Ensinnäkin, tutkimme TROP2 ilmentymistä neljä kohdunkaulan syövän solulinjat Siha, HeLa- ja CaSki ja C33A Western blotilla (kuvio 3A). Yhdenmukainen Immunohistokemian määrityksen TROP2 proteiinia ilmeisesti havaittiin kaikissa solulinjoissa noin 36 kDa, Siha ja CaSki solut osoittivat suhteellisesti suurempi TROP2 ilmaisu, kun taas sen ilme oli heikkoa HeLa ja C33A soluja. Immunofluoresenssilla Analyysissä havaittiin, että oli kerros vihreä fluoresoiva värjäytyminen cytomembrane ja Siha ja CaSki-soluja (kuvio 3B). Edelleen tutkia biologisten toimintojen TROP2 tunnistimme ja validoitu kaksi itsenäistä ja ei-päällekkäisiä siRNA-sekvenssit heikentävistä endogeenisen TROP2 ilmentymistä Siha ja CaSki-solujen, HeLa ja C33A-solut transfektoitiin pcDNA3.1-TROP2 parantaa TROP2 ilmentymistä. Solut, jotka on transfektoitu salattu siRNA tai pcDNA3.1 pidettiin negatiivisena kontrollina, ei-transfektoituja soluja käytettiin nollakoe. Tulosten mukaan Western blot 48 h transfektion jälkeen (kuvio 3C), proteiini taso TROP2 näkyvissä merkittävää vaihtelua, kaksi siRNA sekvenssit kaikki aiheuttavat vähemmän TROP2 ilmentyminen 50% -80% ja Siha ja CaSki soluja, ja pcDNA3.1-TROP2 kykeni tuottamaan vähintään 30% up-säätely TROP2 ilmentymisen HeLa- ja C33A soluja.

. Ilmentyminen TROP2 havaittiin neljä kohdunkaulan syövän solulinjojen western blot, Siha ja CaSki solut osoittivat suurempi ekspressio verrattuna HeLa ja C33A-solut, β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. B. immunofluoresenssimäärityksellä osoitti oli kerros vihreä fluoresoiva värjäytymistä cytomembrane vuonna Siha ja CaSki soluja. C. Western blot-analyysi vahvistaa, että siRNA-välitteisen knockdovvn ja pcDNA3.1-TROP2 välitteisen yliekspressio TROP2 eri kohdunkaulan syövän solulinjoista. D. Solut transfektoitiin TROP2 siRNA tai pcDNA3.1-TROP2, elinkelpoisuutta arvioitiin käyttäen CCK-8 määrityksessä viisi ajankohtina (0, 1, 2, 3, 4 päivää, vastaavasti). 2 päivää transfektion jälkeen, knockdovvn TROP2 esiin merkittävän eston vaikutus soluproliferaation Siha ja CaSki-solujen, kun taas pakotettu ilmentymä TROP2 lisääntynyt solujen elinkelpoisuus HeLa ja C33A-solut. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta, * p 0,05, ** p 0,01.

CCK-8-määritystä käytetään määrittämään vaikutuksen TROP2 ilmentymisen soluproliferaatioon. Tuloksemme paljasti, että knockdovvn TROP2 herätti selvästi esto vaikutus leviämisen jälkeen transfektion Siha ja CaSki solut (p 0,05), kun taas solujen elinkelpoisuutta pcDNA3.1-TROP2 transfektio ryhmä paransi merkitsevästi (p 0,05; kuva 3D). Yhdistettynä immunohistokemia tulokset osoittivat, että TROP2 oli hyvin ilmaistu Ki67 positiivisia lisääntyvien solujen, nämä tiedot osoittivat, että ilmentyminen TROP2 lisäsi solujen elinkelpoisuuden kohdunkaulan syöpäsoluja.

vaikutus TROP2 Ilmaisu solukuoleman ja Cell Cycle

on osoitettu, että apoptoosin on huomattava merkitys etenemisessä ja kasvainten kehittymisen, olemme edelleen tutkitaan, onko solujen lisääntymisen inhibitio johtuu apoptoosin aiheuttaman toiminnon. Virtaussytometria käytettiin määrittämään solujen apoptoosin 48 h transfektion jälkeen. Tulokset osoittivat, että solun koko apoptoosin hinnat ja TROP2 siRNA transfektion ryhmä (siRNA-1100 ja siRNA-550) oli merkitsevästi korkeampi verrattuna negatiiviseen kontrolliin ryhmän sekä Siha ja CaSki-solujen (p 0,05, kuvio 4A). Samaan aikaan taipumus varhaisen apoptoosin ja myöhäinen solujen apoptoosin hinnat olivat johdonmukaisia ​​koko solun apoptoosin hinnat. Päinvastoin, täytäntöön ilmentyminen TROP2 esti merkitsevästi solujen apoptoosin, osuudet positiivisten solujen anneksiini V ja propidiumjodidia ilmeisesti väheni HeLa ja C33A-solut, käsittelemättömiin soluihin verrattuna ja pcDNA3.1 transfektoidut solut (P 0,01, vastaavasti; kuvio 4B). Tutkimaan edelleen taustalla molekyylitason mekanismeja, joilla TROP2 Knockdown indusoi apoptoosin, tutkimme ilmaisuja Bcl-2: n ja Bax Western blotilla (kuvio 4C). Tulokset osoittivat, että ilmentyminen bcl-2-proteiinin on ilmeisesti vähentynyt, kun taas bax oli merkittävästi parannettu sekä Siha ja CaSki transfektoituja soluja verrattuna kontrollisoluihin (salattu siRNA). Sen sijaan, HeLa- ja C33A transfektoitu pcDNA3. 1-TROP2 näytteillä päinvastainen vaikutus (kuvio 4D). Nämä havainnot osoittivat, että anti-apoptoottinen vaikutus TROP2 saavutetaan suoraan säätelemällä Bcl-2: n ilmentymisen ja inhiboimaan Bax aktivaation.

. Down-regulation TROP2 indusoi solujen apoptoosin Siha ja CaSki soluja. Solut kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen, minkä jälkeen apoptoosimäärityksessä käyttämällä anneksiini V-FITC apoptoosin havaitsemiseen kit. Solut oikeassa alemman ja ylemmän neljännesten ovat pitävät aikaisin ja myöhään apoptoosin vastaavasti vasempaan olkavarteen neljännesten pidetään kuolleita soluja. Tulokset analysoitiin FlowJo ohjelmisto. B. pakotettu ilmentymä TROP2 esti merkitsevästi solujen apoptoosin C. Western blot-analyysi osoitti, että down-regulation of TROP2 vähentää ilmentymistä bcl-2 ja lisääntynyt ilmentyminen bax on Siha ja CaSki-soluissa. D. pakotettu ilmentymä TROP2 HeLa ja C33A-solut lisäsi ekspressiota bcl-2 ja vähentää ilmentymistä bax. Nämä tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta, * p 0,05, ** P 0,01.

Jotta saataisiin kattavampi käsitys TROP2 geenien toiminnan, me tutki tarkemmin vaikutukset TROP2 ilme solusyklin virtaussytometrialla analyysi. Kuten on esitetty kuviossa 5A, tulokset osoittivat, että ehtyminen TROP2 ilmaisun tuloksia kertyminen solujen G1 vaiheeseen ja vähentää solujen S-vaiheessa 48 tunnin transfektion jälkeen (p 0,05). Sen sijaan, täytäntöön ilmentyminen TROP2 HeLa ja C33A-solut osoittivat merkittävää vähenemistä soluja G1 alkuvaiheessa, mutta kasvu solujen S-vaiheeseen ja G2-M-vaiheen (p 0,05; kuvio 5B). Tulokset osoittivat, että TROP2 kykeni parantamaan kohdunkaulan syöpäsolujen lisääntymistä edistämällä G1-S- ja G2-M siirtymiä.

. Knockdovvn TROP2 aiheuttama G1 pidätys Siha ja CaSki soluja. Siha ja CaSki solut transfektoitiin TROP2 siRNA tai salattu siRNA. 48-säätely TROP2 aiheuttama solukierron pysähtymisen G1 vaiheessa. B. yliekspressio TROP2 edistettävä G1-S- ja G2-M siirtymät HeLa ja C33A soluja. C, D. TROP2 säännelty solusyklin tekijöiden kautta ERK1 /2 signalointireitille kohdunkaulan syöpäsoluja. Siha ja CaSki soluja (C) transfektoitiin TROP2 siRNA tai salattu siRNA.